A hosszú távú hipoxia hatása a szénhidrát-anyagcsere enzimjeire az öböl killifish-jében, Fundulusban

ÖSSZEFOGLALÁS

Bevezetés

A teleost halak gazdag evolúciós története és jelenlegi ökológiai sokfélesége miatt ennek a csoportnak a vizsgálata különösen informatív volt az állatok hipoxiára adott reakcióinak tisztázásában (Nikinmaa és Rees, 2005). Ezek a válaszok magukban foglalják a hipoxiás területek elkerülésére, a jól szellőztetett mikrokörnyezet kihasználására vagy az aktivitás csökkentésére irányuló viselkedést (Kramer, 1987; Van den Thillart és mtsai, 1994; Dalla Via és mtsai, 1998; Wannamaker és Rice, 2000); fiziológiai és morfológiai kiigazítások, amelyek javítják az oxigén kivonását és a szövetekbe juttatását (Jensen et al., 1993; Sollid et al., 2003); és biokémiai változások, amelyek növelik a szövetek alacsony oxigénellátással való működési és túlélési képességét (Hochachka, 1980; Van den Thillart és Van Waarde, 1985; Hochachka és Somero, 2002). Általánosságban elmondható, hogy ez a válaszcsomag a környezeti oxigénellátás csökkenésének kompenzálását szolgálja, és hipoxiatoleranciát eredményez, amely egyes fajokban meglehetősen markáns.

A hipoxiára adott egyik biokémiai válasz az anaerob ATP termelés növekedése, jellemzően glikolízissel (Van den Thillart és Van Waarde, 1985; Dalla Via és munkatársai, 1994; Virani és Rees, 2000). Számos tanulmány azt mutatja, hogy a hipoxiás expozíció növeli a glikolitikus enzimek aktivitását, amelyek feltehetően növelik a halszövetek anaerob energiatermelési képességét (Greaney et al., 1980; Johnston és Bernard, 1982; Van den Thillart és Smit, 1984; Dickson és Graham, 1986; Lushchak és mtsai, 1998; Zhou és mtsai, 2000; Kraemer és Schulte, 2004). Ezeket a növekedéseket azonban nem figyelték meg egységesen a glikolitikus enzimek, a szövetek vagy a fajok között. Például a killifish, a tench és az aranyhal hipoxiás expozíciója miatt egyes glikolitikus enzimek aktivitása megnövekedett a májban, a fehér vázizomzatban azonban nem (Greaney et al., 1980; Johnston és Bernard, 1982; Van den Thillart és Smit, 1984 ). Ezzel ellentétes tendenciát, az izomban az enzimaktivitás fokozódását és a májban bekövetkező változásokat nem figyelték meg Hoplias microlepis-ben (Dickson és Graham, 1986). Más fajok szöveteiben az enzimaktivitások változatlanok maradtak (Shaklee et al., 1977; Driedzic et al., 1985), vagy csökkentek a hipoxiás expozíció során (Almeida-Val et al., 1995). Ezenkívül a fenti vizsgálatok egy kivételével az összes csak a glikolízis enzimek egy részének adatairól számol be (csak egy vagy kettő). Az egyetlen vizsgálat, amely az összes glikolitikus enzimet megmérte, csak egy szövetben, a májban végezte el, és az enzimek fokozott aktivitását állapította meg, amelyek az egyensúlyhoz közeli reakciókat katalizálják, de az egyensúlytól távol eső reakciókat katalizálók esetében nem (Kraemer és Schulte, 2004).

Ezek a mérések lehetővé tették számunkra a következő kérdések megválaszolását a krónikus hipoxia hatásáról a különféle szövetek metabolikus potenciáljára az F. grandis-ban. A különböző szövetek hasonlóan reagálnak a hipoxiás expozícióra? Változik-e az összes enzim egy adott útvonalon (glikolízis) összehangolva (azaz ugyanabba az irányba és ugyanolyan nagyságrendben)? Végül egyetlen szövetben (májban) a katabolikus és anabolikus folyamatok képességei hasonlóan vagy eltérően reagálnak a krónikus hipoxiára? Az eredmények azt mutatják, hogy amikor az intakt halakat hosszan tartó hipoxiához igazítják, az enzimaktivitások szövetspecifikusan reagálnak, és hogy egy szöveten belül az enzimaktivitás változásai nem egyenletesen oszlanak el az anyagcsere útján.

Anyagok és metódusok

Állatok

A halakat jóllakottan fagyasztott sós sós garnélával (Artemia spp., San Francisco Bay Brand, Newark, Kalifornia, USA), Prime Tropical Flakes-szel (Ziegler Brothers, Inc., Gardners, PA, USA) és sós garnélarák naupli-vel (OSI, Snowville, UT, USA) naponta kétszer. Az étrendet 2 hét múlva élő fűrákra (Palaemonetes spp.) Változtatták. Az expozíció kezdetén a két kezelés során a halak standard hosszúságúak voltak (normoxia, 80,7 ± 6,7 mm; hipoxia 79,9 ± 4,6 mm) és tömegben (normoxia, 10,8 ± 3,2 g; hipoxia 10,0 ± 2,3 g). Mindkét csoport nőtt a 4 hetes expozíció alatt, bár a normoxikus halak többet nőttek, mint a hipoxiás halak (C. A. Landry, S. L. Steele, S. Manning és A. O. Cheek, publikálásra benyújtott kézirat). Következésképpen a normoxikus halak hosszabbak voltak (normoxia, 84,8 ± 6,9 mm; hipoxia, 80,7 ± 5,3 mm; P≤0,05) és nehezebbek (normoxia, 15,2 ± 3,6 g; hipoxia, 11,7 ± 2,3 g; P≤0,01), mint a hipoxiás halak a kísérlet vége.

Kivonat készítése

Négy hét normoxia vagy hipoxia hatásának kitéve a hálókat hálóba kötöttük és pufferolt MS-222 (1 g MS-222 és 4 g NaHCO3/liter víz) túladagolásával megöltük. A májat, az agyat, a szívet és a fehér vázizmokat feldaraboltuk, folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, és az elemzésig -80 ° C-on tároltuk. A vázizom mintákat dorzálisan vettük az oldalsó vonalig, a vörös izom elkerülése érdekében, valamint a fej és a háti uszony között, hogy elkerüljük az enzimaktivitás hosszanti változását (Martínez et al., 2000).

A glikolitikus és glükoneogén enzimvizsgálatokhoz a szöveteket lemértük és jéghideg pufferben homogenizáltuk, amely 100 mmol 1 Hepes-t (pH 7,4), 10 mmol 1 -1 KCl, 0,1 mmol 1 -1 DTT és 0,2% Triton X-100-at tartalmaz. (Pierce és Crawford, 1997) PRO 200 homogenizátorral (PRO Scientific Inc., Connecticut, USA) két 20 másodpercig. A mintákat jégen tartottuk a homogenizálás ideje alatt és között. Az izom-, máj- és agymintákat kilenc térfogatnyi pufferben homogenizáltuk; a szíveket 49 térfogat pufferben homogenizáltuk. A homogenátumokat 2400 ° C-on centrifugáltuk g 15 percig 4 ° C-on, és a felülúszó oldatokat jégen tartjuk, amíg az enzimaktivitás meg nem mérhető.

Külön glikogenátumokat készítettünk a glikogén-szintáz és a glikogén-foszforiláz vizsgálatához. Ehhez a májat és a fehér izmokat lemérjük, és négy térfogat jéghideg pufferben homogenizáljuk, amely 50 mmol l -1 imidazolt (pH 7,5), 100 mmol l -1 NaF, 5 mmol l -1 EDTA, 5 mmol l -1 EGTA tartalmaz 15 mmol 1 -1 p-merkaptoetanol és 0,1 mmol 1 fenil-metil-szulfonil-fluorid (PMSF) (Milligan, 2003). A mintákat PRO 200 homogenizátorral két 20 másodpercig homogenizáltuk, miközben hidegen tartottuk. Ezeket a homogenizátumokat 16 000-nél centrifugáltuk g 2 percig 4 ° C-on, és a felülúszókat jégen tartottuk, amíg az enzimaktivitás meg nem volt.

Enzimvizsgálatok

A glikolitikus enzimaktivitások meghatározásának reakciókörülményeit Pierce és Crawford alapján módosítottuk (Pierce és Crawford, 1994). Az egyes szövetekben lévő enzimek esetében a szubsztrátok, a kofaktorok és az összekötő enzimek koncentrációját optimalizálták a maximális aktivitás érdekében. A reakciókat az enzimre specifikus szubsztrát hozzáadásával indítottuk (minden reakciónál utoljára mutatjuk be). A reakció végső körülményei a következők voltak.

Hexokináz (HK; EC 2.7.1.1): 100 mmol 1 Hepes (pH 7,4), 10 mmol 1 -1 KCl, 7,5 mmol 1 -1 MgCl2, 3,1 mmol 1 -1 ATP, 1 mmol 1 -1 NADP, 10 mmol l -1 kreatin-foszfát, 2 NE ml -1 kreatin-kináz, 1 i.u. ml -1 glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz és 7,5 mmol 1 -1 glükóz. Ilyen körülmények között a glükokináz (IV típusú hexokináz) hozzájárul a májszövetben mért sebességhez.

Foszfoglükoizomeráz (PGI; EC 5.3.1.9): 100 mmol 1 Hepes (pH 7,4), 10 mmol 1 -1 KCl, 1,25 mmol 1 -1 NADP, 0,5 i.u. ml -1 glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz és 2 mmol 1 -1 fruktóz-6-foszfát.

Foszfofruktokináz (PFK; EC 2.7.1.11): 100 mmol l -1 Hepes (pH 8,2), 10 mmol l -1 KCl, 7,5 mmol l -1 MgCl2, 1,25 mmol l -1 ATP (máj, agy, szív) vagy 2,5 mmol l -1 ATP (izom), 5 mmol l -1 AMP, 0.2 mmol l -1 NADH, 1 NE ml -1 aldoláz, 10 i.u. ml -1 glicerin-3-foszfát-dehidrogenáz, 29 i.u. ml -1 trióz-foszfát-izomeráz és 5 mmol l -1 fruktóz-6-foszfát (máj, agy, szív) vagy 10 mmol l -1 fruktóz-6-foszfát (izom).

Aldoláz (ALD; EC 4.1.2.13): 100 mmol 1 Hepes (pH 7,4), 10 mmol 1 -1 KCl, 0,2 mmol 1 -1 NADH, 5 i.u. ml -1 glicerin-3-foszfát-dehidrogenáz, 14,5 i.u. ml -1 trióz-foszfát-izomeráz és 0,75 mmol 1 -1 fruktóz-1,6-biszfoszfát.

Trióz-foszfát-izomeráz (TPI; EC 5.3.1.1): 100 mmol 1 Hepes (pH 7,4), 10 mmol 1 -1 KCl, 0,2 mmol 1 -1 NADH, 10 i.u. ml -1 glicerin-3-foszfát-dehidrogenáz (izom, máj, szív) vagy 20 i.u. ml -1 glicerin-3-foszfát-dehidrogenáz (agy) és 2,9 mmol l -1 glicerinaldehid-3-foszfát (izom, máj, agy) vagy 5,8 mmol l -1 glicerin-aldehid-3-foszfát (szív).

Gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH; EC 1.2.1.12): 100 mmol l -1 Hepes (pH 7,4), 10 mmol l -1 KCl, 2 mmol l -1 MgCl2 (izom, agy, szív) vagy 1 mmol l -1 MgCl2 (máj), 3,1 mmol l -1 ATP (izom, agy, szív) vagy 1,55 mmol l -1 ATP (máj), 0,2 mmol l -1 NADH, 8 NE ml -1 foszfoglicerokináz és 2,8 mmol 1 -1 3-foszfoglicerát.

Foszfoglicerokináz (PGK; EC 2.7.2.3): 100 mmol 1 Hepes (pH 7,4), 10 mmol 1 -1 KCl, 10 mmol 1 -1 MgCl2, 3,1 mmol 1 -1 ATP (máj, agy, szív) vagy 6,2 mmol l -1 ATP (izom), 0,2 mmol l -1 NADH, 8 NE ml -1 glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz és 2,8 mmol l -1 3-foszfoglicerát.

Foszfogliceromutáz (PGM; EC 2.7.5.3): A máj, az agy és a szív esetében a vizsgálat 100 mmol 1 Hepes-t (pH 7,4), 10 mmol 1 -1 KCl, 5 mmol 1 -1 MgCl2, 0,65 mmol 1 ADP, 0,125 mmol l -1 2,3-biszfoszfo-glicerát, 0,22 mmol l -1 NADH, 9 mmol l -1 glükóz, 0,1 NE ml -1 enoláz, 0,5 i.u. ml -1 piruvát-kináz, 0,75 i.u. ml -1 l-laktát-dehidrogenáz, 3,2 i.u. ml -1 hexokináz és 1,25 mmol 1 -1 3-foszfoglicerát. Izom esetében a fenti körülményeket alkalmaztuk, kivéve, ha az MgCl2 2,5 mmol l -1, az ADP 1,25 mmol l -1, a 2,3-biszfoszfoglicerát 62,5 μmol l -1 és a glükóz 5 mmol l -1 volt. .

Enoláz (ENO; EC 4.2.1.11): 100 mmol l -1 Hepes (pH 7,4), 10 mmol l -1 KCl, 2,5 mmol l -1 MgCl2, 1,3 mmol l -1 ADP (izom, máj, agy) vagy 0,65 mmol 1 -1 ADP (szív), 0,2 mmol 1 -1 NADH, 4,5 mmol 1 -1 glükóz, 0,6 NE ml -1 piruvát-kináz, 0,75 i.u. ml -1 l-laktát-dehidrogenáz, 1,6 i.u. ml -1 hexokináz (izom, máj, agy) vagy 3,2 i.u. ml -1 (szív) és 1,25 mmol l -1 2-foszfoglicerát.

Piruvát-kináz (PYK; EC 2.7.1.40): 100 mmol l -1 Hepes (pH 7,4), 10 mmol l -1 KCl, 10 mmol l -1 MgCl2 (izom és máj) vagy 5 mmol l -1 MgCl2 (agy és szív), 7,6 mmol l -1 ADP (izom és máj) vagy 3,8 mmol l -1 ADP (agy és szív), 0,2 mmol l -1 NADH, 1,5 NE ml -1 l-laktát-dehidrogenáz (izom), 0,375 i.u. ml -1 l-laktát-dehidrogenáz (máj és szív), vagy 0,75 i.u. ml -1 l-laktát-dehidrogenáz (agy) és 1 mmol l -1 foszfoenol-piruvát (izom, máj, agy) vagy 2 mmol l -1 foszfoenol-piruvát (szív).

Laktát-dehidrogenáz (LDH; EC 1.1.1.27): 100 mmol 1 Hepes (pH 7,4), 10 mmol 1 -1 KCl, 0,17 mmol 1 -1 NADH, 1 mmol 1 -1 piruvát.

A glikogén anyagcsere enzimjeinek vizsgálati feltételeit Milligan (Milligan, 2003) módosította.

Glikogén-szintáz (GSase; EC 2.4.1.11): 50 mmol 1 Tris (pH 7,8), 70 mmol 1 -1 KCl, 4 mmol 1 -1 MgCl2, 0,5 mmol 1 -1 foszfoenolpiruvát, 0,2 mmol 1 -1 NADH, 5 iu ml -1 l-laktát-dehidrogenáz, 5 i.u. ml -1 piruvát-kináz, 2 mg ml -1 glikogén (osztriga izom, dializált) és 2 mmol 1 -1 UDP-glükóz. A teljes GSase aktivitást 5 mmol 1 -1 glükóz-6-foszfát jelenlétében vizsgáltuk. Az aktív GSase-t glükóz-6-foszfát nélkül mértük.

Glikogén-foszforiláz (GPase; EC 2.4.1.1): 50 mmol l -1 kálium-foszfát (pH 7,3), 15 mmol l -1 MgSO4, 0,5 mmol l -1 DTT, 0,5 mmol l -1 NADP, 0,25 mmol l -1 EDTA, 1 iu ml -1 glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz, 1 i.u. ml -1 foszfoglükomutáz, 0,01 mmol l -1 glükóz 1,6-biszfoszfát és 2 mg ml -1 glikogén (laskagomba, dializált). A teljes GPase aktivitást 2 mmol 1 -1 AMP jelenlétében mértük. Az aktív GPase-t AMP nélkül mértük.

A glükoneogén enzimek vizsgálati körülményeit standard protokollok alapján módosítottuk.

Malát-dehidrogenáz (MDH; EC 1.1.1.37): 100 mmol 1 Hepes (pH 7,4), 10 mmol 1 -1 KCl, 0,175 mmol 1 -1 NADH és 0,1 mmol 1 -1 oxaloacetát (Mommsen et al., 1980).

Foszfoenol-piruvát-karboxi-kináz (PEPCK; EC 4.1.1.32): 100 mmol 1 Hepes (pH 7,4), 10 mmol 1 -1 KCl, 10 mmol 1 -1 foszfoenolpiruvát, 0,5 mmol 1 -1 inozin-difoszfát, 5 mmol 1 -1 MnCl2 0,15 mmol 1 NADH, 0,3 NE ml -1 malát-dehidrogenáz és 20 mmol 1 -1 NaHCO3 (Opie és Newsholme, 1967). A PEPCK vizsgálat optimalizálásakor az inozin-difoszfátot (IDP) és a 2-dezoxi-guanozin-5′-foszfátot (2-dGDP) hasonlították össze (Foster és Moon, 1990), mint foszforilcsoport-akceptorokat. IDP esetén a háttérarányok (NaHCO3 nélkül) alacsonyabbak voltak, és a fajlagos arányok (NaHCO3 esetén) magasabbak voltak, mint a 2-dGDP esetében. A kapott PEPCK aktivitás 50% -kal volt nagyobb IDP-vel, mint a foszforilcsoport-akceptor. A nagyobb aktivitás nem következhet be a versengő piruvát kináz aktivitásból, mert a PEPCK vizsgálatot NaHCO3-mal indítják.

Fruktóz-1,6-biszfoszfatáz (FBPáz; EC 3.1.3.11): 100 mmol 1 Hepes (pH 7,4), 10 mmol 1 -1 KCl, 2 mmol 1 -1 MgCl2, 1 mmol 1 -1 EDTA, 0,2 mmol l -1 NADP, 1,6 m ml -1 foszfoglükóz-izomeráz, 0,36 i.u. ml -1 glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz és 0,05 mmol l -1 fruktóz-1,6-biszfoszfát (Opie és Newsholme, 1967).

Glükóz-6-foszfatáz (G6Páz; EC3.1.3.9): 100 mmol 1 Hepes (pH 6,5), 10 mmol 1 -1 KCl, 26,5 mmol 1 -1 glükóz 6-foszfát, 1,8 mmol 1 -1 EDTA, 2 mmol 1 -1 NAD, 1 NE ml -1 mutarotáz, 20 i.u. ml -1 glükóz-dehidrogenáz (Alegre és mtsai., 1988). Ezt a vizsgálatot kivonat hozzáadásával kezdtük meg.

A maximális enzimaktivitásokat négy ismétlésben mértük 96 lyukú mikrolemez leolvasási spektrofotométerben (VERSAmax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 27 ± 1 ° C-on. A reakció sebessége lineáris volt ≥3 percig. A vak reakciókból származó (szubsztrát nélküli) arányokat levontuk az enzimaktivitások minden meghatározásához. Az enzimaktivitás egységeit (i.u.) úgy határoztuk meg, mint az enzim mennyiségét, amely szükséges ahhoz, hogy 1 μmol szubsztrát termékké alakuljon át 1 perc alatt ilyen körülmények között. A NAD (P) H millimoláris extinkciós együtthatójaként a 6.22 értéket használtuk. Valamennyi enzimaktivitást a szövet homogenizációjától számított 5 órán belül mértük.

A biokémiai anyagokat és a kapcsolóenzimeket a Sigma Chemical Co.-tól (St Louis, MO, USA), a Roche Diagnostics Corporation-től (Indianapolis, IN, USA) vagy a Calzyme Laboratories, Inc.-től (San Luis Obispo, CA, USA) szereztük be. Ha szükséges az ammónium-szulfát feleslegének eltávolításához, a kapcsolóenzimeket 12 000-nél centrifugáltuk g 10 percig, majd feloldjuk vizsgálati pufferben [100 mmol 1 Hepes (pH 7,4), 10 mmol 1 -1 KCl].

Fehérje vizsgálat

A szöveti homogenizátumok felülúszó frakcióinak fehérjetartalmát a bicinchonininsav-vizsgálattal (Smith és mtsai., 1985; Brown és mtsai., 1989) határoztuk meg, amelyet 96 lyukú mikrolemez-leolvasó spektrofotométerben alkalmaztunk. A mintákat vízzel kb. 0,5 mg ml -1 koncentrációra hígítottuk. Négyszeres 10 μl mintát adtunk 200 μl bicinchonininsav munkareagenshez (Pierce Biochemicals, Rockford, IL, USA) egy 96 üreges mikrolemez egyes lyukaiban. A lyukakat lezártuk, és a lemezt 60 ° C-on inkubáltuk 30 percig. Szobahőmérsékletre lehűlés után a lemezt 562 nm-en leolvassuk. Minden lemezhez 0-1 mg ml -1 szarvasmarha szérum albumint használtunk.

Számítások és statisztikai elemzések

Eredmények

Szövetenzim aktivitások

A hipoxia hatása az enzimspecifikus aktivitásokra

A hipoxia megváltoztatta a glikolitikus enzimek aktivitását a fehér vázizomban, a májban, a szívben és az agyban; az érintett enzimek és a hipoxia-válasz iránya azonban szövetspecifikus volt (1. táblázat; 1. ábra). A hipoxiás expozíció a fehér vázizomzatban mért tíz glikolitikus enzim közül nyolc közül szignifikánsan alacsonyabb specifikus aktivitást eredményezett (P≤0,05; 1A. Ábra). A tevékenységek 17% -kal (PGM) 55% -ra (ENO) csökkentek. A két másik enzim (GAPDH és PGK) alacsonyabb volt a hipoxiában, mint a normoxiában, bár ezek a különbségek statisztikailag nem voltak szignifikánsak. A HK enzim a vázizomzat kimutatási határa alatt volt. A vázizomzatban fellépő hipoxia hatásával ellentétben a májban mért 11 glikolitikus enzim közül ötnél a hipoxiás expozíció fokozta az aktivitását (P≤0,05; 1B. Ábra). Az aktivitás 19% -kal (PGI) 74% -kal (PGK) volt nagyobb a hipoxiában. Szívében három glikolitikus enzim specifikus aktivitása magasabb volt a hipoxiával kitett halakban (P≤0,05; 1C. Ábra), 18% (TPI) és 28% (HK) növekedés között. Az agyban a hipoxia maximális enzimaktivitásra gyakorolt hatása kisebb volt és irányukban vegyes volt: három glikolitikus enzim aktivitása magasabb volt a hipoxiának kitett halak agyában, míg egynél alacsonyabb volt az aktivitás (P≤0,05; 1D ábra). A százalékos változások 12% -kal alacsonyabb (PGM) és 16% -kal magasabb (HK) között voltak hipoxiában.

Glikolitikus enzimspecifikus aktivitások (azaz mg mg –1 fehérje) a Fundulus grandis szövetében, normál és csökkent oxigénszint mellett, 4 hétig 27 ° C-on.

A glikogén-anyagcsere enzimjeinek (azaz i.u. mg –1 fehérje) specifikus aktivitása a Fundulus grandis szöveteiben normál és csökkentett oxigénszint mellett 4 hétig 27 ° C-on.

A glükoneogenezisben részt vevő enzimek specifikus aktivitását csak a májban mérték (3. táblázat; 3. ábra). Az MDH citromsavciklus enzim katalizálja az oxaloacetát reverzibilis átalakulását maláttá, ami fontos lehet a glükoneogenezis során, mint mechanizmus arra, hogy a redukciós ekvivalenseket és szénvázakat a mitokondriumból a citoszolba juttassa. Ez az enzim szignifikánsan magasabb volt a hipoxiának kitett halakban (P≤0,05). Az FBPáz enzim katalizálja a fruktóz-1,6-biszfoszfát átalakulását fruktóz-6-foszfáttá, megkerülve a PFK által katalizált glikolitikus reakciót, és hipoxiás halakban is magasabb volt (P≤0,05). Mindkét enzim körülbelül 25% -kal magasabb volt a hipoxiában. A glükoneogenezis két másik enzime, a PEPCK és a G6Pase nem különbözött a normoxikus és a hipoxiás halak között.