A hidrolizált étrend stimulálhatja az étellel reaktív limfocitákat kutyákban

Kenichi MASUDA

1) Animal Allergy Clinical Laboratories Inc., SIC-2 # 301, 5-4-30, Nishihashimoto, Midori-ku, Sagamihara-shi, Kanagawa 252-0131, Japán

Atsushi SATO

1) Animal Allergy Clinical Laboratories Inc., SIC-2 # 301, 5-4-30, Nishihashimoto, Midori-ku, Sagamihara-shi, Kanagawa 252-0131, Japán

Atsushi TANAKA

1) Animal Allergy Clinical Laboratories Inc., SIC-2 # 301, 5-4-30, Nishihashimoto, Midori-ku, Sagamihara-shi, Kanagawa 252-0131, Japán

Akiko KUMAGAI

1) Animal Allergy Clinical Laboratories Inc., SIC-2 # 301, 5-4-30, Nishihashimoto, Midori-ku, Sagamihara-shi, Kanagawa 252-0131, Japán

Absztrakt

Az eliminációs étrendek gyakran tartalmaznak alacsony molekulatömegű (MW) fehérjéket és peptideket, amelyek a nyersanyagok fehérjéinek enzimatikus emésztéséből (hidrolíziséből) származnak [2, 10, 20]. A hidrolizált fehérje-diétákat terápiásnak tekintik a kísérő állatok számára, mivel megakadályozhatják az allergiás reakciókat az étel túlérzékenysége miatt [2]. Emberben az IgE felismeri az 5–50 kDa közötti MW-os fehérjeallergéneket, ezért az eliminációs étrendben a hidrolizált fehérjék MW-nak 5 kDa-nál alacsonyabbnak kell lennie az allergiás reakciók megelőzése érdekében [29]. Egy nemrégiben kutyákon végzett vizsgálat kimutatta, hogy a hidrolizált baromfitoll-lisztből készített kutyatáplálás 95% hidrolizált fehérjét tartalmazó, MW ≤1 kDa molekulatömeggel nem váltott ki klinikai reakciókat csirkére allergiás kutyákban. Ugyanakkor egy másik, 78% hidrolizált csirkemájfehérjét tartalmazó étrend, amelynek MW ≤1 kDa, allergiás reakciókat váltott ki a kutyák 40% -ában [2].

A táplálék-korlátozás és provokáció után étel-túlérzékenységgel diagnosztizált kutyák klinikai vizsgálata a kutyák 82% -ánál talált IV típusú túlérzékenységi limfocita által közvetített reakciókat, azonban az I. típusú túlérzékenységet ritkán fedezték fel [8]. Egy másik jelentés, amely krónikus dermatitiszben és gyaníthatóan túlérzékenységben szenvedő kutyák klinikai eseteit értékeli, megerősítette ezt a trendet [5]. Ezenkívül egy gyomor-bélrendszeri tünetekkel rendelkező, klinikailag gyulladásos bélbetegségként diagnosztizált kutyákon végzett tanulmány megállapította, hogy a perifériás limfociták az összes állatban legalább egy élelmiszer-antigénre reagálnak [12]. Az áramlási citometriás elemzésből kiderült, hogy a túlérzékenységgel társuló IV típusú limfociták CD4 + helper T-limfociták voltak [5, 21]. Elméletileg az ilyen típusú limfociták reaktívak azokra a fehérjékre vagy peptidekre, amelyek nem váltanak ki IgE által közvetített reakciókat [10, 14]. Ezért egyértelmű, hogy a hidrolizált étrend klinikai alkalmazása - az élelmiszer-eliminációs programok részeként - nem biztos, hogy minden kutya túlérzékeny.

SDS-PAGE

A hidrolizált étrendet és a csirkehús kivonatokat (Greer Laboratories, Inc., Lenoir, NC, USA) SDS-PAGE-val elválasztottuk 5–20% -os gradiensű poliakrilamid gélben (ATTO Corp., Tokió, Japán) egy korábban leírt módszerrel [ 11]. A D-1, D-2 és a csirkehús kivonat összes fehérje mennyiségét sávonként 10 ug-ra állítottuk be. Elektroforézis után a gélt Coomassie ragyogó kékkel (CBB) (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp., Osaka, Japán) vagy ezüstfolt reagenssel (Cosmo Bio Co., Ltd., Tokió, Japán) festettük a fehérjecsík megjelenítéséhez.

Méretkizárásos kromatográfia

Az extraktumok méretkizárásos kromatográfiáját egy korábban ismertetett eljárás enyhe módosításával végeztük [11]. A Superdex 200 10/300 GL oszlopot (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Svédország) kiegyensúlyoztuk foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS). Mindegyik mintát izokratikusan eluáltuk 0,5 ml/perc áramlási sebességgel PBS-ben, és a fehérjeelúciót UV-abszorbanciával 280 nm-nél követtük nyomon. Az oszlopot Gel Filtration Low MW Kit-rel (GE Healthcare Bio-Sciences AB) kalibráltuk, amely különböző MW-fehérje-normákat tartalmaz: ferritint (440 kDa MW), aldolázt (MW 158 kDa), konalbumint (MW 75 kDa), ovalbuminot (MW 43 kDa), karboanhidráz (MW 29 kDa), A ribonukleáz (MW 13,7 kDa) és aprotinin (MW 6,5 kDa).

Limfocita stimuláció

Áramlási citometria

Amint azt korábban leírtuk [5, 14], az áramlási citometriás elemzés során használt antitestek tartalmazzák az anti-dog CD4 patkány antitestet, amelyet Alexa Fluor 647-el (YKIX302.9 klón) jelölünk (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). és anti-humán CD25 antitestet jelöltük meg fikoeritrinnel (ACT-1 klón) (DAKO Cytomation, Glostrup, Dánia), valamint olyan izotípus kontrollokat, mint az Alexa Fluor 647 jelzett tisztított patkány IgG2a (Bio-Rad Laboratories) és PE- jelzett egér IgG1 (Bio-Rad Laboratories). A festett elhalt sejteket propidium-jodid beépítésével kizártuk. Végül CD4 + CD25 + sejteket mértünk egy limfocita kapuban FACS Canto II és FACS Diva szoftverrel (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Meghatároztuk az aktivált helper T-limfociták számát az egyes antigénekkel szemben, kiszámítva a CD4 + CD25 alacsony limfociták százalékos arányát 2500 CD4 + limfocitában [18, 19]. Az aktivációt ≥0,4% CD4-pozitív T-limfocitaként határoztuk meg, mivel legalább tíz pozitív sejt (2500 sejt 0,4% -a) megerősítette az elkülönült sejtpopuláció jelenlétét.

D-1 (1. sáv), D-2 (2. sáv) és csirkehús (3. sáv) kivonatok SDS-PAGE oldala Coomassie ragyogó kékkel (CBB) és ezüstfestéssel. Az egyes sávokra felvitt összes fehérje mennyiség 10 ug volt. Ne feledje, hogy az 1. sávban nem voltak vizualizált sávok. SDS-PAGE, nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gél elektroforézis.

A méretkizárásos kromatográfiával 6–8 fehérje hullámforma csúcsot mutattunk ki, amelyek különböző molekulatömegűek voltak mind a D-1, mind a D-2-ben (2. és 3. ábra). A standard fehérjereagensek alapján a két fő csúcs becsült MW-ja> 1 kDa, körülbelül 1,5 kDa és 3,5 kDa volt. A D-2 kivonatokban 440 kDa-nál nagyobb molekulatömegű csúcsot (a legnagyobb standard fehérje) detektáltunk. Mindhárom D-1 terméktétel és két D-2 terméktétel hasonló hullámmintákat mutatott (3. ábra). Egy másik laboratóriumban (Toray Research Center, Inc., Tokió, Japán) kapott méretkizárásos kromatográfiás adatok hullámforma csúcsokat tártak fel, az eredményeinkhez hasonlóan (az adatokat nem közöljük).

D-1 kivonatok méretkizárásos kromatográfiája. A vizsgálatot három különböző termékrészlettel megismételtük. Hasonló hullámmintákat észleltünk minden termék tételben.

D-2 kivonatok méretkizárásos kromatográfiája. A vizsgálatot két különböző termékrészlettel megismételtük. Hasonló hullámmintákat észleltünk minden termék tételben.

A limfocita válaszok a hidrolizált fehérjékre és a baromfihoz kapcsolódó antigénekre

A vizsgálat során megvizsgált 316 PBMC-minta közül 91 (91/316, 28,8%) és 75 (75/316, 23,7%) pozitív limfocita választ (≥0,4%) mutattak ki a D-1 és D-2 kivonatokkal szemben. minták (1. táblázat).

Asztal 1.

Baromfi Összesen≥0,4% a) b)

D-1 ≥0,4%	72	19.	91.
D-1 1. táblázat). A D-1 és D-2 kivonatok pozitív válaszokat váltottak ki 130 mintában, amelyek nem mutattak pozitív limfocita választ egyetlen baromfival rokon antigénre sem; 20 minta (20/130, 15,4%) reagált a D-1-re, és 19 minta (19/130, 14,6%) a D-2-re. A Chi-négyzet teszt alkalmazása azt mutatta, hogy nincs összefüggés a baromfihoz kapcsolódó antigénekre adott pozitív limfocita-válaszok maximális százaléka és a D-1 vagy D-2 kivonatra adott pozitív válaszok között.

Csak hét (7/316, 2,2%) D-1 minta és hat D-2 minta (6/316, 1,9%) váltott ki limfocita reakciót ≥1,2% értékkel.

VITA

A hidrolizált étrendet hatékonynak tekintik az étel túlzott érzékenységű kísérő állatok táplálék-eliminációs programjaiban, mivel olyan molekuláris tömegű fehérjéket vagy peptideket tartalmaznak, amelyek jellemzően túl alacsonyak ahhoz, hogy stimulálják az allergiás reakciókat. Élelmiszer-túlérzékenységű kutyák klinikai eseteiről azonban beszámoltak, amelyek hidrolizált étrenddel nem reagáltak pozitívan az élelmiszer-eliminációs programokra [2]. Ezenkívül egy korábbi jelentésből kiderült, hogy több, 21–67 kDa közötti molekulatömegű szénhidrátfehérjét, valamint azokat, amelyeket a szérum IgE felismert az ételtúlérzékenységre gyanús kutyák egyedi eseteiben, azonosítottak ugyanabban a kereskedelmi étrendben, amelyet ebben a tanulmányban megvizsgáltak [22]. ]. Ebben a tanulmányban a D-1 és D-2 kivonatok SDS-PAGE géljei 24 kDa-nál valamivel magasabb MW-sávokat tártak fel. Ezenkívül egy rendkívül nagy MW (> 440 kDa) csúcsot csak D-2 kivonatokban detektáltunk méretkizárásos kromatográfiával. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az I. típusú túlérzékenység előfordulhat olyan klinikai esetekben, amikor a szérum IgE reaktív a fehérjékre.

Bár feltételezhető, hogy a T-limfocita reakciók indukálódnak a hidrolizált fehérjetartalmú étrendek ellen, a táplálék túlérzékenységével kapcsolatos klinikai tünetek kiváltását kutyákban három okból valószínűtlennek tartották. Először ebben a vizsgálatban a ≥1,2% -os T-limfocita válaszokat 316-ból csak hét esetben (2,2%), 316-ból hat esetben (1,9%) D-1 és D-2 stimuláltak. Mivel 1,2% -ot tekintettek a kutyaeledel túlérzékenységének klinikai megnyilvánulásának küszöbének [5], a hidrolizált étrendeknek a legtöbb esetben biztonságosnak kell lenniük. Másodszor, a hidrolizált táplálékkal etetett kutyáknál a gyomor-bél emésztésnek csökkentenie kell a fehérjék vagy peptidek molekulaméretét, esetleg megakadályozva a T-limfociták elleni antigenitást. Például a kollagén gyakori emésztőrendszeri emésztése in vitro kis peptideket eredményez MW Bexley J., Kingswell N., Olivry T.2019. A szérum IgE keresztreaktivitása a halak és a csirkehús között kutyákban. Állatorvos. Dermatol. 30: 25 – e8. doi: 10.1111/vde.12691 [PubMed] [CrossRef] [Google Tudós]