Határok a mikrobiológiában

Rendszerek mikrobiológiája

Ez a cikk a kutatási téma része

Az étrend, a bél mikrobiota és a gazdaszervezet metabolizmusa közötti kölcsönhatások Az összes 55 cikk megtekintése

Szerkesztette

Yuheng Luo

Szecsuáni Mezőgazdasági Egyetem, Kína

Felülvizsgálta

MAURIZIO SANGUINETTI

Katolikus Szent Szív Egyetem, Olaszország

Monica Di Paola

Firenzei Egyetem, Olaszország

A szerkesztő és a lektorok kapcsolatai a legfrissebbek a Loop kutatási profiljukban, és nem feltétlenül tükrözik a felülvizsgálat idején fennálló helyzetüket.

Cikk letöltése
- PDF letöltése
- ReadCube
- EPUB
- XML (NLM)
- Kiegészítő
  Anyag
Exportálás
- EndNote
- Referencia menedzser
- Egyszerű TEXT fájl
- BibTex

OSZD MEG

Eredeti kutatás CIKK

1 Orvostudományi Tanszék, Sassari Egyetem, Sassari, Olaszország
2 Porto Conte Ricerche, Szardínia Tudományos és Technológiai Parkja, Alghero, Olaszország
3 Orvostudományi Tanszék, Cagliari Egyetem, Cagliari, Olaszország

Bevezetés

A pékáruk közül a kenyér a legelterjedtebben fogyasztott élelmiszer világszerte, növekszik a kereslet a teljes kiőrlésű, magas rosttartalmú vagy „egészséget elősegítő” feldolgozással, például kovászos kovász által előállított termékek iránt. A kovász használata kimutatta, hogy javítja a sült kenyér ízét, szerkezetét és eltarthatóságát, mivel kémiai és fizikai tulajdonságai különböznek a sütőélesztő kovásztól (Gobbetti et al., 2016).

Ezenkívül a gabona erjesztését széles körben elismerték, hogy nagy potenciállal bír az élelmiszer-összetevők táplálkozási minőségének és egészséges hatásainak javításában. Számos tanulmány azt állította, hogy a kenyér előállításához használt speciális gabonamátrix és/vagy sütőipari eljárások javíthatják a szokásos fogyasztók klinikai paramétereit (Korem et al., 2017). A kovászos kovász aktívan visszafogja a keményítő emészthetőségét, alacsony glikémiás reakcióhoz vezet, és növelheti a vékonybélből kikerülő, emészthetetlen poliszacharidok termelését a szemrostokkal együtt, végül táplálja a vastagbél mikrobiotáját (Maioli et al., 2008; Scazzina et al. ., 2009; Sanna et al., 2018). Ennek érdekében a tejsavbaktériumok (LAB) kiválasztott fajait tesztelték a kenyér minőségének javítása céljából (De Vuyst et al., 2014). A kovászos kovász modulálja a bioaktív vegyületek szintjét és biológiai hozzáférhetőségét, valamint javítja az ásványi anyagok biológiai hozzáférhetőségét (Di Nunzio és mtsai, 2018).

A kovász és a sütőélesztő fermentációjának különböző enzimatikus aktivitásai felelősek lehetnek a fehérjék és poliszacharidok specifikus hidrolíziséért. A fehérjehidrolízis viszont befolyásolhatja a bioaktív vegyületek, valamint a gazdaszervezet fiziológiájára ható egyéb metabolitok felszívódását. Javasolták a savanyúságot, hogy erősen lebomlott gluténnal rendelkező kenyeret nyújtson, amely megfelelő lehet gluténérzékeny egyének számára (vagyis nem lisztérzékenységi gluténérzékenység esetén) (Gobbetti et al., 2018a, b).

Feltűnő, hogy a kovászos fermentáció a búzakenyér akrilamidtartalmát is csökkenti (Bartkiene et al., 2013). Ami az egyéb élelmiszertermékeket illeti, az akrilamid képződését a kenyérgyártás során befolyásoló tényezők az akrilamid prekurzorok (főleg aszparagin), redukáló cukrok és specifikus feldolgozási körülmények. Ezeknek a kovászjellemzőknek fontos gyakorlati következményei vannak, mivel az akrilamid neurotoxicitását, genotoxicitását, karcinogenitását és reproduktív toxicitását bizonyították (Keramat et al., 2011), és a pékáruk az emberi akrilamid expozíciónak körülbelül 20% -át teszik ki.

E tanulmányok alapján ezt a tanulmányt arra tervezték, hogy betekintést nyerjen a kovász kenyérkészítésre gyakorolt hatásainak, a bél mikrobiota (GM) taxonómiájának és a funkcionális tevékenységeknek a komplex kölcsönhatásába, és ezzel tisztázza annak lehetséges hatását a fogyasztók anyagcseréjére és egészségére. A mai napig nem értékelték a kovászos kenyérfogyasztás konkrét hozzájárulását a mikrobiota funkcionális tevékenységéhez. Ezért összehasonlítottuk a mikrobiális bélközösségek összetételét és aktív funkcióit három patkánycsoportban, táplálékkal kiegészítve kovászos kenyérrel (SB), sütőélesztő kovászos kenyérrel (BB) vagy kiegészítetlen étrenddel. Pontosabban úgy döntünk, hogy értékeljük a kovászfogyasztás hatását korlátozott kalóriatartalmú étrenddel táplált patkányokban, alacsony zsírtartalmú, magas rosttartalmú összetétel alapján, hogy elkerüljük a magas zsírtartalmú és/vagy magas cukortartalmú obesogén étrendhez már társított GM-módosításokat. Ezzel a megközelítéssel minimalizáltuk a táplálékfelvétel egyéni különbségéből adódó lehetséges zavaró hatásokat is, amelyek általában az etetett állatoknál jelentkeznek ad libitum (AL).

Anyagok és metódusok

Állatok és minták

Összesen 16 Fischer 344 patkányt (10 hetes, hím) vásároltak a Charles River Laboratories Italia, SRL-től (Calco, Olaszország) a gyártó VRF1 (P) 811900 állattenyésztésével (a zsír 4,5% -a) együtt. Az állatokat ketrecenként kettőre osztottuk, és napi ciklusokban tartottuk, felváltva 12 órás fény-sötétséget (a fény 11-kor világított, a villanyt 11-kor kialudt), táplálékkal és vízzel AL-val. Az állatkísérleteket a Cagliari Egyetem Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága vizsgálta felül és hagyta jóvá, és a vonatkozó irányelveknek és előírásoknak megfelelően hajtották végre (az Olasz Egészségügyi Minisztérium engedélye: 840/2016-PR). 2 hetes akklimatizáció után a patkányokat négy, egyenként négy patkányból álló csoportba osztottuk, és a következő etetési rendnek tettük ki. Az első csoportot folytatták az AL-chow diétával („chow-AL” csoport), míg a másik három csoportot korlátozott kalóriatartalmú (CR) diétával táplálták, amelyet az AL-táplálék 70% -ának számítottak, amint arról korábban beszámoltunk (Fraumene et al. (2018; Tanca és mtsai, 2018). A CR-vel táplált patkányok közül az egyik csoport csak laboratóriumi chow-t („chow” csoport) kapott, míg a fennmaradó két csoportot tipikus szardíniai kenyérrel (15% w/w) egészítették ki (carasau kenyér, amelyet egy helyi pékség gyártott), BB-vel („BB” csoport) vagy SB-vel („SB” csoport) kelesztve.

Az állatokat hetente lemértük, és 4 hetes kezelés után felöltük a megfelelő étrendjükkel.

A glikémiát a Glucose Analyzer II-vel (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) mértük. Vérmintákat vettünk a farokvénából 1 órával az étkezés előtt, vagy 2 órával az étkezés után.

A CR-vel táplált patkányokból 4 hét diétás kezelés után széklet-, máj- és vastagbéltartalmú mintákat gyűjtöttünk, míg az AL-vel táplált patkányokat pusztán növekedés kontrollként használtuk. A székletmintákat minden állatból összegyűjtöttük, kivéve a „chow” csoportba tartozó egy patkányt. A vastagbéltartalmat és a májmintákat minden állatból összegyűjtöttük. Az összes mintát felhasználásig azonnal -80 ° C-on tároltuk. Az elemzések során a székletmintákat 4 ° C-on felolvasztották, és mindegyikből két adagot gyűjtöttek a fehérje, illetve a DNS kivonására; a vastagbél tartalmát közvetlenül dolgozták fel a DNS extrahálásához, míg a májmintákat közvetlenül a fehérje extrakcióhoz.

DNS-extrakció és 16S rRNS génszekvenálás

Fehérjekivonás és proteomanalízis

Tizenegy székletmintát és 12 májmintát gyűjtöttünk a „chow”, a „BB” és az „SB” csoportba tartozó patkányoktól, majd gyöngyverés és melegítés/fagyasztás lépésnek vetettük alá, miután SDS-alapú redukáló extrakciós pufferben szuszpendáltuk korábban leírták (Tanca és mtsai, 2014). A fehérjekivonatokat megtisztítottuk, alkileztük, és a tripszint megemésztettük a szűréssel segített minta-előkészítési eljárásnak megfelelően (Wisniewski et al., 2009), kisebb módosításokkal, amelyeket máshol szemléltettek (Tanca et al., 2013, 2015).

Folyadékkromatográfia (LC) -tandem tömegspektrometriás (MS/MS) elemzéseket LTQ Orbitrap Velos tömegspektrométeren (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) végeztünk, EASY-spray forrással működtetve, kapcsolódva egy UltiMate 3000 RSLCnano-hoz. LC rendszer (Thermo Fisher Scientific). A mintákat randomizált sorrendben futtattuk. Betöltés után a peptid-keverékeket (4 μg/menet) betöltöttük, bepároltuk és sótalanítottuk egy csapdázó előoszlopra (Acclaim PepMap C18, 75 μm × 2 cm nanoViper, 3 μm, 100 Å, Thermo Fisher Scientific), 0,2% -os felhasználással. hangyasav 5 μl/perc áramlási sebességgel. A peptid-elválasztást C18 EASY-spray oszloppal (PepMap RSLC C18, 75 μm × 50 cm, 2 μm, 100 Å, Thermo Fisher Scientific) végeztük 35 ° C-on, 250 nL/perc áramlási sebességgel 247 percig, a B eluens következő kétlépcsős gradiensének felhasználásával (0,2% hangyasav 95% ACN-ben) az A eluensben (0,2% hangyasav 5% ACN-ben): 2,5–37,5% 242 percig és 37,5–99% 5 percig.

A tömegspektrométert adatfüggő MS/MS módban állítottuk fel, ahol a teljes pásztázási spektrumot (375 és 2000 m/z között) MS/MS spektrumok követték, az Xcalibur szoftver közvetlen irányítása alatt. A műszer pozitív üzemmódban működött. Az ionátadó kapilláris hőmérsékletét és a permetezési feszültséget 250 ° C-ra, illetve 1,85 kV-ra állítottuk be. A teljes pásztázást és az MS/MS spektrumokat az Orbitrap-ban kaptuk 60 000, illetve 7500 felbontással 400 m/z mellett. Az automatikus nyereségszabályozást 1 000 000 ionra állították, és a zár tömegének opciót egy protonált polidimetil-ciklosiloxán háttérionon belső újrakalibrálásként engedélyezték a pontos tömegméréshez (Olsen et al., 2005). A peptidionokat az előző vizsgálat 10 legintenzívebb csúcsának választottuk; az MS/MS esemény kiváltásának jelküszöbét 500-ra, a dinamikus kizárást pedig 30 másodpercre állítottuk. Nagyobb energiájú kollíziós disszociációt alkalmaztunk fragmentálási módszerként, a normalizált ütközési energia 35% -os értékét, m/z 3,0 izolációs szélességet, Q-értéket 0,25 és 0,1 ms aktiválási időt alkalmazva. Ütközési gázként nitrogént használtak.

A mikrobiális peptidek azonosítását a Proteome Discoverer informatív platform (2.0 verzió; Thermo Fisher Scientific) segítségével végeztük, a Sequest-HT-t keresőmotorként és a Percolator-t a peptid-validáláshoz (FDR 0,1% legalább egy mintában (összesen 17 389 183 szekvencia). mikrobiális szekvencia adatbázisok kerültek elhelyezésre a PRIDE-ben az MS adatokkal együtt. A második feldolgozó csomópont a Rodentia rendjébe tartozó fehérjeszekvenciákat tartalmazó adatbázisra épült, amelyet az UniProtKB/SwissProt tárolt (2017_11. kiadás; összesen 26 656 szekvencia). csak a második feldolgozó csomópontnak van kitéve.

A taxonómiai és funkcionális annotációt többféle stratégia alkalmazásával hajtották végre. Első annotációs lehetőségként a MEGAN v.6.8.19-et használták (Huson et al., 2016). A fehérje szekvenciákat előzetesen DIAMOND (v.0.8.22) keresésnek vetették alá az NCBI-nr adatbázissal (2017/09 frissítés), az alapértelmezett paraméterekkel rendelkező blastp paranccsal (Buchfink et al., 2015); majd a DIAMOND kimeneteket a MEGAN-ra töltöttük, és a legalacsonyabb közös ős (LCA) osztályozást végeztük el az alapértelmezett paraméterek felhasználásával. Ezenkívül az Unipept webalkalmazást (v.3.3.4; https://unipept.ugent.be) használtuk az azonosított peptidszekvenciák LCA osztályozásának elvégzésére (Mesuere et al., 2017). A funkcionális annotációt úgy hajtottuk végre, hogy az azonosított fehérjeszekvenciákat egy, az UniProtKB/Swiss-Prot (2017_09 kiadás) összes baktériumszekvenciáját tartalmazó adatbázishoz igazítottuk a DIAMOND (blastp modul, e-érték küszöbérték 10-5) alkalmazásával; Ezt követően az UniProtKB/Swiss-Prot belépési számokat kihasználták a fehérjecsalád-információk lekérésére az UniProt weboldaláról a „retrieve” eszközön keresztül (Pundir et al., 2016). Az egyes mintákra kapott metaproteomikus spektrumszámadatokat a funkcionális és taxonómiai annotációs szintek alapján összesítettük, generálva a családspecifikus és a nemzetspecifikus fehérjecsaládok bőségtáblázatát.

Statisztikai elemzés és grafikongenerálás

Differenciálanalízist végeztünk az olvasási (16S rRNS génszekvenálás) és a spektrális (metaproteomika) számlálási adatokon a Galaxy szerveren elérhető https://bioinf-galaxian.erasmusmc.nl/galaxy) edgeR csomag felhasználásával (Robinson és mtsai, 2010 ). A o-Az edgeR által biztosított értéklistákat ezután többszörös teszt-kiigazításnak vetették alá, a szekvenciális jósági (SGoF) metateszt alapján (Carvajal-Rodriguez et al., 2009), az SGoF + szoftver (v.3.8) használatával alapértelmezett paraméterekkel (Carvajal-Rodriguez és de Una-Alvarez, 2011). Egy kiigazított o-érték * = kiigazítva o-érték ** = kiigazítva o-érték *** = kiigazítva o-érték Kulcsszavak: bél mikrobiota, metagenomika, metaproteomika, étkezési folyamatok, kovász, diéta

Idézet: Abbondio M, Palomba A, Tanca A, Fraumene C, Pagnozzi D, Serra M, Marongiu F, Laconi E és Uzzau S (2019) Fecal Metaproteomic Analysis felfedi a bél mikrobioma funkcióinak egyedülálló változásait a kovász elfogyasztása után Carasau Kenyér. Elülső. Microbiol. 10: 1733. doi: 10.3389/fmicb.2019.01733

Beérkezett: 2019. április 12 .; Elfogadva: 2019. július 15 .;
Publikálva: 2019. július 30.

Yuheng Luo, Szecsuán Mezőgazdasági Egyetem, Kína

Maurizio Sanguinetti, a Szent Szív Katolikus Egyeteme, Olaszország
Monica Di Paola, Firenze Egyetem, Olaszország

† Ezek a szerzők egyformán járultak hozzá ehhez a munkához

‡ Jelenlegi cím: Alessandro Tanca, Sassari Egyetem, Orvostudományi Tanszék, Sassari, Olaszország