A kereskedelmi alpesi tejelő tehenek nyersteje és székletmikrobiota az állománytól, a zsírtartalomtól és az étrendtől függően változik

Szerepek konceptualizálás, formális elemzés, finanszírozás megszerzése, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

Jelenlegi cím: Szőlészeti és Borászati Tanszék, Borbiotechnológiai Intézet, Stellenbosch Egyetem, Matieland, Dél-Afrika

Biológiai Sokféleség és Molekuláris Ökológia Tanszék, Kutatási és Innovációs Központ, Fondazione Edmund Mach, San Michele all’Adige, Trento, Olaszország, Állatorvos-tanszék, Milánói Egyetem, Milánó, Olaszország

Szerepek írása - áttekintés és szerkesztés

Biológiai Sokféleség és Molekuláris Ökológia Tanszék, Kutatási és Innovációs Központ, Fondazione Edmund Mach, San Michele all’Adige, Trento, Olaszország, Biológiai Tanszék, Firenze Egyetem, Sesto Fiorentino, Firenze, Olaszország

Szerepek Adatkúra, formális elemzés, szoftver, vizualizáció, írás - áttekintés és szerkesztés

Számítási Biológia, Kutatási és Innovációs Központ tagsági egysége, Fondazione Edmund Mach, San Michele all’Adige, Trento, Olaszország

Szerepek Formális elemzés, írás - áttekintés és szerkesztés

Biológiai Sokféleség és Molekuláris Ökológia Tanszék, Kutatási és Innovációs Központ, Fondazione Edmund Mach, San Michele all’Adige, Trento, Olaszország

Szerepek Módszertan, írás - áttekintés és szerkesztés

Társulástechnológiai Transzfer Központ, Fondazione Edmund Mach, San Michele all’Adige, Trento, Olaszország

Szerepek Formális elemzés, írás - áttekintés és szerkesztés

Biológiai Sokféleség és Molekuláris Ökológia Tanszék, Kutatási és Innovációs Központ, Fondazione Edmund Mach, San Michele all’Adige, Trento, Olaszország

Szerepek Formális elemzés, módszertan

Biológiai Sokféleség és Molekuláris Ökológia Tanszék, Kutatási és Innovációs Központ, Fondazione Edmund Mach, San Michele all’Adige, Trento, Olaszország

Gyümölcsnövények genomikai és biológiai osztálya, Kutatási és Innovációs Központ, Fondazione Edmund Mach, S. Michele all ’Adige (TN), Trento, Olaszország

Szerepek Formális elemzés, szoftver, írás - áttekintés és szerkesztés

Számítási Biológia, Kutatási és Innovációs Központ tagsági egysége, Fondazione Edmund Mach, San Michele all’Adige, Trento, Olaszország

Szerepek Finanszírozás megszerzése, Vizsgálat, Írás - eredeti tervezet

Orvosbiológiai, Sebészeti és Fogászati Tudományok Tanszéke, Milánói Egyetem, Milánó, Olaszország

Szerepek Finanszírozás megszerzése, Felügyelet, Írás - eredeti tervezet

Állategészségügyi tagozat, Milánói Egyetem, Milánó, Olaszország

Szerepek konceptualizáció, finanszírozás megszerzése, források, felügyelet, írás - áttekintés és szerkesztés

Biológiai Sokféleség és Molekuláris Ökológia Tanszék, Kutatási és Innovációs Központ, Fondazione Edmund Mach, San Michele all’Adige, Trento, Olaszország

Francesca Albonico,
Claudia Barelli,
Davide Albanese,
Mattia Manica,
Erika Partel,
Fausta Rosso,
Silvia Ripellino,
Massimo Pindo,
Claudio Donati,
Alfonso Zecconi

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Albonico F, Barelli C, Albanese D, Manica M, Partel E, Rosso F és mtsai. (2020) A kereskedelmi alpesi tejelő tehenek nyers teje és székletmikrobiota állománytól, zsírtartalomtól és étrendtől függően változik. PLoS ONE 15 (8): e0237262. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0237262

Szerkesztő: Alex V. Chaves, Sydney Egyetem, AUSZTRÁLIA

Fogadott: 2020. március 27 .; Elfogadott: 2020. július 22 .; Közzétett: 2020. augusztus 6

Adatok elérhetősége: A tanulmány számára létrehozott adatkészlet nyilvánosan elérhető a https://figshare.com/s/23c818dc250a18ea2451 címen.

Finanszírozás: Az olasz Fondazione Cassa di Risparmio di Trento e Rovereto (CARITRO) pénzügyileg támogatta ezt a tanulmányt a MASTIRISK projekt támogatásával az FA és a HCH számára.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

Anyagok és metódusok

Minta kollekció

Bioinformatikai feldolgozás

A 16S rRNS génszekvenciákat a nyílt forráskódú MICCA (v1.6) szoftverrel dolgoztuk fel [38]. Az átfedő páros végű leolvasásokat Edgar és Flyvbjerg által 2015-ben leírt eljárással állítottuk össze [39]. A 80 bp-nél kisebb átfedési hosszúságú és több mint 32 nem megfelelő párokat elvetették. Az alapozó trimmelése után az előre leolvasott értékek 400 bp-nél rövidebbek voltak, és a várható hibaarány meghaladja a 0,75% -ot. A Greengenes adatbázisban (13_8. V.) [40] 60% -nál kisebb azonosságot mutató olvasmányokat 85% -os hasonlósággal csoportosítva elvetettük. Az OTU-kat de novo, kapzsi stratégia alkalmazásával következtették 97% -os hasonlósági határérték alkalmazásával. Az egyes OTU-k eredményeit a Ribosomal Database Project osztályozó (RDP osztályozó, 2.12 verzió [41]) felhasználásával osztályozták.

A széklet parazitológiai elemzése

Minden friss székletminta esetében a helmintojások és a protozoon ciszták jelenlétét szokásos lebegési eljárással értékelték. Mindegyik mintát mozsárban összekevertük 30 ml úszó közeggel (telített cukor- és nátrium-nitrát-oldat), átengedtük 1 mm-es szűrőn és 5 percig 4000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk 15 ml-es üvegcsőben. Minden mintához két csövet készítettünk. Centrifugálás után úszó közeget adunk hozzá, amíg a csövek meg nem telnek (kb. 1 ml). A tojásokat minden cső felületéről üveglemez segítségével gyűjtöttük össze. A tárgylemezeket 10x és 40x-es nagyítással figyeltük meg optikai boncoló mikroszkóppal, és a tojásokat Soulsby [42], valamint Sloss és Kemp [43] gombjaival azonosítottuk fajok szerint.

Adatfeldolgozás és statisztikai elemzések

A későbbi elemzéseket R alkalmazásával végeztük phyloseq [44] és vegán csomagokkal. Miután a szubklinikai tőgygyulladásból vett tejmintákat eltávolítottuk (lásd fent), a fennmaradó mintákat ritkítottuk (pótlás nélkül) mintánként 2 000 leolvasással, ami további hét minta eldobását eredményezte. A székletmintákat ritkábban (pótlás nélkül) mintánként 18 500 leolvasással végeztük, aminek következtében egy mintát eldobtak. A standard alfa és béta diverzitás indexek becslését és a fő koordináta elemzést (PCoA) az R phyloseq könyvtár segítségével végeztük el.

Etikai nyilatkozat

Ezt a vizsgálatot tíz, Trentinóban található kereskedelmi tejüzem mintáival végezték a résztvevő gazdálkodók engedélyével. A telepen végzett, nem invazív kutatáshoz az etikai bizottsági felügyelet nem szükséges az olasz és a tartományi törvények szerint. A szerzők megerősítik, hogy semmilyen módon nem zavarták az állatokat, és mind a nyerstejet, mind a székletmintákat nem invazív módszerekkel végezték, a mezőgazdasági állatorvosok jóváhagyott iránymutatásainak megfelelően. Az állatok gondozására és felhasználására vonatkozó valamennyi vonatkozó intézményi és/vagy nemzeti irányelvet betartották.

Eredmények

A nyerstej és a széklet mikrobiota taxonómiai osztályozása

A 76 tejmintából összesen 70-et sikerült sikeresen szekvenálni, és ritkítás után 63 volt elérhető bioinformatikai elemzéshez. A nyerstej mintákban taxonómiailag azonosított 25 phyla közül a dominánsak a Firmicutes (medián bőség 55,3%), majd a Bacteroidetes (13,7%), a Proteobacteriumok (11,6%) és az Actinobacteriumok (11,3%) voltak. A fennmaradó phylát 1% alatti relatív bőség jellemezte (S1 táblázat). Családi szinten (1A. Ábra) a Ruminococcaceae (medián bőség 14,1%) volt a leggyakoribb, majd a Lachnospiraceae (8,8%) és a Staphylococcaceae (5,7%) következett. Míg a domináns nemzetségek között volt a Staphylococcus (medián bőség 4,7%) és a Corynebacterium (4,5%), majd a Clostridium XI (2,1%), a Bacteroides (2,1%), a Clostridium XIVa (1,8%), az Acinetobacter (1,6%) következett (2A ábra). A nem osztályozott OTU a tejben ezen a szinten 39,8% volt, jóval kevesebb, mint a székletben (65,2%).

Az alpesi fejőstehén nyers tej (a) és a széklet (b) minták legelterjedtebb családjainak relatív bősége. A középső relatív bőség a felső paneleken, míg az interkvartiliként (IQR) kifejezett változékonyságuk az alsó paneleken látható.

Az alpesi tejelő tehenek nyers tejének (a) és a széklet (b) mintáinak leggyakoribb nemzetségeinek relatív bősége tíz állományban, tradicionálisan (TF) vagy életlen (UF) táplálva Trento tartományban, Olaszországban.

Mind a 100 székletmintát sikeresen szekvenáltuk, és csak egy mintát távolítottunk el a ritkítás után. Tizenhat phylát rendszertanilag osztottak be az ürülékbe (S2 táblázat), a Firmicutes (medián bőség 51,2%) és a Bacteroidetes (38,4%) képviselte a két legdominánsabb phylát, majd a Proteobacteriumok (2,6%) és a Spirochaetes (1,3%) voltak. Ezen a szinten nagyon kevés nem osztályozott OTU-t észleltek (3,3%, szemben a nyerstej 2,1% -ával). A nyerstejhez hasonlóan a székletmintákban a Ruminococcaceae (24,7%) és a Lachnospiracee (10,4%) volt a két leggyakoribb család (1B ábra), majd a Prevotellaceae (7,6%) és a Bacteroidaceae (7,4%) következett. Az összes többi család kevesebb, mint 5% volt jelen; a nem besorolt OTU-k ezen a szinten 28,6% voltak (szemben a nyerstej 13,8% -ával). A Bacteroides (7,3%), az Alistipes (3,9%), a Clostridium XIVa (2,7%), a Paraprevotella (2,2%), a Phascolarctobacterium (1,7%), a Prevotella (1,5%), a Treponema (1,3%) és a Roseburia (1%) nemzetség domináns (2B. ábra) székletminták. A nem osztályozott OTU-k a nemzetség szintjén 65,2% voltak (szemben a nyerstej 39,8% -ával).

A nyerstej és a székletminták mikrobiotában való gazdagsága

A gazdagság (alfa változatosság) becslése az egyének között nagyban változott; a megfigyelt OTU-k száma a nyerstej mintákban 76 és 609 között mozgott (3A ábra; S3 táblázat), míg az Inverse Simpson index értéke 1,6 és 130,3 között változott (4. ábra; S3 táblázat).

Az alpesi tejelő tehén nyers tej (a) és a széklet (b) mikrobiota összes megfigyelt OTU-jának hegedűrajza.

Az inverz Simpson-index tej- és ürülékmikrobiota megfigyelt értékeinek dobozos ábrája tíz olyan állományban, amelyek tradicionálisan (TF) vagy életlen (UF) táplálkoznak Trento tartományban, Olaszország. Vízszintes szaggatott vonalak jelentik az egyes megfelelő mikrobiákák átlagértékeit. A pöttyök között a pontok nem szerepelnek.

A székletminták a mikrobiota gazdagságában is nagy intra-individual változást mutattak, mind a megfigyelt OTU-k száma (714 és 1 581 között; 1B ábra; S4 táblázat), mind az inverz Simpson-index (21,5–167,1; 4. ábra; S4) Asztal). A nyers tej inverz Simpson-indexeinek átlagértékei lényegesen alacsonyabbak, mint a székleté (átlag = 86,4; df: 151,6, t-érték: -5,575, P 1. táblázat. A nyerstej mikrobiota több modelles következtetési paramétereinek átlagos LMM becslései fogalmazás.

Ehelyett a széklet mikrobiota gazdagságát diétával magyarázták, átlagosan az UF diéta nagyobb változatossággal járt, majd az ellés dátuma és a kokcidiumok fertőzése következett (2. táblázat). A Pearson-féle korreláció a megfigyelt és az illesztett értékek között, a modell átlagolt paraméterei alapján kiszámítva 0,33 volt (df = 97, P 2. táblázat. A fekális mikrobiota összetételének multi-model következtetési paramétereinek átlagos lineáris kevert modell (LMM) becslései.

A mikrobiota összetétel LM elemzése (szintén az Inverse Simpson Index alapján) azt mutatta, hogy kifejezetten kovariátorként tekintve az „állományra” (S5 táblázat és S6 táblázat) mindkét tej esetében javult a modell teljesítménye (Pearson korreláció = 0,68, df = 61, P - Ábra; 5A ábra; S7 táblázat). A PCoA (fő tehenek az 5A. Ábra bal oldalán) első fő koordinátáját (PC) főként a Staphilococcaceae nagyobb mennyisége (5B. Ábra) vezérli, míg a többi tehén többségét (a jobb felső sarokban lévő 5A. Ábra) náluk nagyobb a kilenc másik család, különösen a Ruminococcaceae, a Bacteroidaceae és a Prevotellaceae száma (5B. ábra). A második PC-t elsősorban három baktériumcsalád, a Xanthomonadaceae, a Pseudomonadaceae és a Flavobacteriaceae különbségei vezérlik (5.C ábra).

a) a Bray-Curtis különbségek alkalmazásával mért mintatávolságok közötti fő koordináta-elemzés (PCoA); Azok a családok, amelyek az első (b) és a (c) fő alkotóelemben a nyerstej mikrobiota összetételének változékonyságát eredményezik. Színes pontok tíz különböző állományból származó tehenet azonosítanak, amelyeket hagyományosan (TF) vagy életlen (UF) táplálnak az olasz Trento tartományból.

Hasonlóképpen a székletminták esetében a PERMANOVA-teszt azt mutatta, hogy az összes figyelembe vett paraméter közül csak a „csorda” volt statisztikailag szignifikáns (P −4; 6A. Ábra; S8 táblázat). Az első PC-t (a 6A. Ábra jobb oldalán fekvő tehenek, főleg a TF3, TF4 és TF5 állományok) a Lachnospiraceae és a Succinivibrionaceae nagyobb mennyiségével magyarázzák, míg a bal oldalon csoportosuló tehenek többségét nagyobb bőség jellemzi Bdellovibrionaceae, Verrucomicrobiaceae, Desulfovibrionaceae és Rikenellaceae (6B. ábra). Ezenkívül a grafikon bal felső sarkában lévő tejelő tehenek ürülékére (főleg az UF2, UF3, UF4 és TF5 állományokból a 6A. Ábrán) a Bacteroidaceae és a Prevotellaceae nagyobb száma jellemző, míg a TF2 és UF5 állományból származóaknak több Desulfovibrionaceae, Bdellovibrionaceae és Verrucomicrobiaceae. A baktériumok gazdagságának mérése azt mutatta, hogy a nagyobb számú OTU-t tartalmazó székletmintáknál (6D. Ábra) nagyobb a Shannon-entrópia is (6E. Ábra).

a) a Bray-Curtis különbségek alkalmazásával mért mintatávolságok közötti fő koordináta-elemzés (PCoA); Az első (b) és a második (c) fő alkotóelemben a széklet mikrobiota összetételének változékonyságát előidéző családok; Minta távolság a megfigyelt OTU-k száma (d) és Shannon-entrópia (e) alapján. Színes pontok azonosítják a tíz különböző állományból származó teheneket, amelyeket hagyományosan etettek (TF) vagy életlen (UF) teheneket gyűjtöttek az olaszországi Trento tartományban.

Vita

Tudomásunk szerint ez a nyers tej és a széklet mikrobiotájának első nagy értékelése a kereskedelmi (nem kísérleti) tejelő teheneknél. 10 kis (nem intenzív) alpesi gazdaságból származó majdnem 100 egészséges tehenet vizsgáltunk meg, és feltártuk, hogy a belső és külső tényezők hogyan befolyásolhatják mikrobiota gazdagságukat és összetételüket. Habár az egyes tehenek közötti eltérés mindkét mintatípus esetében nyilvánvaló volt, kimutattuk, hogy a nyáj tejben és az ürülékben az „állomány” a legfontosabb tényező, amely befolyásolja a mikrobiota gazdagságának és összetételének egyéni különbségeit. Az ilyen ismeretek befolyásolhatják a mikrobiota manipulációjának gazdasági vagy állatorvosi célú felhasználását.

Annak ellenére, hogy különböző gazdaságokhoz, fajtákhoz és etetési rendszerekhez tartozik, a vizsgálat összes nyerstej- és székletmintájában a Firmicutes menedékház dominált, majd a Bacteroidetes és a Proteobacteriumok következtek. Ez az eredmény összhangban áll a szarvasmarha nyerstej [2, 4, 11, 48] és székletminták [16, 18, 21, 24] korábban publikált tanulmányaival kísérleti állományokban vagy jóval kisebb számú teheneknél. Ezenkívül ez a három phyla a legkülönbözőbb különböző emlősfajokban, például emberi és nem főemlősökben, laboratóriumi egerekben [49–53], valamint vadon élő növényevőkben (óriáspanda [54]; szikaszarvas [55]). ]; erdei pézsmaszarvas [56]). Ezenkívül az e vizsgálat székletmintáiban talált alacsony fehérjetartalmú proteobaktériumok (2,5%) a Firmicutes és Bacterioides (89,6%) összehasonlításában tükrözhetik a tehenek egészségi állapotát. Az egészséges teheneknél kevesebb, mint 4% proteobaktérium található, míg ennek a relatív bőségnek a növekedése a szubakut kérőskék acidózisával járt [24, 57, 58].

Családi szinten a Ruminococcaceae és a Lachnospiraceae uralta mind a tej-, mind a székletmintákat. Annak ellenére, hogy fontos szerepük van a keményítő és a rost lebontásában [15, 18], ez a két család a bél egészségi állapotához kapcsolódik különböző emlősfajoknál, beleértve a lovakat [65], macskákat és kutyákat [66, 67] és laboratóriumi egereket [48, 68]. ], valamint a szarvasmarhafélék [21]. Érdekes, hogy az egyének és a gazdaságok közötti eltérések ellenére először jegyezzük meg, hogy ugyanazok az uralkodó családok találhatók meg a nyerstejben is, amelynek fontos következményei vannak a borjú és az emberi bél egészségére és táplálkozására. További bőséges családok, amelyekről a nyerstejben beszámoltunk, a Staphylococcaceae voltak, amelyeket általában fejőstehenekből nyertek ki [69], és a Corynebacteriaceae, amelyek széles körű fermentációs képességekkel rendelkeznek [70]. A székletben a leggyakoribb családok között megtaláltuk a Prevotellaceae-t, amely az étrendi kezelésekre adott válaszként nagyban változik [19, 71], és a Bacteroidaceae-t, köztük néhány Bacteroides-fajt, amelyekről ismert, hogy lebontják a sejtfal összetevőit [72].

Érdekes módon a székletmintákban azt figyeltük meg, hogy a nagyobb számú OTU-val jellemzett minták jobban hasonlítanak egymásra (hajlamosak összegyűlni) és nagyobb az entrópiájuk, míg a kevesebb OTU-val jellemzett minták voltak a leginkább változékonyak, alacsonyabb az entrópia. Számos szerző kimutatta, hogy a stabilabb és produktívabb közösségek, köztük az emberi bél mikrobiota [88], de a zooplankton [89, 90] is jobb kórokozókkal szembeni rezisztenciával rendelkeznek. Más szerzők megjegyezték, hogy a mikrobiota gazdagságának csökkenése gyakran kíséri a betegséget, és az alacsonyabb gazdagság a mikrobiota korlátozottabb képességéhez vezethet a különböző stresszorokra reagálva [91, 92]. Az alacsonyabb gazdagság azonban nem mindig korrelál a nem emberi állatok alacsonyabb alkalmasságával [93, 94], sőt, itt nem találtunk összefüggést a coccidia és az Inverse Simpson index jelenlétével. Ezért a nagyon változatos mikrobiota „védelmi” képessége a kórokozó típusától függhet. További munkára van szükség a mikrobiota sokféleség és a paraziták elleni védelem szerepének tisztázásához.

Az állománytól eltekintve az Inverse Simpson-indexek fontos előrejelzői a nyers tej zsírtartalma és a nyers tej és a székletminták étrendje volt. Érdekes, hogy a tej mikrobiota gazdagsága erősen összefügg a tejzsírtartalommal. Mivel a modern fajtákat nagyobb tejmennyiségre választották ki, ez alacsonyabb zsírtartalmú tejhez vezetett. Az alacsony zsírtartalmú tejet a mai fogyasztók „egészségesebb” választásnak is tartják. Eredményünk arra utal, hogy a zsír mennyire fontos a tej mikrobiota gazdagságában; így ha az ilyen sokféleséget előnyösnek tekintik az egészségre, akkor a zsír csökkentése hatással lehet mind az állatok egészségére, mind az emberi táplálkozásra. Ehelyett a gazdagság és az étrend közötti kapcsolat nem meglepő, mivel sok szerző az étrendet, az étrend megfogalmazása, a takarmányozás kezelése és a széklet keményítő koncentrációja szempontjából tartja a legnagyobb tényezőnek, amely megváltoztatja a széklet baktériumközösségeit [13, 18, 19, 71].