A hasmenés etiológiája, a táplálkozási eredmények és az új bélbiomarkerek a tanzániai csecsemőknél: előzetes tanulmány

Absztrakt

Célkitűzés

A hasmenéses megbetegedések a morbiditás és a halálozás egyik vezető okát jelentik világszerte, de a hasmenés etiológiája és a táplálkozási kimenetelhez való viszonya erőforrás-korlátozott körülmények között kevéssé meghatározott. Arra törekedtünk, hogy meghatározzuk a közösségben szerzett hasmenés etiológiáját a tanzániai csecsemőknél, és hogy értékeljük az összefüggést az antropometriával és az új bélbiomarkerekkel.

Mód

Tanzániában cink- és/vagy multivitamin-kiegészítéssel végzett kísérlet során csecsemők kényelmi mintáját választották. Az alanyokat 6 hetes korban vonták be, és 18 hónapig követték őket. A székletmintákat akut hasmenésben szenvedő gyermekektől vették. Egy új, PCR-alapú TaqMan tömböt használtunk 15 enteropatogén széklet szűrésére. Az alanyok egy részénél mértük a szérum gasztrointesztinális biomarkereket.

Eredmények

123 hasmenéses alanyot vontak be. Az átlagos ± SD életkor a székletmintán 12,4 ± 3,9 hónap volt. Harmincöt enteropatogént azonosítottak 34 (27,6%) alanyban: 11 rotavírus, 9 Cryptosporidium spp, 7 Shigella spp, 3 Campylobacter jejuni/coli, 3 ST-enterotoxigén E. coli és 2 enteropatogén E. coli. Azok az alanyok, akiknek bármilyen azonosított enteropatogénje volt, szignifikánsan alacsonyabb súly-hosszúság z-pontszámmal rendelkeztek (−0,55 ± 1,10 vs. 0,03 ± 1,30, p = 0,03) a végleges klinikai látogatáson, mint az azonosított kórokozóval nem rendelkezők esetében. A 123 alany közül ötvennek (40,7%) elemezték a szérumot az LPS és a flagellin elleni antitestekre. Azoknál az alanyoknál, akiknél bármilyen azonosított enteropatogén volt, alacsonyabb volt az LPS (0,75 ± 0,27 vs. 1,13 ± 0,77, p = 0,01) és a flagellin (0,52 ± 0,16 vs. 0,73 ± 0,47, p = 0,02) antitestek, szemben az azonosított kórokozóval nem rendelkező antitestekkel.

Következtetés

Ez a kvantitatív PCR-módszer lehetővé teszi azon enteropatogének azonosítását, amelyek a gyermekeket nagyobb mértékben veszélyeztetik a szuboptimális növekedés szempontjából. Az IgA anti-LPS és a flagellin antitestek ígéretesnek bizonyulnak, mint feltörekvő bélbiomarkerek.

Bevezetés

A hasmenés továbbra is a gyermekek morbiditásának és halálozásának egyik vezető oka világszerte. 2011-ben becslések szerint 700 000 gyermek halálát okozta hasmenés, e halálozások 72% -a két évesnél fiatalabb gyermekeknél következett be (1). A hasmenés és a táplálkozási állapot szorosan összefügg egymással, mivel az alultápláltság növeli a hajlamot a hasmenést okozó fertőzésekre (2), a gyermekkori hasmenés pedig hajlamos a növekedés megingására. Becslések szerint a hasmenés minden egyes epizódja 2 éves kor előtt 5% -kal növeli a gyermek elakadásának kockázatát (3). A hasmenést és az alultápláltságot összekötő kóros mechanizmusok összetettek, de valószínűleg az immunfunkció megváltozásával, a bél áteresztőképességének növekedésével, a tápanyagok felszívódásának romlásával és többszörös enteropatogénekkel való ismételt expozícióval járnak (4).

A hasmenéses morbiditás csökkentésének elengedhetetlen lépése a kauzális fertőző kórokozók azonosítása, de a diagnózis hagyományos módszerei, beleértve a baktériumtenyésztést, a székletmikroszkópiát és az antigénalapú vizsgálatokat, rossz érzékenységűek (5, 6). A hasmenést okozó enteropatogének kimutatására nemrégiben újabb polimeráz láncreakció (PCR) alapú módszereket dolgoztak ki (7), amelyek azonban olyan kórokozókat fedezhetnek fel, amelyek nem okoznak hasmenés klinikai tüneteit. Például egy longitudinális vizsgálatban, amely a hasmenés mintáit hasonlította össze a hasmenés előtti egyeztetett kontrollokkal, kimutatták, hogy a PCR székletanalízis csak akkor korrelál a rotavírus, az asztrovírus és a Shigella/enteroinvazív Escherichia coli okozta hasmenéssel (8). Hasonlóképpen, enteropatogének vizsgálata hasmenéses esetekben és nem hasmenéses kontrollokban magas kimutatási arányt mutatott még tünetmentes kontrollokban is; a specifitás javult a kórokozó mennyiségének felmérésekor (9). Ilyen módon a patogénterhelés kiszámítása és értelmezése kritikus fontosságú e PCR-módszerek hasznossága szempontjából.

Erőforrás-korlátozott körülmények között a hasmenést okozó enteropatogéneket leggyakrabban akut/tartósan súlyos hasmenésben szenvedő kórházi gyermekeknél írták le (10, 11). A tanzániai Dar es Salaamban, 5 éven aluli kórházi gyermekeknél a betegek 22,9% -ánál (12) standard bakteriológiai tenyészettel találtak hasmenést okozó E. colit (13). Tanzániában azonban a gyakoribb, ambuláns hasmenés etiológiája továbbra sem ismert. Megpróbáltuk meghatározni a közösség által szerzett hasmenés etiológiáját tanzániai csecsemőknél és kisgyermekeknél, és feltételeztük, hogy az azonosítható hasmenéses fertőzések korrelálnak a magas kórokozóterheléssel, és veszélyeztetik a gyermekeket a nem optimális növekedés szempontjából. Ezenkívül értékeltük a gasztrointesztinális funkció új biomarkereinek és a kohorsz kimenetelének a kapcsolatát.

Mód

A csecsemők kényelmi mintáját a napi cink- és/vagy multivitamin-kiegészítés prospektív randomizált vizsgálatából választották ki a tanzániai Dar es Salaam-ban (14, 15) (Clinicaltrials.gov azonosító> NCT00421668). A beleegyező anyákat, akikről kiderült, hogy HIV-negatívak, bevonták a vizsgálatba, és csecsemőiket randomizálták 5–7 hetes kor között. Kizárták a többszülött csecsemőket és a veleszületett rendellenességeket vagy más, a vizsgálati eljárásokat zavaró állapotokat. A csecsemőket 6 hetes korban vonták be, és 18 hónapig követték őket. A demográfiai adatokat a beiratkozáskor, a morbiditási és antropometriai adatokat havi járóbeteg-utólátogatások során gyűjtötték. Minden gyermek periodikus adag A-vitamint kapott 6 havonta a tanzániai ellátás szokásos rendje szerint.

Az anyákat arra kérték, hogy négyhetente térjenek vissza a vizsgálati klinikára csecsemőikkel adatgyűjtés és szokásos klinikai ellátás céljából, beleértve a növekedés monitorozását, az immunizálást és a betegségek rutinszerű orvosi kezelését. E látogatások során az ápolók interjút készítettek a gondozókkal a gyermek morbiditási előzményeiről, és digitális gömbmérlegen 10 g-os pontossággal (Tanita) és 1 mm-es pontossággal mérték meg a gyermek súlyát egy merev hosszúságú deszkával, mozgatható lábdarabbal.

A székletmintákat 2009. január és 2011. január között gyűjtöttük olyan akut hasmenéstől szenvedő gyermekektől, amelyeket 24 vagy három órán belül három vagy több vizes székletként határoztak meg. A hasmenéses gyermekek székletét a vizsgálati helyszínen bélsamponral gyűjtötték a pelenkából (szalvéta) vagy a gyűjtőedényből (edény), és szállító közeget tartalmazó injekciós üvegekbe helyezték. Az üvegcséket hűtőbe helyeztük, és naponta egy központi laboratóriumba szállítottuk, ahol azonnal -80 ° C-on lefagyasztották őket. A csecsemőkből 6 hetes és 6 hónapos korban vért vettek, és –80 ° C-on lefagyasztották.

PCR-alapú TaqMan tömb módszert alkalmaztunk 15 enteropatogén székletmintájának szűrésére. A pozitív széklet PCR eredmények meghatározásához korábban leírt kórokozó-specifikus kvantifikációs ciklus (Cq) cutoffjait használtuk (7). Az elsődleges eredmény bármely azonosítható széklet enteropatogén előfordulása volt. A másodlagos eredmények között szerepelt a súly-életkor Z-pontszám (WAZ), a hosszúság-életkor Z-pontszám (LAZ) és a súly-hosszúság Z-pontszám (WLZ, standard antropometriai mérésekkel mérve) és a bél biomarkerek (beleértve az LPS elleni antitesteket is) aminosav és citrullin).

A flagellin- és LPS-specifikus IgA és IgG szinteket ELISA-val számszerűsítettük, amint arról korábban beszámoltunk (16). A mikrotiter-lemezeket egy éjszakán át tisztított E. coli flagellinnel (100 ng/üreg) vagy tisztított E. coli LPS-sel (2 μg/üreg) vontuk be. 1: 200 arányban hígított vizsgálati alanyok szérummintáit vittük a flagellinnel vagy LPS-sel bevont üregekbe. Inkubálás és mosás után a lyukakat vagy torma-peroxidázhoz kapcsolt anti-humán IgA-val (KPL) vagy IgG-vel (GE Healthcare) inkubáltuk. Az összes immunglobulin mennyiségi meghatározását kolorimetrikus peroxidáz szubsztrát tetrametilbenzidin alkalmazásával végeztük, és az optikai sűrűséget (OD) 450 nm-en olvastuk le ELISA lemezolvasóval. Az adatokat OD-ként korrigáljuk a háttér kivonásával (meghatározva a szérum nélküli minták leolvasásával).

Az alultivált citrullin (CIT) koncentrációját a szérum mintákban a Bostoni Gyermekkórház Laboratóriumi Orvosi Osztályának Klinikai és Epidemiológiai Kutatólaboratóriumában értékelték. A mintákat ultracentrifugáltuk a nagy molekulatömegű fehérjék eltávolítására. A CIT szétválasztási szelektivitását C18 BEH oszlop és ion-párosító szer, pentadekafluor-oktánsav alkalmazásával, Waters Acquity UPLC rendszeren (Waters Corporation, Milford, MA) végeztük. Pozitív elektrospray ionizációt és Waters Quattro premier hármas kvadrupól tömegspektrométert alkalmaztunk a CIT kimutatására a jellegzetes 176–170 és 176–113 m/z átmenetekkel.

Az adatokat a Microsoft Access szoftver segítségével duplán vittük be a központi tanulmányozási helyre, majd SAS-adatkészletekké alakítottuk át, és elemzés céljából feltöltöttük őket egy biztonságos UNIX-alapú szerverre. T-teszteket használtak az átlagos antropometriai mérések, a citrullin, a flagellin és az LPS koncentrációk összehasonlítására 6 hét, 6 hónap és 12 hónapos korban azoknál a gyermekeknél, akiknél bármely kórokozó pozitív volt, és azoknál, akiknél minden kórokozó negatív volt. A T-tesztek az összevont módszert alkalmazták, amikor a variancia egyenlő volt, és a Satterthwaite-módszert, amikor a variancia egyenlőtlen volt. Szórási diagramot készítettünk az enteropatogén terhelés (PCR kvantifikációs ciklus, Cq-vel mérve) és az antropometriai eredmények kapcsolatának értékelésére. Az összes elemzést SAS szoftver (9.2 verzió; SAS Institute) segítségével végeztük. Intézményi jóváhagyást adott a Harvard Közegészségügyi Iskola Humán Tárgyak Bizottsága, a Muhimbili Egészségügyi és Szövetséges Tudományi Kutatási és Publikációs Bizottság, valamint a Tanzániai Orvostudományi Kutatóintézet.

Eredmények

Százhuszonhárom hasmenéses alany került felvételre. Az 1. táblázat felsorolja az alvizsgálati populáció alapjellemzőit, beleértve az anyák és a csecsemők demográfiai és táplálkozási állapotát is. Az anyák közül 87 (70,7%) korábban legalább egyszer terhes volt. 120 csecsemő (97,6%) születési súlya> 2500 gramm volt, és 8 (6,5%) 37 terhességi hét előtt született.

Asztal 1

N = 123 hasmenéses alany kiindulási jellemzői