A gyógyszer által kiváltott és postnatalis hypothyreosis károsítja a diacilglicerin felhalmozódását a májban és a májsejtek plazmamembránjában

Oksana A Kraszilnikova

1 Kharkovi Nemzeti Egyetem, Biológiai Intézet, 4, Svobody pl., Kharkov, 61077, Ukrajna

Nataliya S Kavok

1 Harkovi Nemzeti Egyetem, Biológiai Intézet, 4, Svobody pl., Kharkov, 61077, Ukrajna

Nataliya A Babenko

1 Harkovi Nemzeti Egyetem, Biológiai Intézet, 4, Svobody pl., Kharkov, 61077, Ukrajna

Absztrakt

Háttér

A pajzsmirigyhormonok a jelátvitel jól ismert modulátorai. Meghatározták a hiper- és hipo-pajzsmirigy-túlműködés hatását a diacilglicerin/protein-kináz C (DAG/PKC) jelátvitelre kardiomiocitákban. A trijód-tironin (T3) kimutatták, hogy megakadályozza a PKC α1-adrenoreceptor által közvetített aktiválódását, de nem változtatja meg az enzim és a máj metabolizmusának forbol-éterek általi stimulálását. Felvetődött, hogy az endogén DAG emelkedése az öregedő vagy hipotireoid sejtekben megváltoztatja a sejtek PKC-függő válaszát a phorbol-észterekre és a hormonokra. Jelen tanulmányban megvizsgálták a DAG képződését és a PKC aktiválódását különböző pajzsmirigy státuszú patkányok májsejtjeiben.

Eredmények

Következtetések

A fenti adatok arra utalnak, hogy a pajzsmirigyhormonok a DAG szintjének fontos fiziológiai modulátorai a patkány máj- és sejtplazmamembránjában. A pajzsmirigy életkor és gyógyszer által kiváltott rendellenességei a glicerin-szintézis jelentős csökkenését eredményezték, ami elősegítheti a DAG felhalmozódását a májban.

Háttér

Számos vizsgálat kimutatta a pajzsmirigyhormonok újszerű szerepét a jelátvitel modulátoraként. A PKC kritikus jelentőségű abban a mechanizmusban, amely révén a pajzsmirigyhormonok gyorsan előidézik a mitogénnel aktivált protein-kináz foszforilációját és nukleáris transzlokációját, és ezután potencírozzák az IFNγ antivirális és immunmoduláló hatását a tenyésztett sejtekben [14], és szabályozzák a jelátviteli foszfolipidek (PL) cseréjét a hepatociták [15,16]. Megállapították, hogy az L-T4 gyorsan indukálta a kétfázisú DAG akkumulációt és a PKC aktivációt a májszeletekben és az izolált hepatocitákban [17]. Az L-T4 hatása a PLC, -D, PKC és DAG felhalmozódására túl gyors volt: másodpercekről néhány percre. A hypothyreos patkányok májának perfúziója L-T4-tartalmú oldattal 10 perc alatt növelte a máj DAG-tartalmát [18]. Azonban a hypothyreosis hatását a máj DAG-szintjére még nem határozták meg.

Jelen tanulmányunkban megvizsgáltuk a máj és az izolált membránok DAG szintjét és PKC aktivitását tartós pajzsmirigyhormon stimuláció alatt és a szervezet különböző pajzsmirigy állapotában. A pajzsmirigy működésének romlása öregedéssel vagy a merkazolil hatása alatt csökkentette a máj PL és TAG szintézisét, és növelte a DAG szintet a májszeletekben és az izolált májsejtek plazmahártyáiban. A hypothyreosis jelentősen csökkentette a PKC aktivitását. Az L-T4 intakt vagy merkazolillal kezelt patkányoknak történő beadása csökkentette a DAG-szintet, és fokozta a májban a PL- és a TAG-szintézist. Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy a tiroxin kulcsfontosságú a DAG csökkentésében azáltal, hogy tartós hormonhatás alatt PL-vé és TAG-vá alakítja őket.

Eredmények és vita

Jelen munka célja a pajzsmirigy funkcionális állapotának a máj és a plazma membránok DAG szintjére gyakorolt hatásának tisztázása. A pajzsmirigyhormonok szerepének meghatározásához a máj DAG-szintjének szabályozásában összehasonlították az eutireoid, merkazolil- és merkazolil + L-T4-kezelt patkányokat vagy ép állatokat az L-T4 injekció után.

A patkányok vérszérumában a pajzsmirigyhormon-tartalom vizsgálatának eredményeit az 1. táblázat tartalmazza. 1. Kimutatták, hogy a tiroxin és a trijódtironin szintje szignifikánsan alacsonyabb a 720 napos ép patkányok és a merkazolillal kezelt patkányok vérszérumában a megfelelő kontrollokhoz képest. A kapott adatok összhangban vannak az életkor és a gyógyszer által kiváltott pajzsmirigy működési zavarok korábbi megfigyeléseivel [19-21].

Asztal 1

Vérszérum tiroxin és trijódtironin tartalma különböző korú és pajzsmirigy státuszú patkányokban

Állatok	Kor
90 napos		720 napos
T4	T3	T4	T3
Ellenőrzés	88,0 ± 6,9	1,5 ± 0,07	58,2 ± 3,2 *	0,82 ± 0,0 *
Mercazolillal kezelt	48,6 ± 0,9 **	0,3 ± 0,08 **	20,6 ± 4,26 **	0
Tiroxinnal kezelt	410 ± 51,0 ***	5,86 ± 0,48 ***	270 ± 10,0 ***	3,9 ± 0,09 ***

A vérszérum T4- és T3-tartalmát radioimmunassay-készlettel határoztuk meg. A pajzsmirigyhormonok mennyisége a szérumban nmol/liter volt. A patkányok merkazolillal történő kezelését az "Anyagok és módszerek" részben leírtak szerint hajtottuk végre. A normál patkányoknak hetente háromszor T4-et (200 μg/100 g testtömeg) injektáltunk. Az utolsó hormoninjekciót 48 órával a megölés előtt hajtották végre. Az eredmények átlag ± S.E. 8 egyedi kísérletből. Itt és a 2. táblázatban 2 és az ábrákon 1, 2, 3, 3, 4 4, 5 5 ábrákon egy kísérlet egyenértékű a szérum- vagy májmintában vizsgált paraméterek mérésével egyetlen állat. * p ** p *** p 1A, 1B) és a [14 C] DAG (ábra (2.A, 2A., 3. ábra) 3) felhalmozódása idős patkányok nyugalmi máj- és sejtplazmamembránjában egyaránt. A szenzens izolált [14 C] olajsavval megjelölt hepatociták magasabb DAG-alapszintet tartalmaznak: 7359 ± 746, szemben a felnőtt állatok sejtjeiben található 1171 ± 228 cpm/107 sejt (P ≤ 0,05, n = 5) értékkel. A merkazolil a DAG tömegének további növekedéséhez vezet a különböző korú állatok májában (1A ábra 1A ábra) és izolált plazmamembránjaiban (1B ábra 1B ábra). Az L-T4-vel kezelt patkányokban a máj (D ábra (1A ábra) 1A) és az izolált membránok (1B ábra) 1B) és a [14C] DAG májban ( Ábra (2B ábra) 2B) különböző korú patkányokról. A T4 azonban nem növeli a szabad 14C-zsírsav (FFA) felhalmozódását a májban (2. ábra (2C ábra). 2C). Így kizárható a DAG lipáz hatása a máj DAG szintjének hormonokkal kapcsolatos csökkenésére. Megfigyeltük az újonnan szintetizált [14 C] DAG kor- és merkazolil-növekedését a májszeletekben (3. ábra. 3. ábra). Az L-T4 beadása merkazolillal kezelt patkányoknak csökkentette a [14C] DAG felhalmozódását a májszeletekben. A Mercazolil és az L-T4 csökkentette a májban a [14 C] DAG szint életkori sajátosságait. Ez utóbbi megfigyelés arra utal, hogy az idős korban megfigyelt szervezet pajzsmirigy-állapotának változásai hozzájárulhatnak a máj DAG-szintjének életkorral összefüggő változásaihoz.

2. táblázat

Az 1,2-diacilglicerin és a foszfolipid osztályok 14 C/3 H aránya különböző pajzsmirigy státuszú patkányok májszeleteiben

Lipid órák	Állatok
Ellenőrzés	Mercazolillal kezelt	Tiroxinnal kezelt
DAG	2,33 ± 0,19	4,33 ± 0,56	3,17 ± 0,38
PC	1,24 ± 0,16	0,94 ± 0,16	0,93 ± 0,18
PE	0,69 ± 0,20	1,18 ± 0,15	0,44 ± 0,09
PI	1,32 ± 0,17	0,90 ± 0,09	0,44 ± 0,09
CSIPOG	0,52 ± 0,15	0,39 ± 0,03	0,50 ± 0,12
PIP2	0,32 ± 0,04	0,44 ± 0,04	0,33 ± 0,07

A 90 napos patkányok májszeleteit előzetesen [14 C] oleinsav és [3H] arachidonsavakkal és lipidekkel jelöltük, amelyeket az "Anyagok és módszerek" részben leírtak szerint extraháltunk és elválasztottunk. Az adatok átlag ± S.E. három egyedi kísérletből.

Újonnan szintetizált [14 C] -PC és [14 C] -TAG különböző korú és pajzsmirigy állapotú patkányok májszeleteiben. A Mercazolilt az "Anyagok és módszerek" részben leírtak szerint injektáltuk az állatokhoz. T4-et (10 μg/100 g tömeg) injektáltunk a merkazolillal kezelt patkányokba 48 órával a leölés előtt. A kontroll patkányok ugyanolyan térfogatú 0,9% NaCl-ot kaptak. A májszeleteket 10% magzati borjúszérumot, 100 egység/liter sztreptomicint, 100 egység/liter penicillint, 13 mg/ml gentamicint és 2,5 μCi/ml [14 C] palmitinsavat tartalmazó Eagle táptalajban 1 órán át inkubáljuk. 95% O2/5% CO2 atmoszféra 37 ° C-on. A lipideket kivontuk és elemeztük az "Anyagok és módszerek" részben leírtak szerint. Az eredmények átlag ± S.E. hat egyedi kísérletből. * P ** P *** P (5. ábra). 5.) A PKC szubcelluláris eloszlásában csak csekély különbségek voltak a két patkánycsoport májsejtjeiben. A merkazolillal kezelt állatok májában a teljes PKC-aktivitás azonban kisebb volt, mint a kontroll patkányokban. Az exogén DAG hozzáadása teljesen megszüntette a különbségeket az eu- hipo- és hipertireoid patkányok májsejtjeiben a PKC aktivitás között [39]. Ismeretes, hogy a phorbol-észterekkel való hosszan tartó inkubálás kimeríti a PKC α és β sejteket [áttekintésért lásd [40]]. Ezenkívül bizonyítékokat nyertek a PKC fokozott lebomlására a phorbol-éterekkel és a DAG-nal való hosszan tartó sejt inkubálás után. Jelen tanulmány eredményei arra utalnak, hogy a hipotireoid állatok májsejtjeiben a nem megfelelő DAG felhalmozódás hozzájárul a PKC kimerüléséhez. Nem zárható ki azonban a PKC izozim expressziójának csökkenése. Ennek a kérdésnek a tisztázása érdekében további munkára van szükség.

A merkazolil hatása a májsejtek PKC aktivitására. A Mercazolilt injektáltuk az állatokhoz, és a PKC aktivitást az "Anyagok és módszerek" részben leírtak szerint határoztuk meg. Az eredmények átlag ± S.E. négy egyedi kísérletből. * P 2+ ionofor> A23187 [41]. Korábbi adatok azt mutatták, hogy csak a forbol 12-mirisztát 13-acetát, de nem inaktív analógja, a forbol 12-mirisztát 13-acetát 4-O-metil-éter, az aktivált linolsav beépülése a PL-be [15] és a foszfoinozidid szintézise de novo májszeletekben és izolált hepatociták [16]. PKC-függő szignalizációt jeleztek intakt, 90 napos fiatal patkányok plazmamembránjaiban. Nem találtak hatást 720 napos merkazolillal kezelt patkányok májából izolált plazmamembránokban. Ezek a megállapítások azt sugallják, hogy a hipotireoid patkányok sejtjeiben az agonistára adott válasz deszenzitizálása a szervezet ilyen kóros állapotában a PKC lefelé történő szabályozástól függ.

Következtetések

Összefoglalva, a jelen tanulmány eredményei a pajzsmirigyhormont jelzik a patkány máj DAG szintjének potenciálisan fontos fiziológiai modulátoraként. Korábbi munkánkkal [17] ellentétben, amikor a tiroxin (fiziológiás koncentrációban) kimutatta, hogy PLC/PLD aktivációt és rövid ideig tartó DAG felhalmozódást indukál a májsejtekben, kimutattuk a DAG szint szembetűnő csökkenését patkányoknál alkalmazott hormon fiziológiás dózisai mellett. A vérszérum pajzsmirigyhormonszintjének életkor- és merkazolilfüggő csökkenése egybeesik a máj és a májsejtek plazmamembránjainak DAG-tartalmának emelkedésével. Ezzel szemben a szervezet hipotireoid státusában a PL és a TAG szintézise csökken a májban. A glicerolipid szintézis csökkenését és a DAG szint emelkedését korrigálhatjuk hypothyreosis patkányok tiroxin kezelésével. Tehát a DAG-tartalom pajzsmirigyhormon-függő változásai valószínűleg összefüggenek a glicerin-lipid szintézissel. A hipotireoid máj rendkívül magas bazális DAG-szintje egybeesik a PKC aktivitás csökkenésével mind a citoszolban, mind a májsejtek membránjában. A hipotireoid májban a DAG metabolizmusának stabil változásai a májsejtek agonista reakciókészségének zavaraihoz vezetnek.

Anyagok és metódusok

Anyagok

[14C] oleinsav (58 mCi/mmol) és [3H] arachidonsav (60 Ci/mmol) - Amersham Corp., [14C] palmitinsav (58 mCi/mmol), [γ-32P] ATP (1000 Ci/mmol) és [14C] CH3COOH (25 mCi/mmol) - BPO izotóp (Oroszország); DEAE-52-cellulóz Whatman-tól (Anglia); szilikagél Woelm-tól (Németország). A foszfatidil-serint az ökör agyából izoláltuk; más lipid standardokat és H1 hisztont a Sigma-tól (USA) szereztünk be. A T4 és a merkazolil (1-metil, 2-merkaptoimidozol) a Zdorov'e Trudyaschikhsya (Kharkov, Ukrajna) cégtől származik. A T4 és T3 radioimmunassay-készletek Minszkből (Fehéroroszország) voltak. Egyéb alkalmazott vegyi anyagok kémiailag tiszta minőségűek voltak.

Állatok

Felnőtt 90 és 720 napos hím Wistar patkányokat, amelyek szabadon hozzáférhettek az élelemhez és a vízhez, és 24 ° C-on tartották 12 órás fény/12 órás sötétség ciklus alatt. A Mercazolilt intraperitoneálisan (1 mg/100 g tömeg) 0,9% NaCl-ban injektáltuk a kísérleti állatoknak minden nap 16 napos kísérlet során. Bizonyos esetekben a merkazolillal kezelt patkányokat 48 órával a leölés előtt intraperitoneálisan injektálták T4-gyel (10 μg/100 g tömeg). Ezenkívül T4-et (200 μg/100 g súly) injektáltak a normál patkányoknak 15, 30 és 60 perccel a leölés előtt, vagy hetente háromszor, ebben az esetben az utolsó hormoninjekciót 48 órával a leölés előtt hajtották végre. A kontroll patkányok ugyanolyan térfogatú 0,9% NaCl-ot kaptak. Az állatokat a kísérlet előtt egy éjszakán át éheztettük. A patkányok pajzsmirigy-állapotát a vérszérumban a T4 és T3 radioimmunológiai meghatározásával követtük nyomon.

Kísérletek májszeletekkel

Az 1 mCi [14C] CH3COOH-t intraperitoneálisan injektáltuk patkányoknak 30 percenként négyszer, 2 órán át [42]. A májat 0,9% NaCl-val perfundáltuk, majd eltávolítottuk és Krebs-Henseleit pufferben (pH 7,4) mostuk, amely 2 mM CaCl2-t és 0,2% BSA-t tartalmazott. Előjelölt májszeleteket használtunk a [14C] -DAG és [14C] -FFA elemzéshez. Ezenkívül a májszeleteket 10% magzati borjúszérumot, 100 egység/liter sztreptomicint, 100 egység/liter penicillint, 13 mg/ml gentamicint és 2,5 μCi/ml [14 C] olajsavat és 2,5% magzati borjúszérumot tartalmazó Eagle táptalajban inkubálva jelöltük. μCi/ml [3 H] arachidonsav vagy 2,5 μCi/ml [14 C] palmitinsav önmagában 1 órán át 95% O2/5% CO2 atmoszférában, 37 ° C-on. A lipideket kivontuk és elemeztük az alábbiakban leírtak szerint.

Sejtszuszpenziós kísérletek

Hepatocitákat izoláltak a 90 és 720 napos hím Wistar patkányokból, amelyek szabadon hozzáférhettek az élelemhez és a vízhez, és 24 ° C-on tartották 12 órás fény/12 órás sötétség ciklusban a [41 ]. A májsejtek előkészítését 9:00 és 10:00 óra között kezdtük meg. A sejteket (107/ml) 10% magzati borjúszérumot, 100 egység/liter sztreptomicint, 100 egység/liter penicillint, 13 mg/ml Eagle táptalajban inkubálva jelöltük. ml gentamicin és 2,5 μCi/ml [14 C] olajsav 3 órán át, 95% O2/5% CO2 atmoszférában, 37 ° C-on. A lipidek extrahálása előtt a sejteket kétszer mossuk Krebs-Henseleit pufferrel (pH = 7,4), amely 2 mM CaCl2-t, 25 mM HEPES-t és 0,1% BSA-t tartalmaz. A lipideket kivontuk és elemeztük az alábbiakban leírtak szerint.

A májsejtek plazmamembránjainak izolálása

A plazmamembránokat differenciál centrifugálással állítottuk elő különböző koncentrációjú szacharózon keresztül, és specifikus marker enzimeikkel jellemeztük a [43] -ben leírtak szerint. A lipideket kivontuk és elemeztük az alábbiakban leírtak szerint.

A lipidek extrahálása és elválasztása

A lipideket Folch és mtsai. [44] és foszfoinozididok a [45] -ben leírtak szerint. A kloroformos fázist összegyűjtjük és N2 atmoszférában 37 ° C-on szárítjuk. A lipideket újra feloldjuk kloroform/metanol (1: 2, v/v) elegyben, és TLC lemezekre visszük. A DAG és az FFA izolálásához az oldószer rendszert használtuk: hexán/dietil-éter/ecetsav (80: 20: 2, v/v); PC és PE elválasztáshoz - kloroform/metanol/ecetsav/víz (25: 15: 4: 2, v/v), PI, PIP és PIP2 esetében - kloroform/metanol/NH4OH (50:40:10, v/v) ). Megfelelő standardokat alkalmaztunk minden lemezen a mennyiségi meghatározáshoz. A [14C/3H] lipideket tartalmazó gélfoltokat összekapartuk és szcintillációs fiolákba helyeztük. A radioaktivitást szcintillációs számlálóval mértük.

Protein-kináz C enzim vizsgálat

A protein kináz C aktivitását a citoszolban és a májsejtek nyers membránfrakciójában DEAE-cellulózon végzett kromatográfiás részleges enzimtisztítás után határoztuk meg [46]. A protein-kináz C aktivitását úgy határoztuk meg, hogy a 32P-t [y-32P] ATP-ből H1 hisztonba vittük át foszfatidil-szerin és Ca 2+ jelenlétében (0,2 mM). Mivel a hiszton gyenge szubsztrátja a PKC kalcium-érzéketlen izoformáinak, a kimutatott PKC túlnyomó izoformái a cPKC és az aPKC voltak. Az enzimaktivitást pmol foszfátban fejeztük ki, amely percenként a [y-32P] ATP-ből H1 hisztonba került. A fehérjetartalmat Bradford módszerrel határoztuk meg [47].

Rövidítések

T4 - tiroxin, T3 - trijód-tironin, PKC - protein-kináz C, PI - foszfatidil-inozit-foszfát, PIP - foszfatidil-inozitol-4-foszfát, PIP2 - foszfatidil-inozitol-4,5-biszfoszfát, PLC - foszfolipáz C, DAG - diacil-glicerin, FAG-mentes - triacil-glicerin, PL - foszfolipidek, PAP - foszfatidinsav-foszfatáz, PC - foszfatidilkolin, PE - foszfatidil-etanol-amin, TPA - 12-O-tetradekanoil-forbol-13-acetát.