A Helicobacter pylori fertőzés hatással lehet az energiamoduláló hormonokra és a testtömegre a csíra mentes egerekben

Yalda Khosravi

1 Orvosi Mikrobiológiai Tanszék, Orvostudományi Kar, Malayai Egyetem, Kuala Lumpur, Malajzia

Shih Wee Seow

2 Nemzeti Rákközpont, Szingapúr, Szingapúr

Arlaine Anne Amoyo

2 Nemzeti Rákközpont, Szingapúr, Szingapúr

Kher Hsin Chiow

3 Vegyészeti és Élettudományi Iskola, Szingapúri Műszaki Egyetem, Szingapúr

Tuan Lin Tan

3 Vegyészeti és Élettudományi Iskola, Szingapúri Műszaki Egyetem, Szingapúr

Miért Yen Wong

3 Vegyészeti és Élettudományi Iskola, Szingapúri Műszaki Egyetem, Szingapúr

Qian Hui Poh

3 Vegyészeti és Élettudományi Iskola, Szingapúri Műszaki Egyetem, Szingapúr

Ignatius Mario Doli Sentosa

3 Vegyészeti és Élettudományi Iskola, Szingapúri Műszaki Egyetem, Szingapúr

Ralph M. Bunte

4 Duke-NUS Graduate Medical School, Szingapúr

Sven Pettersson

5 Mikrobiológiai, Daganat- és Sejtbiológiai Osztály (MTC), Karolinska Institutet, Stockholm, Svédország

6 LKC Orvostudományi Kar, Nanyang Technológiai Egyetem, Szingapúr, Szingapúr

7 SCELSE Microbiome Center, Nanyang Technológiai Egyetem, Szingapúr, Szingapúr

Mun Fai Loke

1 Orvosi Mikrobiológiai Tanszék, Orvostudományi Kar, Malayai Egyetem, Kuala Lumpur, Malajzia

Jamuna Vadivelu

1 Orvosi Mikrobiológiai Tanszék, Orvostudományi Kar, Malayai Egyetem, Kuala Lumpur, Malajzia

Absztrakt

Az ősi gyomor kórokozó, a Helicobacter pylori, az emberi gyomor mikrobiomjának kulcsfontosságú tagja. Az emberi fajjal együtt alakult ki, és a H. pylori-val való kapcsolatunk már 60 000 évvel ezelőtt visszavezethető volt 9. Ezenkívül a globális népesség több mint felének gyomrában lakik, etnikai hovatartozástól és földrajzi régiótól függetlenül 10. Sokan már a korai gyermekkorban megszerezték a baktériumokat családon belüli átvitel útján, és a kolonizáció egész életen át tartó, kivéve, ha orvosi beavatkozással kiirtották őket. Bár a legtöbb hordozó tünetmentesen marad, körülbelül 20% -uk végül az élet későbbi szakaszaiban gasztro-duodenális betegségeket (például krónikus gyomorhurut, gyomorfekély és gyomor adenokarcinóma) fejleszt ki 11. Számos tényező, köztük a H. pylori, a bél mikrobiota, a gazda és a környezet hozzájárulhat a H. pylori-hoz társuló betegségek kialakulásához.

Ebben a tanulmányban arra törekedtünk, hogy megvizsgáljuk a H. pylori és a normál bélmikrobiota kölcsönhatását az élet korai szakaszában GF és SPF egér modellek felhasználásával. Annak érdekében, hogy megértsük a H. pylori és a normál bél mikrobiota hatásait az anyagcsere és az immunrendszer fejlődésére, értékeltük a bél metabolikus hormonjainak és a citokinek/kemokinek változását a H. pylori kolonizációra adott válaszként mind a GFH, mind az SPFH egerekben.

Eredmények és vita

A beoltott SPFH és GFH egerekből H. pylori-t nyertünk ki a kolonizáció utáni 2., 8. és 16. héten. Ez azt mutatta, hogy a H. pylori 298 törzs sikeresen megtelepítette az ezzel a szervezettel beoltott egerek gyomrát. Másrészt az SPF és a GF egerek egyike sem volt pozitív a H. pylori szempontjából.

Ebben a vizsgálatban a kontroll SPF, a H. pylori-kolonizált SPFH, a kontroll GF és a H. pylori-kolonizált GFH egerek tömegét mértük a kolonizációt követő 2., 8. és 16. héten (1. ábra). A 16. hét végén sem az SPF, sem az SPFH egerek nem szenvedtek jelentős súlyvesztést (p> 0,05). A GFH egerek azonban jelentős késleltetett súlygyarapodást szenvedtek a GF egerekhez képest (p 12, 13. Korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a csíramentes egereknek 30% -kal több kalóriára volt szükségük a hagyományos egerekhez hasonló testtömeg megtartásához 12. egy másik tanulmány kimutatta, hogy a csíra nélküli egerek többet ettek, de lényegesen kevesebb testzsírt tartalmaztak, mint a hagyományos egerek 13. Ugyanebben a vizsgálatban a csíramentes egerek 60% -ot kaptak, amelyeket a hagyományosan nevelt egerek distalis beléből (cecum) gyűjtött mikrobiotával oltottak be. A normális bélmikrobiota fontos szerepet játszik az étrendből származó energiatermelés és a gazdaszervezet energiatárolásának meghatározásában. A H. pylori szerepét és kölcsönhatását a normál bélmikrobiotával azonban nem vizsgálták.

fertőzés

(A) A GF és a GFH egereknél a kísérlet 16. hetében szignifikánsan magasabb volt a ghrelin szint, mint az SPF és SPFH egereknél (p. 2B. Ábra). Ezzel szemben a H. pylori nem okozott nagyobb leptin szekréciót a GFH egerekben, mint a GF egerek, normál bél mikrobiota hiányában. Így a H. pylori és a normál bél mikrobiota felfelé szabályozott leptint eredményezett, de a ghrelin termelést nem eredményezte az SPFH egerekben.

A normál bél mikrobiota és a H. pylori indukálta az inzulintermelést

A H. pylori hatása a normál bélmikrobiom összetételére és működésére még nem teljesen tisztázott. Mindazonáltal ebben a tanulmányban előzetes eredményeink kimutatták, hogy a H. pylori megváltoztathatja a gazdája energiaháztartását, és hogy a normál bélmikrobiom megváltoztathatja a H. pylori gazdára gyakorolt ​​hatását.

Bélmetabolikus hormonok és testtömeg

Egy metaanalízis, amely beszámolt a H. pylori és az elhízás prevalencia arányairól több mint 100 emberi alany véletlenszerű populációs mintájában, és felfedezte, hogy fordított összefüggés van a baktériumok prevalenciája és a túlsúly/elhízás aránya között a fejlett országokban 29. Korábban kimutatták, hogy a keringő étkezéshez kapcsolódó leptin és ghrelin szintek megváltoznak a H. pylori felszámolása után humán önkéntesekben a testtömeg intex (BMI) növekedésével társulva, amely bizonyítékot szolgáltat arra, hogy a H. pylori kolonizáció szabályozhatja a ghrelin és a leptin szintjét, amely befolyásolja a testet morfometria 30. Ebben a tanulmányban kimutatták, hogy a fiatal GF egerekben a H. pylori kolonizáció csökkent testtömeg-növekedést eredményez.

Az SPFH egerekben szignifikánsan magasabb volt az éhomi leptin, inzulin és PYY, mint az SPF egerekben. A hormonális különbségek ellenére az SPFH egerek testtömege normális volt. Feltételezzük, hogy a PYY H. pylori-asszociált fel-szabályozása arra ösztönözte a gazdaszervezetet, hogy válaszul több inzulint és leptint termeljen, ezáltal fenntartva a normális testtömeget. A magasabb éhomi PYY, inzulin és leptin hosszú távú következményeit azonban még meg kell határozni. Másrészt a GF és a GFH egereknek magasabb volt a ghrelin, alacsonyabb a leptin és alacsonyabb az inzulin mennyisége, mint az SPF és SPFH egereknek. Ezenkívül a 16 hetes GFH egerek PYY szintje magasabb volt, mint a GF egereké. Mindezek a hormonális különbségek a GF és a GFH egerek között az SPF és az SPFH egerekhez viszonyítva testtömegükhöz kapcsolódhatnak. Érdekes módon a H. pylori testtömegre gyakorolt ​​hatása a GFH egerekben volt a legnyilvánvalóbb normál bélmikrobiota hiányában.

*. A korreláció 0,05 szinten szignifikáns (kétfarkú).

**. A korreláció szignifikáns 0,01 szinten (kétfarkú).

Vizsgálatunkban a H. pylori fertőzés GFH egerekben magas plazma PYY szinttel társult. Ez nagy energiafogyasztást és nagy anyagcsere-sebességet jelenthet ezekben az egerekben, ami a testtömeg gyors csökkenését jelenti. Azonban a normál bélmikrobiota jelenléte SPFH egerekben pufferolást biztosíthat a H. pylori testtömegre gyakorolt ​​közvetlen káros hatása ellen. Másrészt az SPFH egerek magas leptinszintje elnyomhatja a táplálékfelvételt, és ezáltal megakadályozhatja az egerek elhízását hosszú távon. A vizsgálat SPFH egereken elért eredményei összhangban vannak az emberi alanyok megfigyelésével, miszerint a H. pylori felszámolása a BMI 30 növekedését eredményezte. Így a metabolikus hormonokat szabályozó H. pylori szerepet játszhat az elhízás távol tartásában.

A Gut Microbiota és a H. pylori lehetséges hatásai a korai fejlődésre

Heijtz és mtsai. beszámolt arról, hogy a tanulmányban használt ugyanazok a GF egerek fokozott motoros aktivitást és csökkent szorongást mutattak az SPF egerekhez képest 8. Ez korrelált a motoros kontrollt és a szorongásszerű viselkedést szabályozó gének megváltozott expressziójával. Ugyanez a jelentés azt is kimutatta, hogy az élet elején a normális bélmikrobiotának kitett GF egerek hasonló tulajdonságokkal bírnak, mint az SPF egerek. Ez a megfigyelés összefüggésbe hozható a normál bélmikrobiota hiányában a GF egerek táplálékfelvételének károsodásával, ami alultápláltsághoz és fogyáshoz vezetett. Köztudott, hogy a táplálkozási szint közvetlen hatással van a korai fejlődési szakaszokra (ideértve az agy és a mentor fejlődését is). Ezenkívül kimutatták, hogy a ghrelin knockout egerek fokozott szorongással járnak a különféle stresszorok, például akut korlátozó stressz és szociális stressz hatására, kísérleti körülmények között 31. A GF egerek magasabb ghrelin szintje magyarázhatja a Heijtz és mtsai által közölt megváltozott viselkedést a GF egerekben.

A vérplazma megnövekedett eotaxin-1 szintje egerek és emberek öregedésével is összefüggésben van 32. Kimutatták, hogy a fiatal egereknek az eotaxin-1 vagy az idősebb egerek vérplazmájának való kitétele csökkentette neurogenezisüket és kognitív teljesítményüket olyan viselkedési feladatokban, amelyek a hippocampus neurogenezisétől függnek 32. Érdekes módon Dániában egy nagy populációs kohorsz retrospektív vizsgálat összefüggést mutatott ki a krónikus H. pylori és/vagy gastritis és a Parkinson-kór között 33. A kemokin, az eotaxin-1 szintjét a legmagasabbnak az SPFH egereknél találtuk (p 2G ábra). Az eotaxin-1 egyike az eozinofil migrációt közvetítő kemokineknek, amely a H. pylori által kiváltott gastritis egyik kiemelkedő összetevője 34. Így az SPFH egerekben az eotaxin-1 magas szintje azt feltételezte, hogy ezek a kemokinek a gyulladás korai jeleként szolgálnak, és a H. pylori és a normál bélmikrobiota kölcsönhatása fokozhatja a krónikus gyulladást. Ezért lehetséges, hogy a H. pylori expozíció a korai fejlődési szakaszokban hosszú távon kihat az agy fejlődésére. Sajnos ebben a vizsgálatban nem hajtottunk végre magatartási vizsgálatot vagy motoros kontrolltesztet megerősítés céljából.

Összefoglalva, ez a vizsgálat SPF és GF egerekben H. pylori-vel és anélkül azt sugallja, hogy a gyomor kórokozója, a H. pylori kölcsönhatásba lép a normál bél mikrobiotával, ami megváltoztatja az anyagcsere és a gyulladás útvonalát az SPFH egereken az SPF egerekhez képest (3. ábra). Eredményeink azt is sugallják, hogy a H. pylori és a normál bélmikrobiota között áthallás van, ami társul a bélgyulladással. Korábbi adatok megállapították az okozati összefüggést a H. pylori, a gyomorfekély és a gyomorrák között. Az ebben a tanulmányban bemutatott adatok, amelyek a H. pylori-t összekapcsolják a normál bél mikrobiotával való áthallással, azt sugallják, hogy a H. pylori által közvetített betegségek megjelenése emberben összetettebb. Ezért további kísérletek nagyon indokoltak, különösen a korai életkorban.

A normál bélmikrobiota fontos szerepet játszik a bél metabolikus hormon homeosztázisának szabályozásában, amely befolyásolja a normális testtömeg és az agy fejlődését. Ezenkívül a normális bélmikrobiota is befolyásolja a H. pylori kolonizáció eredményét azáltal, hogy befolyásolja a bél metabolikus hormonváltozásait és a H. pylori által kiváltott gyulladást.

Mód

H. pylori törzs és oltóanyag előállítása

Ebben a vizsgálatban a C57BL/6 egerekhez adaptált H. pylori 298 törzset használtuk. Ennek a törzsnek a genomját teljesen szekvenálták 35. Röviden: a H. pylori-t 0,4% élesztő kivonattal és 1% ß-ciklodextránnal (BHYC) kiegészített Brain Heart Infusion Broth-ban tenyésztettük 4 napig, 37 ° C-on, nedvesített 10% CO2-inkubátorban. A baktériumok számát 109 baktérium/ml koncentrációra állítottuk be az állatok beoltására.

Állatok és oltás

4–6 hetes hím SPF és GF C57BL/6 egereket használtunk kísérletekhez. Hím egereket használtak, mert beszámoltak arról, hogy a bél típusú gyomor karcinóma gyakoribb, mint a nőstények 36. Valamennyi egeret (SPF és GF) steril műanyag izolátorokban tartottuk az Országos Rákkutató Központ csíramentes létesítményében (NCC), amelyet a SingHealth Kísérleti Orvostudományi Központ adott otthont. Az állatokat autoklávozott R36 Lactamin Chow-on (Lactamin, Svédország) tartottuk, és 12 órás fényciklus alatt tartottuk. Az állatokat négy 12 csoportra osztottuk (SPF, SPFH, GF és GFH). A H. pylori-val történő beoltáshoz az SPF és GF egereket egy éjszakán át éheztettük, és intragasztrikusan etettük 0,1 ml baktériumtenyészettel háromszor, 1 napos intervallummal. A kontrollállatokat ugyanúgy steril BHYC táptalajjal oltottuk be. Ezt követően az egereket 2 hétig (N = 3 csoportonként), 8 hétig (N = 5) és 16 hétig (N = 5) áldoztuk meg a kolonizáció után. Az egér gyomrát gyűjtöttük a H. pylori tenyésztéshez, és plazmát használtunk a hormon- és citokinanalízishez.

Etikai nyilatkozatok

Valamennyi kísérleti eljárást a SingHealth Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottság (IACUC; 2011/SHS/680. Számú alkalmazás) és a Szingapúri Nemzeti Rákkutató Központ Biológiai Biztonsági Bizottsága/SingHealth Intézményi Biológiai Biztonsági Bizottság (IBS) előírásainak és irányelveinek megfelelően hagyták jóvá és hajtották végre.; 010/RBC/2011. Számú alkalmazás).

Plazma mintagyűjtemény

A vért előre lehűtött EDTA-bevonattal ellátott csövekbe vontuk, és inverzióval óvatosan összekevertük. A vért 2 M 4- (2-amino-etil) benzolszulfonil-fluorid-hidrokloridot (AEBSF, Sigma-Aldrich, Buchs, Svájc) tartalmazó hűtött Eppendorf-csőbe vittük 0,2 M végkoncentrációig, és óvatosan összekevertük. A csövet 3000 x g sebességgel 3 percig (4 ° C) centrifugáltuk. A kapott plazmát 1 N HCl-t tartalmazó kriotubába adtuk, hogy 0,1 N végkoncentrációt kapjunk, és -80 ° C-on tároltuk az elemzésig.

Az egér gyomor gyomorából származó H. pylori tenyésztését homogenizáltuk és csokoládé-agar lemezekre oltottuk be, amelyeket 7% lizált lóvérrel és szelektív táptalajok esetén trimetoprimmal (5 μg/ml), vankomicinnel (10 μg/ml), nalidixinsavval egészítettünk ki. (20 μg/ml) és amfotericin B-t (5 μg/ml) adunk hozzá. Az összes antibiotikum a Sigma-Aldrich Corporation-től (St. Louis, MO, USA) származott. Az agarlemezeket egyidejűleg 37 ° C-on, nedvesített körülmények között, 10% szén-dioxiddal inkubáltuk. A H. pylori-szerű telepeket pozitivitással igazolták ureáz-, oxidáz- és katalázvizsgálatokkal.

Bélhormonok és citokinek multiplex vizsgálata

Milliplex MAP készletet az egérmetabolikus mágneses gyöngypanelhez (katalógus # MMHMAG-44K; Millipore Corp., MO, USA) nyolc bélhormon számszerűsítésére használták fel, amelyek az élelmiszer-bevitel, az energiafogyasztás és a testtömeg fontos szabályozói: acilezett (aktív) ghrelin, leptin, aktív amilin, inzulin, aktív glukagon-szerű peptid-1 (GLP-1), teljes gyomor-gátló polipeptid (GIP), teljes YY peptid (PYY) és hasnyálmirigy-polipeptid (PP). Egér citokin/kemokin mágneses gyöngypanelt (katalógus # MPXMCYTO-70K; Millipore Corp., MO, USA) 32 különböző egér citokinből/kemokinből álló panel mérésére használtunk. Plazmát alkalmaztunk, és a vizsgálatokat a gyártó utasításai szerint végeztük. A mérést Luminex 200 ™ rendszeren végeztük xPONENT ™ szoftverrel, 3.1 verzió (Luminex, Austin, TX, USA).

Statisztikai analízis