A hipofoszfatémia rachitishoz vezet a hipertrófiás kondrociták kaszpáz által közvetített apoptózisának károsodásával

Szerk .: Robert J. Cousins, Floridai Egyetem, Gainesville, FL (áttekintésre beérkezett 2005. március 18-án)

által

Absztrakt

Annak tisztázása érdekében, hogy e három anyagcsere-rendellenesség közül melyik a rachita patofiziológiai alapja, két további egérmodellben végeztek vizsgálatokat: a Phex-gén mutációi miatt másodlagos hipofoszfatémiás egerek (Hyp egér) (3), normál kalcium- és mellékpajzsmirigy-hormonhoz társítva PTH) szintek; és egerek étrend által kiváltott hipofoszfatémiában/hiperkalcémiában, amelyekben a PTH szint elnyomott. Ezek a tanulmányok azt mutatják, hogy a hipofoszfatémia miatt másodlagos terminális hipertrófiás kondrociták károsodott apoptózisa a rizs közös mediátora a három vizsgált modellben. In vitro analízis az egér elsődleges kondrocitáiban azt mutatja, hogy a foszfát a hipertrófiás kondrocita apoptózist közvetíti a kaszpáz-9-függő mitokondriális útvonal aktiválásával. Kaspáz-9 inhibitorral kezelt egereken végzett vizsgálatok megerősítik a mitokondriális út kritikus fontosságát a növekedési lemez érésében in vivo.

Anyagok és metódusok

Állatok. Az összes elvégzett vizsgálatot az intézményi állatgondozási bizottság jóváhagyta. Az egereket vírusoktól és parazitáktól mentes gáton tartottuk, és 12 órás fény/sötét ciklusnak tettük ki őket. A vizsgálat összes egere C57BL/6J háttérrel rendelkezik. Az egereket 18 napos korban elválasztották 1% kalciumot, 0% laktózt és 0,44% foszfort tartalmazó standard étrendre. A VDR-knockout egerek vér-ásványi ionszintjének normalizálása érdekében az állatokat 18% -tól 2% kalciumot, 1,25% foszfort és 20% laktózt tartalmazó y-besugárzott teszteleggyel (TD96348, Teklad, Madison, WI) tápláltuk. kor. Hipofoszfatémia/hiperkalcémia kiváltására vad típusú egerekben az állatokat 18 napos korukban 2% kalciumot, 20% laktózt és 0,02% foszfort tartalmazó étrendre választották. A kaszpázfüggő apoptózis in vivo értékeléséhez naponta (4 nmol/testtömeg g) kaszpáz-3 gátlót (Z-DEVD-FMK) vagy kaszpáz-9 gátlót (Z-LEHD-FMK) (Calbiochem) injektáltunk i.p. 18-23 napos kortól C57BL/6J egerekbe rendszeresen táplálkoztak.

Biokémiai paraméterek. A szérum foszfátszinteket a Phosphorus Liqui-UV kit (Stanbio Laboratory, Boerne, TX) alkalmazásával mértük. A szérum kalciumszintet a Calcium CPC LiquiColor tesztkészlettel (Stanbio Laboratory) mértük. A szérum PTH szintjét egér intakt PTH ELISA kit alkalmazásával határoztuk meg (Immutopics, San Clemente, CA).

Szövet szövettana. A sípcsontokat fixáltuk és 10% formalin-PBS/20% EDTA-ban (pH 8,0) 24–48 órán át dekalkultáltuk. Ezután a mintákat feldolgoztuk, paraffinba ágyazottuk és mikrotómmal (RM 2025, Leica, Deerfield, IL) metszettük. Az ásványosodás értékeléséhez a metszet elmetalizálatlan metszeteket metil-metakrilátba ágyaztuk a metszés elõtt.

Az apoptózis értékelése. Az apoptotikus sejteket TUNEL-alapú in situ sejthalál-detektáló készlet (Roche Diagnostics) segítségével azonosítottuk. 10 μg/ml proteináz K-val 30 percig, 37 ° C-on végzett kezelés után a metszeteket 2 órán át 37 ° C-on inkubáltuk a TUNEL reakcióeleggyel, leöblítettük, 2% Evans kék oldattal (Sigma) ellenfestettük és Vectashield-rel szereltük fel. (Vector Laboratories).

Immunhisztokémia. A hasított kaszpáz-3 elleni antitestet (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) (9) és a TSA biotin rendszer kit (PerkinElmer) felhasználásával végzett immunhisztokémiai eljárást a gyártó ajánlása szerint hajtottuk végre. Az immunreaktív fehérjéket sztreptavidin-lúgos foszfatáz (PerkinElmer) alkalmazásával tettük láthatóvá, majd inkubálást Vector red alkalikus foszfatáz szubsztráttal (Vector Laboratories).

Elsődleges kondrocita kultúrák. A 18,5 napos embriók kosochondrális régióját boncoltuk és PBS-be vittük át. A kondrocitákat kollagenáz-emésztéssel izoláltuk (10), és 3x105 sejt/lyuk sűrűségben szélesztettük 0,1% zselatinnal bevont hatlyukú lemezeken (Becton Dickinson). A sejteket 25 μg/ml l-aszkorbinsavat tartalmazó DMEM/10% FBS-ben tenyésztettük. Az apoptotikus utak aktivációjának értékeléséhez a sejteket foszfáttal (NaH2PO4) kezeltük 1 mM és 7 mM közötti koncentrációban 18 órán át. A kontroll tenyészeteket 7 mM Cl - (NaCl) -val kezeltük. A kaszpáz-aktiváló molekulák felszabadulásában és az azt követő metabolikus kudarcban szerepet játszó mitokondriális permeabilitás-átmenet blokkolásához a sejteket 1 μM ciklosporin A-val (Sigma) kezelték (12).

Western Blot elemzés. Az elsődleges hipertrófiás kondrocitákat Tris-pufferolt sóoldatban lizáltuk, amely 1 mM EDTA-t, 1 mM DTT-t, 0,2% Triton X-100-t, 0,1% SDS-t és proteáz-inhibitor keveréket tartalmazott (Roche Diagnostics). Tíz mikrogramm fehérjét SDS/PAGE-nak vetünk alá redukáló körülmények között. Az immundetektálást anti-kaszpáz-9-vel (Cell Signaling Technology) végeztük. Az immunreaktív fehérjéket kemilumineszcencia detektáló készlet (NEN) segítségével tettük láthatóvá a gyártó utasításainak megfelelően.

A hipertrofikus kondrocita apoptózis szövettani elemzése és értékelése 24 napos egerekben. Megjelennek a hematoxilin/eozinnal festett szakaszok (A és C) és a TUNEL vizsgálat (B és D). (A és B) Vad típusú (WT) és VDR knockout (KO) egerek rendszeres táplálékkal (balra) vagy mentő diétával (jobbra) táplálják az ásványi ion homeosztázist. (C és D) A vad típusú egerek rendszeres táplálékkal, a Hyp egerek rendszeres táplálékkal és a vad típusú egerek magas kalcium/alacsony foszfáttartalmú étrendet tápláltak 18 és 24 napos kor között. A zárójelek a hipertrófiás kondrocita réteget jelzik. Az adatok három vagy több egér metszetén végzett kísérletek reprezentatívak az egyes állapotokhoz. EV, Evans kék; T, TUNEL.

A 24 napos Hyp egerek növekedési lemezének szövettani elemzése, az emberi rendellenesség X-hez kapcsolt hipofoszfatémiájának állatmodellje a hipertrófiás kondrocita réteg jelentős kiterjedését tárja fel (1C. Ábra). Ezek a rachitikus változások a TUNEL-pozitív késői hipertrófiás kondrociták számának jelentős csökkenésével is társultak, összehasonlítva vad típusú alomtársaikkal (1D. Ábra). Mivel a Phex gén a növekedési lemezen expresszálódik, ezen rachitikus változások patofiziológiája multifaktoriális lehet, ezért egy második modellt vizsgáltunk annak megállapítására, hogy a hipofoszfatémia önmagában vezet-e rachiták kialakulásához. A vad típusú C57BL/6J egereket 18-24 napos korban választották el foszforral korlátozott/magas kalciumtartalmú étrenden. Ezekben a vad típusú egerekben a késői hipertrófiás kondrocita réteg tágulását figyelték meg (1C. Ábra), ami a TUNEL-pozitív hipertrofikus kondrociták számának jelentős csökkenésével járt, összehasonlítva a vad típusú egerekkel, akiket rendszeresen tápláltak (1D ábra). . Ezek az adatok azt mutatják, hogy mind a három rachitikus modellben a növekedési lemez kitágulása a késői hipertrófiás kondrociták károsodott apoptózisával jár.

Ezeket a rachitikus modelleket egységesítő metabolikus paraméter a hipofoszfatémia (2A. Ábra): a Hyp egerek normális kalcium- (2B ábra) és PTH-szintje (2C ábra) a 24. napon, míg az egerek alacsony foszfor/magas -kalcium-diéta hiperkalcémiás volt, elnyomott PTH-szinttel. Mint arról korábban beszámoltunk, a vizsgált harmadik rachitikus modellben a rendszeres táplálékkal táplált VDR-null egerek hipofoszfatémiásak voltak, a PTH szintje megemelkedett a 24. napon (8).

Biokémiai paraméterek. A szérum foszfátot (A), a szérum kalciumot (B) és az immunreaktív PTH-t (C) 24 napos vad típusú egerekben mértük rendszeres táplálékkal (fekete oszlopok), Hyp egereket rendszeresen táplált étrendben (fehér oszlopok), és a vad típusú egerek magas kalcium/alacsony foszfáttartalmú étrendet tápláltak (szürke sávok). (D) A szérum foszfátszintek 18,5 nappal a postcoitum után, valamint 0,5, 10 és 24 napos korban vad típusú (♦) és Hyp (○) egerekben, akiket rendszeresen tápláltak. Az adatok öt egér értékeinek átlag ± SD-értékét mutatják minden egyes vizsgálathoz. *, P ≤ 0,05.

A hipertrófiás kondrocita apoptózis szövettani elemzése és értékelése Hyp egerekben. Hematoxilin/eozin festést (A és C) és TUNEL vizsgálatot (B és D) vad típusú (WT) és Hyp egerek metszetein hajtottunk végre 0,5 napos (A és B) és 10 napos (C és D) életkorban. A zárójelek a hipertrófiás kondrocita réteget jelzik. Az adatok három vagy több egér metszetén végzett kísérletek reprezentatívak az egyes állapotokhoz. EV, Evans kék; T, TUNEL.

Növekedési lemez mineralizációja 24 napos egerekben. von Kossa festést 24 napos vad típusú egerek rendszeres étrenddel, Hyp egerek rendszeres táplálékkal és vad típusú egerek magas kalciumtartalmú/alacsony foszfáttartalmú étrenddel 18 és 24 nap között kor. A betétek a hipertrófiás kondrociták nagyítását mutatják. A zárójelek a hipertrófiás kondrocita réteget jelzik. Az adatok öt egér metszetét reprezentálják az egyes állapotokra vonatkozóan.

A foszfátionokról kimutatták, hogy tenyésztési modellekben apoptózist indukálnak a madár kondrocitákban (15). Annak bizonyítására, hogy a kaszpáz aktiváció részt vesz a késői hipertrófiás kondrocita apoptózisban in vivo, immunhisztokémiát végeztünk a kaszpáz-3 aktiváció értékelésére rachitikus és normál növekedési lemezeken. A hasított kaszpáz-3 immunreaktivitást mutató késői hipertrófiás kondrociták százalékos aránya szignifikánsan csökkent mind a Hyp egerekben (10,4 ± 1,1%), mind az étrend okozta hipofoszfatémiás egerekben (12,5 ± 1,2%) 24 napos korban, összehasonlítva a vad típusú alomtársaik (54,2 ± 3,6%) (5. ábra). Mivel a kaszpáz-3 aktiválása a membrán és a mitokondriális apoptotikus utak közös terminális markere (16), elsődleges kondrocita tenyészetekkel boncoltuk, hogy ezek közül melyik út közvetíti a foszfátionok kondrocita apoptózisra gyakorolt ​​hatását.

Hasított kaszpáz-3 immunhisztokémia. A 24 napos vad típusú (WT) egerek szakaszait rendszeres táplálékkal etették, a Hyp egereket rendszeresen táplálták, és a magas kalcium/alacsony foszfáttartalmú étrendet tápláló egerek 18 és 24 napos kora között immunfestést kaptak a hasított kaszpáz-3. A zárójelek a hipertrófiás kondrocita réteget jelzik. Az adatok három vagy több egér metszetén végzett kísérletek reprezentatívak az egyes állapotokhoz.

A foszfát hipertrófiás kondrocita apoptózist indukál in vitro. A hipertrófiás kondrocitákat 7 mM NaCl-val vagy 7 mM NaH2PO4-tal kezeltük 18 órán át 1 μM ciklosporin A (CsA) jelenlétében vagy hiányában. A sejtlizátumokat Western-blot elemzésnek vetettük alá anti-kaszpáz-9 alkalmazásával. A 7 mM NaH2PO4-vel kezelt 3T3 fibroblasztok és proliferáló kondrociták (PC) lizátumait hasonlóan elemeztük. Az adatok reprezentatívak a három független sejtkészítményből nyert adatokkal.

A kaszpáz-3 vagy kaszpáz-9 in vivo gátlása a hipertrófiás kondrocita réteg tágulásához vezet. Megjelennek a 24 napos egerek hematoxilinnel/eozinnal festett szakaszai, amelyeket a 18–23. Napon DMSO-val, kaszpáz-3 gátlóval (Z-DEVD-FMK) vagy kaszpáz-9 gátlóval (Z-LEHD-FMK) injektáltak. A zárójelek a hipertrófiás kondrocita réteget jelzik.

Vita

Az in vitro vizsgálatok a foszfátot a kondrocita apoptózis modulátoraként vonták be. A szervetlen foszfát dózis- és időfüggő módon indukálja a kondrocita apoptózist (30). Vizsgálatunk kiterjeszti ezeket a megfigyeléseket, bemutatva a foszfát hatását a kondrocita apoptózisára in vivo. Vizsgálataink szerint a keringő foszfát helyett a lokálisan lerakódott foszfát, mint a hipertrófiás kondrocita apoptózis kulcsfontosságú meghatározója, mert károsodott apoptózist figyelnek meg, amikor a késői hipertrófiás kondrocita rétegben még mindig jelentős von Kossa festés figyelhető meg (ami mineralizációt jelez). A szöveti nemspecifikus alkalikus foszfatáz (TNAP) knockout egérrel végzett vizsgálatok, az emberi rendellenesség hypophosphatasia modellje, alátámasztják ezt a hipotézist (31). Az alkalikus foszfatáz hiánya rontja az ásványi anyagok lerakódását, így a keringő ásványi ion normális szintje ellenére a TNAP-null egerek csökkentik a csontváz mineralizációját. Kiterjesztett növekedési lemez helyett ezekben az egerekben a kondrocita differenciálódás fejlődési leállása figyelhető meg. Jelentős csökkenés tapasztalható a hipertrófiás kondrocita rétegben, annak ellenére, hogy ebben a régióban gyakorlatilag nincs mineralizáció.

Összességében a jelenlegi vizsgálatokban alkalmazott modellek alátámasztják azt a hipotézist, miszerint a keringő foszfát kulcsfontosságú meghatározója a hipertrófiás kondrocita apoptózisnak in vivo. In vitro tenyészmodellben végzett párhuzamos vizsgálatok arra utalnak, hogy a foszfát közvetlenül a hipertrófiás kondrocitákra hat, inkább a parakrin és/vagy endokrin faktorok termelését szabályozza, amelyek viszont elősegítik e sejtek apoptózisát. A hipertrófiás kondrocitákban expresszált specifikus foszfátérzékelő vagy transzporter azonosítása, amely ezekért a hatásokért felelős, kritikus következő lépés. Ennek a transzporternek a jellemzése azonosítja a keringő foszfát feltételezett küszöbének alapját, amely alatt az apoptózis károsodása figyelhető meg, valamint kritikus szerepet játszik a rachitikus rendellenességek kezelésére szolgáló potenciális terápiás szerek azonosításában.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük Paola Divieti éleslátó megjegyzéseit. Ezt a munkát a National Institute of Health támogatta a DK46974 támogatással (M.B.D.-nek) és a Yale Core Center for Musculoskeletal Diseases. Y.S. a Kanadai Egészségügyi Kutatóintézetek ösztöndíjának részesül.

Lábjegyzetek

↵ ‡ Kihez kell címezni a levelezést. E-mail: demayhelix.mgh.harvard.edu .

Szerző közreműködései: Y.S. és M.B.D. tervezett kutatás; Y.S., T.O.C. és M.B.D. végzett kutatás; T.O.C. és M.B.D. új reagensekkel/analitikai eszközökkel járult hozzá; Y.S. és M.B.D. elemzett adatok; és Y.S., T.O.C. és M.B.D. írta a lap.

Ezt a dokumentumot közvetlenül (II. Szám) nyújtották be a PNAS irodához.

Rövidítések: 1,25 (OH) 2D, 1,25-dihidroxi-D-vitamin; VDR, D-vitamin receptor; PTH, mellékpajzsmirigy hormon.