A hidroxi-tirozol antimikoplazmatikus aktivitása

Pio Maria Furneri

Mikrobiológiai és Nőgyógyászati Tudományok Tanszék, Cataniai Egyetem, Catania, 1 Farmakokémiai Tanszék, 2 Farmakobiológiai Tanszék, Messinai Egyetem, Messina, Olaszország 3

Anna Piperno

Mikrobiológiai és Nőgyógyászati Tudományok Tanszék, Cataniai Egyetem, Catania, 1 Farmakokémiai Tanszék, 2 Farmakobiológiai Tanszék, Messinai Egyetem, Messina, Olaszország 3

Antonella Sajia

Mikrobiológiai és Nőgyógyászati Tudományok Tanszék, Cataniai Egyetem, Catania, 1 Farmakokémiai Tanszék, 2 Farmakobiológiai Tanszék, Messinai Egyetem, Messina, Olaszország 3

Giuseppe Bisignano

Mikrobiológiai és Nőgyógyászati Tudományok Tanszék, Cataniai Egyetem, Catania, 1 Farmakokémiai Tanszék, 2 Farmakobiológiai Tanszék, Messinai Egyetem, Messina, Olaszország 3

Absztrakt

A vizsgálat célja a hidroxi-tirozol in vitro antimikoplazmális aktivitásának vizsgálata volt. Húsz Mycoplasma hominis, három Mycoplasma fermentans és egy Mycoplasma pneumoniae törzset használtunk. M. pneumoniae, M. hominis és M. fermentans esetében a MIC-értékek 0,5, 0,03 (a vizsgált törzsek 90% -ánál), illetve 0,25 μg/ml voltak.

A mediterrán étrend tipikus összetevői, mint például az olívaolaj és a vörösbor, nagy koncentrációban tartalmaznak komplex fenolokat, amelyek erős antioxidáns aktivitással rendelkeznek. A mediterrán medencében az olívaolaj, valamint a gyümölcsök, zöldségek és halak az étrend fontos alkotóelemei, és az egészséges és viszonylag betegségektől mentes népesség megőrzésének fő tényezői. Az epidemiológiai adatok azt mutatják, hogy a mediterrán étrendnek jelentős védőhatása van a rákkal és a szívkoszorúér betegségekkel szemben.

Az antibiotikumokkal szembeni növekvő rezisztencia jelenti a fő tényezőt, amely igazolja az új antimikrobiális szerek megtalálásának és kifejlesztésének szükségességét. Így számos tanulmány a növényi eredetű hatóanyagok (például fűszerek és illóolajok) antimikrobiális tulajdonságaira összpontosít, amelyeket a hagyományos orvoslásban hosszú ideje alkalmaznak a fertőzések leküzdésére (7).

Az olajbogyó (Olea europaea L.) gyümölcse és levelei olyan vegyületek sorát tartalmazzák, amelyek a mikroba és a rovarok támadásai elleni védelem multikémiai mechanizmusait képviselik. Egyértelmű bizonyítékok vannak az olajbogyó, az olívaolaj, valamint a levelek és a vegetációs vizek összetevőinek antimikrobiális aktivitására vonatkozóan. Különösen az O. europaea biokeverékek lehetséges alkalmazását javasolták az emberi patogén baktériumok ellen (4, 5, 9, 17).

Az olívaolajban azonosított és számszerűsített főbb fenolvegyületek három különböző osztályba sorolhatók: egyszerű fenolok (hidroxi-tirozol és tirozol), szekoiridoidok (oleuropein, a ligstrozid aglikonja és ezek megfelelő dekarboxilezett dialdehidszármazékai) és lignánok [(+) - 1- acetoxipinorezinol és pinoresinol]. A közelmúltban az oleuropein (az olajbogyóban nagy mennyiségben előforduló keserű molekula) és a hidroxi-tirozol (amely savas vagy enzimatikus hidrolízissel származik az oleuropeinből és felelős az olívaolaj nagy stabilitásáért) (4, 21) kimutatták, hogy gátolják vagy késleltetik az számos baktérium és gomba szaporodási sebessége, így hatékonyan alkalmazhatók alternatív élelmiszer-adalékanyagként vagy integrált kártevőkezelő programokban (3, 6, 11, 14-16). Sőt, bebizonyítottuk az oleuropein és a hidroxi-tirozol jó antimikrobiális aktivitását az American Type Culture Collection és a klinikailag izolált gram-pozitív és gram-negatív baktériumtörzsek (Salmonella sp., Vibrio sp. És Staphylococcus aureus) ellen (4). Mivel az oleuropeinről kimutatták, hogy gátolja a mikoplazmákat is (8), az itt leírt vizsgálatot azzal a céllal hajtottuk végre, hogy meghatározzuk a Mycoplasma pneumoniae, a Mycoplasma hominis és a Mycoplasma fermentans in vitro hajlamát a hidroxi-tirozolra.

A hidroxi-tirozolt szintetizáltuk Bisignano és munkatársai által korábban leírt módon. (4) Munkaoldatot készítettünk 0,1 M foszfátpufferben, és a végső pH megegyezett a vizsgálati közegével.

Tizenkilenc alacsony áteresztésű, klinikailag izolált M. hominis törzs (hüvely, húgycső és méhnyak izolátumok), egy M. hominis referencia törzs (PG 21), egy M. pneumoniae referencia törzs (FH) és egy alacsony áteresztésű törzs (hüvelyizolátum) és két referencia törzset (PG18 és K7) vizsgáltunk az M. fermentans-tól.

Az M. hominis-t 10-B táptalajban (pH 6,0) (13) tenyésztettük, amely karbamid helyett 1% arginint tartalmaz. M. pneumoniae-t és M. fermentans-t tenyésztettünk az SP-4-ben (18). Az összes törzset fagyasztva (-80 ° C) tartottuk, amíg meg nem vizsgáltuk a gyógyszerrel.

A MIC értékét húsleves mikrodilúciós vizsgálattal határoztuk meg, amely lényegében egyenértékű volt a korábban leírtak szerinti metabolizmus gátlási teszttel (12). A Mycoplasma táptalajt (0,025 ml specifikus tápoldat) mikrotiter mélyedésekbe oltottuk. Mindegyik gyógyszer törzsoldatát (0,025 ml) hozzáadtuk az első üreghez, és soros kétszeres hígításokat (0,025 ml) készítettünk egy többcsatornás pipettával, a második üregtől kezdve; a végső 0,025 ml-t eldobtuk, és összesen 11 gyógyszerkoncentrációt készítettünk. Organizmusok szuszpenzióját (0,175 ml) adtuk a gyógyszereket tartalmazó minden üreghez. A lemezeket átlátszó acetáttal lezártuk, és atmoszferikus körülmények között 37 ° C-on inkubáltuk.

Mindegyik törzset háromszor klónoztuk a teszt előtt, majd felhasználtuk a MIC meghatározásához. A hozzáadott organizmusok számát soros 10-szeres hígításokkal ellenőriztük annak biztosítása érdekében, hogy a vizsgálati rendszer megfelelő (103 CFU/ml), de ne legyen túlzott (> 105 CFU/ml) mennyiségű oltóanyag. Az összes mikrotányért 18 órán át tartó inkubálás után, majd naponta egyszer megvizsgáltuk, amíg a szervezet kontroll csövében növekedés nem történt. A MIC-t az antibiotikumok legalacsonyabb koncentrációjaként határoztuk meg, amelyek gátolták a húsleves színváltozását, amelyet egy adott Mycoplasma törzs okozott, amikor a kontrollcső színe megváltozott, vagyis amikor a tápközeg pH-ja 7,5-ről 7,0-re csökkent. (M. pneumoniae és M. fermentans), vagy 6,0-ról 6,5-re nőtt (M. hominis). A szükséges inkubációs idő 24–48 óra volt M. hominis és M. fermentans esetében, és 3-5 nap M. pneumoniae esetében. További inkubációkat nem hajtottak végre. Minden mikoplazmatörzset hatszor teszteltünk minden antimikrobiális ágenssel szemben. A törzseket további hat alkalommal, különböző napokon teszteltük a gyógyszerrel, hogy biztosítsuk az eredmények reprodukálhatóságát.

Minden tesztelt mikoplazmatikus törzshez pozitív tápoldatot (növekedést), amely a húslevesben lévő organizmusokból áll, negatív kontrollt (sterilitást), amely nem oltott húslevesből áll, és a legmagasabb gyógyszerkoncentrációjú húslevest tartalmazó gyógyszerkontrollt. S. aureus ATCC 29213 kontrollként szerepelt; a Muller-Hinton táptalajban kapott gyógyszer MIC-értékét összehasonlítottuk a mycoplasma-tápközegben kapottval. Ezt a referencia törzset mikrotiter lemezekre oltottuk, amelyek 10-B táptalajt, SP-4 táptalajt, Muller-Hinton táptalajt II (Becton Dickinson & Co., Sparks, Md.) És a MIC megfelelő meghatározásához tesztelt megfelelő hígításokat tartalmaztak. Ezeket a kontroll eljárásokat minden alkalommal megismételtük, amikor egy vizsgálatot végeztünk.

Az érzékenységi tesztek eredményeit az 1. táblázat tartalmazza. 1. A hidroxi-tirozol 0,03–0,5 μg/ml koncentrációban gátolta a mikoplazmákat. Az M. pneumoniae, az M. hominis és az M. fermentans MIC-értékei 0,5, 0,03 és 0,25 μg/ml voltak. A reprodukálhatóság tekintetében a különálló vizsgálatokban nem figyeltek meg eltérést a MIC eredmények között. Ezért a 10-B és az SP-4 egyaránt 4,0 μg/ml hidroxi-tirozol-MIC-t eredményezett az S. aureus esetében, amely megegyezik a Mueller-Hinton-táptalajban erre a törzsre kapott értékkel.

ASZTAL 1.

M. hominis, M. fermentans és M. pneumoniae érzékenysége a hidroxi-tirozollal szemben

Mikroorganizmus (törzsek száma) MIC (μg/ml) A törzsek 50% -a a törzsek 90% -a

Mycoplasma hominis (20)	0,03	0,03	0,03-0,12
Mycoplasma fermentans (3)	0,25
Mycoplasma pneumoniae (2)	0.5

A természetben előforduló vegyületek antimikrobiális aktivitását a közelmúltban felülvizsgálták az irodalomban, és jelentős az érdeklődés ezen vegyületek új antimikrobiális szerekként történő felhasználása iránt az emberekben (7). Természetesen a biztonság és a biohasznosulás elsődleges szempont az emberi terápiában alkalmazandó antimikrobiális szereknél. Számos tanulmány arról számolt be, hogy az olívaolaj vagy a tiszta hatóanyag emberi fogyasztása után a hidroxi-tirozol jó biohasznosulása (10, 19, 20). Bár az olívaolajat fogyasztó embereknél a hidroxi-tirozol és/vagy metabolitjainak plazmakoncentrációját még nem írták le, amikor önkéntesek plazmamintáiban 25 mg szűz olívaolaj egyszeri bevétele után (a napi olajbevitel a mediterrán országokban), 25 μg/liter maximális koncentrációt értek el (10). Ezenkívül a hidroxi-tirozol emberben való elhelyezkedése dózisfüggő volt (19, 20).

Ezenkívül az olívaolaj bizonyította biztonságosságát az emberek sok éves használata és fogyasztása révén. Aeschbach és mtsai. (1) és Aruoma és mtsai. (2) enyhe in vitro prooxidáns aktivitást figyelt meg a hidroxi-tirozol DNS-en, de csak nem élettani, millimoláris koncentrációknál. Ezen túlmenően az olíva-polifenolok (beleértve a hidroxi-tirozolt is) általában állítólag nem toxikusak az emlőssejtekkel szemben (7).

Jelen eredmények azt mutatják, hogy a hidroxi-tirozolt ígéretes antimikrobiális szernek lehet tekinteni az emberi fertőzések kezelésében; biztonságossága (7) és jó biohasznosulása (10, 19, 20) további előnyöket jelent a lehetséges terápiás alkalmazás szempontjából.

Ezért feltételezhető, hogy az olívabogyóban és az olívaolajban található polifenolok étrendi bevitele csökkentheti a mikoplazmás fertőzés kockázatát. Úgy gondoljuk, hogy a mikoplazmák érdekes eszközök lehetnek a hidroxi-tirozol és bakteriológiai membrán kölcsönhatásának tanulmányozására és jobb jellemzésére. További vizsgálatokra van szükség e két pont tisztázásához.