A joghurt baktériumok túlélése az emberi bélben

Marina Elli

AAT-Advanced Analytical Technologies S.r.l., 29100 Piacenza, Olaszország, 1 Centro Ricerche Biotecnologiche, 26100 Cremona, Olaszország, 2 Danone Vitapole, Nutrivaleur, 91767 Palaiseau Cedex, Franciaország 3

Maria Luisa Callegari

Susanna Ferrari

Elena Bessi

Daniela Cattivelli

Sara Soldi

Lorenzo Morelli

Nathalie Goupil Feuillerat

Jean-Michel Antoine

Absztrakt

A Lactobacillus delbrueckii subsp. A bulgaricus és a Streptococcus thermophilus kinyerhető, miután az emberi bélen átjutottunk 20 egészséges önkéntes kereskedelmi joghurttal. Joghurt baktériumokat találtak az emberi ürülékben, ami arra utal, hogy túlélhetik a gyomor-bél traktusban való átjutást.

Joghurt, amelyet a Lactobacillus delbrueckii subsp. A bulgaricus és a Streptococcus thermophilus régóta jótékony hatással van az emberek jólétére. Néhány cikkben a dolgozók arra koncentráltak, hogy a joghurt-tenyészetek egyedül tudományosan dokumentáltan befolyásolják a bél anyagcseréjét (1, 23). A joghurt baktériumokról kiderült, hogy javítják a laktóz emésztést laktóz-intoleráns egyéneknél (16, 17, 20, 21, 27), befolyásolják a béltranzit időt (11) és stimulálják a bél immunrendszerét (2, 14, 31), bár néhány szerző nem tudta megerősíteni ezeket a következtetéseket (5, 6, 35). A joghurt kezdők immunstimuláló tulajdonságainak immunológiai és genetikai alapjait is megvizsgálták (8, 15).

Mindazonáltal e tanulmányok tudományos háttere és a „probiotikum” kifejezés alkalmazása az indító baktériumok L. delbrueckii subsp. a bulgaricus és a S. thermophilus továbbra is erősen vitatott (13, 33). Amint azt Guarner et al. (13), a legújabb tudományos fejlemények megkérdőjelezték a probiotikumokra hagyományosan javasolt in vitro szelekciós kritériumok érvényességét és hasznosságát.

A hagyományos joghurt kezdők nem emberi eredetűek, és ezekről (különösen a streptococcusokról) ismert, hogy gyomorsavnak vannak kitéve (7), és mérsékelten képesek tapadni a bél hámsejtjeiben (12).

A gyomor-bél traktuson való áthaladás során a túlélést általában a probiotikumok kulcsfontosságú tulajdonságának tekintik, hogy megőrizzék várható egészségfejlesztő hatásukat (3).

Ellentmondásos tanulmányok történtek az L. delbrueckii subsp. bulgaricus és S. thermophilus ürülékmintákból napi joghurt lenyelés után. Egyes szerzők arról számoltak be, hogy az L. delbrueckii subsp. A bulgaricust és az S. thermophilust nem sikerült kinyerni fiatal (9) és idős (26) alanyok ürülékéből. Másrészt Brigidi és mtsai. (4) arról számoltak be, hogy a kezelés befejezése után 6 napig 10 egészséges alany székletmintáiból nyerték ki a S. thermophilus-t, akik 3 napig szájon át fogyasztottak egy gyógyszerkészítményt. A joghurt kultúra emberi bélben való fennmaradását Mater et al. (22), aki 13 egészséges önkéntest vizsgált, akik joghurtot tápláltak rifampin- és streptomicin-rezisztens S. thermophilus és L. delbrueckii subsp. bulgaricus.

A tanulmány célja az életképes L. delbrueckii subsp. bulgaricus és S. thermophilus 20 egészséges önkéntes ürülékmintáiból 1 hétig kereskedelmi joghurtot táplált.

Vizsgálatunkba 10 férfi és 10 egészséges nő vett részt, akiknek átlagos életkora 32,3 év volt. Ezek az alanyok 125 g kereskedelmi joghurtot (Bianco Naturale; Danone) ettek naponta kétszer, 1 héten keresztül. Az önkénteseket, akiket két, 10 alanyból álló csoportba osztottak, egyszer megvizsgáltuk, hogy meghatározzuk a joghurt kultúrák perzisztenciáját a székletmintákban.

Két egymást követő vizsgálatot (1. és 2. kísérlet) egyenként 10 alanydal hajtottak végre. Az önkénteseknek a vizsgálatok megkezdése előtt 2 hétig tartózkodniuk kellett a joghurt és a friss tejtermékek fogyasztásától. A joghurtból származó baktériumok napi bevitele, amely 2,4 × 107 CFU/g L. delbrueckii subsp. bulgaricus és 2,0 × 108 CFU/g S. thermophilus, körülbelül 6 × 109 CFU volt az L. delbrueckii subsp. bulgaricus és 5 × 10 10 CFU S. thermophilus.

Az egyes vizsgálatok kezdetén (nulla idő) és 2 és 7 nap elteltével kapott székletmintákat legfeljebb 12 órán át 4-8 ° C-on tároltuk. 1 g székletmintát tizedesen hígítottunk steril sóoldattal, és az 1. vizsgálat során sovány tejközegre (RSMA) (Difco, BD, Sparks, Md.) Terítettük. A 2. kísérletben az RSMA-t 0,05% ruténium vörös festékkel egészítettük ki. (Sigma, St. Louis, Mo.) módosított RSMA (m-RSMA) előállításához. Mindkét esetben a lemezeket 48 órán át 44 ° C-on inkubáltuk.

Ebben a tanulmányban nagy hangsúlyt fektettek a laktobacillusok és a streptococcusok megbízható és reprodukálható székletben történő kimutatására alkalmas táptalaj kiválasztására. Meghatároztuk az RSMA azon képességét, hogy egyértelműen megkülönböztethető telepek növekedését támogassa, és ennek a táptalajnak a teljesítményét finomítottuk ruténium-vörös festékkel (24) (m-RSMA), ami lehetővé tette számunkra, hogy világosan megkülönböztessük a kis Enterococcusok fehér halóit telepek a Lactobacillus és a Streptococcus telepek rózsaszínű halóiból. Hosszan tartó, 44 ° C-on végzett inkubálás után az m-RSMA lemezeken lévő telepek a streptococcusok esetében rózsaszínről fukszia, a laktobacillusok esetében pedig a régi rózsáról sárgára váltak, ami lehetővé tette számunkra a kezelt önkéntesek székletmiklórájának előzetes szűrését és az izolátumok számának csökkentését. molekuláris eszközökkel azonosítják.

A 2. és a 7. napon Lactobacillus- és Streptococcus-szerű morfológiájú telepeket replikáztuk, az első olvasható lemezről kinyert telepek 10% -át felhasználva MRS táptalajra (Difco, Detroit, Mich.) És LM17 táptalajra (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, Egyesült Királyság), inkubáltuk 44 ° C-on 48 órán át, és közvetlenül lizáltuk a MicroLYSIS-szel (Microzone Ltd., Haywards Heath, West Sussex, Egyesült Királyság). A lizált szuszpenziókat templátként használtuk faj- és törzsspecifikus PCR-ekben.

L. delbrueckii subsp. Az amplifikációs kísérletekben kontrollként használt bulgaricus és S. thermophilus törzseket kereskedelmi joghurtból izoláltuk RSMA lemezeléssel, és taxonómiai azonosságukat molekuláris eszközökkel megerősítettük.

Háromlépcsős azonosítási protokollt alkalmaztak az L. delbrueckii subsp. szelektív táptalajon tenyésztett bulgaricus-szerű telepek, az SS1 és DB1 (10) primerek alkalmazásával az L. delbrueckii fajokhoz, valamint a 34/2 és 37/1 (18) primerek az L. delbrueckii subsp. bulgaricus és a korábban leírt kerékpáros körülmények. A 2. és a 7. nap telepei, amelyek megadták a várt amplikon méretet Lick és munkatársai PCR-primereivel. A (18) csoportot ezután ismétlődő extragén palindróm PCR (Rep-PCR) technikával analizáltuk GTG5 primer alkalmazásával, Versalovic és mtsai. (32), joghurtot fogyasztó és szájon át L. delbrueckii subsp. bulgaricus izolátumok.

Kétlépcsős azonosítási protokollt alkalmaztak a S. thermophilus-szerű kolóniák esetében, amelyek a lacZ-géntől felfelé és lefelé irányuló primereket vonták be (19). Azokat az izolátumokat, amelyekről kiderült, hogy S. thermophilus izolátumok, pulzáló mező gélelektroforézissel (PFGE) elemeztük, mivel nem voltak megbízható PCR primerek, amelyek meg tudták különböztetni az emberi szájüregben jelen lévő, szorosan rokon S. thermophilus és Streptococcus salivarius fajokat ( 28, 34). Az O'Sullivan és Fitzgerald (25) leírása szerint kapott SmaI által emésztett kromoszómák profiljait összehasonlítottuk a törzs azonosságainak meghatározása érdekében.

Molekuláris biológiai eszközöket használtak az orálisan beadott joghurt törzsek törzsspecifikus azonosítására, amelyeket korábban RSMA-ra (1. kísérlet) és m-RSMA-ra (2. kísérlet) terített székletmintákból izoláltak. Az ezen táptalajon elért összes számlálás eredményeként mindkét kísérletben 107 életképes sejt/g (friss tömeg) széklet koncentrációja volt a joghurt fogyasztása előtt (nulla idő). Ezenkívül jelentős számnövekedést figyeltek meg, különösen a 2. kísérletben, 1 hét joghurtfogyasztás után (7. nap) 10 önkéntes közül 4 esetében, akiknek a kezdeti száma ebben a táptalajban nagyon alacsony volt (kb. 103 CFU/g [friss tömeg) ] széklet).

A L. delbrueckii subsp. A nulla időpontban kapott székletmintákból származó bulgaricus és S. thermophilus törzseket megvizsgáltuk és megerősítettük (az adatokat nem közöljük).

Életképes joghurt törzsek visszanyerése az 1. kísérletben.

1 hetes kezelés után 41 széklet izolátumot PCR-elemzésnek vetettek alá L. delbrueckii fajspecifikus primerekkel, amely L. delbrueckii subsp. bulgaricus 35 esetben 10 önkéntesből 6 bevonásával, az 1. táblázatban bemutatott módon. 1. Az életképes L. delbrueckii subsp. A bulgaricus CFU-t a székletmintákban a 2. táblázat mutatja .

ASZTAL 1.

L. delbrueckii subsp. bulgaricus és S. thermophilus a székletmintákból joghurt lenyelése után