A kereskedelmi célú rágcsálók étrendjének eltérései eltérõ molekuláris és fiziológiai változásokat idéznek elõ az egér méhében

Szerkesztette: George E. Seidel, Jr., Colorado Állami Egyetem, Fort Collins, CO, és jóváhagyta 2005. május 13-án (2005. március 1-én kapott felülvizsgálatra)

Absztrakt

Noha a petefészek-ösztrogén, az ösztradiol-17β a normális reproduktív funkciók kulcsmodulátora, az ösztrogén-szerű aktivitással rendelkező természetes és szintetikus vegyületek tovább befolyásolhatják a reproduktív funkciókat. A növényi eredetű fitoösztrogénekre különös figyelmet fordítottak a kapcsolódó egészségügyi előnyök miatt. A fitoösztrogénfogyasztás jótékony és/vagy káros hatásainak átfogó megértése a kereskedelmi célú rágcsáló-diétákon keresztül a méhbiológiára és a korai terhességre molekuláris szinten továbbra sem feltárt. Többféle megközelítés segítségével itt bemutatjuk, hogy a felnőtt nőstény egerek kereskedelmi rágcsáló-étrendnek való kitettsége magasabb fitoösztrogén-szint mellett megkönnyíti a méh növekedését petefészekösztrogén jelenlétében vagy hiányában, megváltoztatja az ösztrogénre reagáló gének méh expresszióját, és elősegíti az implantáció időzítését alacsonyabb fitoösztrogénszintű étrenddel. Az a megállapítás, hogy a kereskedelmi rágcsáló-diéták fitoösztrogén-tartalmának változékonysága mind a márkákon belül, mind azok között befolyásolja a kísérleti eredményeket, hangsúlyozza e vizsgálat fontosságát, és óvatosságra ad okot azoknál a kutatóknál, akik állatmodellként rágcsálókat használnak.

Számos természetes és szintetikus vegyület utánozza az ösztrogént és befolyásolja a méh működését azáltal, hogy kölcsönhatásba lép a nukleáris ösztrogén receptorokkal vagy más jelző molekulákkal (6–8). Ezek az ösztrogénvegyületek elsősorban a környezeti xenoösztrogéneket és az étrendi fitoösztrogéneket tartalmazzák. Korábban kimutattuk, hogy a xenoösztrogének ösztrogénszerű korai fázisú választ váltanak ki (6, 9, 10) és szabályozzák az ösztrogénre reagáló gének expresszióját a méhben (6, 7). Ennél is fontosabb, hogy a xenoösztrogének petefészekösztrogén hiányában indukciót indukálnak a P4 primer patkányokban (9, 10). Ezek a megfigyelések azt bizonyítják, hogy a xenoösztrogének befolyásolhatják a méh funkcióit. A közelmúltban a növényi eredetű nem szteroid fitoösztrogének figyelmet kaptak, mivel úgy vélik, hogy számos egészségügyi előnyük van (11). Az ösztrogénvegyületek azonban endokrin rendellenességként is működnek, fejlődési és szaporodási zavarokat okozva (12). Ezért fontos, hogy gondosan értékeljük az étrendi ösztrogének jótékony hatásait az ösztrogénre reagáló célszövetekben kifejtett lehetséges káros hatásokkal szemben.

Jelenleg a legtöbb kereskedelmi célú laboratóriumi rágcsáló-étrend szójababbal és lucernával készül (13, 14), amelyek jelentős napi izoflavon adagokat juttatnak az állatokhoz egész életük során. A legfrissebb tanulmányok azt mutatják, hogy ezeket a kereskedelmi étrendeket ad libitum fogyasztó rágcsálók keringésében magas az izoflavonok egyensúlyi állapota, ez meghaladja az endogén ösztrogénszintet 30–60 000-szeresére (15), bár ezek a keringési szintek egyszerre tartalmaznak szabad (bioaktív) és glikozilezett izoflavonok. Továbbá vannak bizonyítékok arra, hogy a genistein, az egyik izoflavon, a természetes ösztradiol-17β (E2) -hez képest jelentős hozzáféréssel és hatékony szabad frakciókkal rendelkezik a szérumokban (16). Így feltételezhető, hogy a magas étrendi fitoösztrogénszint befolyásolja a méh natív ösztrogénhatásait.

Anyagok és metódusok

Állatok és diéták. Az egereket az Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottság és a Nemzeti Egészségügyi Intézetek irányelveinek megfelelően helyezték el. A Charles River Tenyésztő Laboratóriumtól vásárolt hathetes CD1 nőstény nőstényeket 12: 12 órás világos: sötét ciklusban helyeztük el. Az egereket véletlenszerűen két csoportba osztottuk, és a kereskedelmi forgalomban lévő Purina 5V00 vagy 5001 rágcsáló-étrendet etettük, amelyek hasonló étrendi összetevőket tartalmaznak, de változó izoflavonszinteket tartalmaznak (www.labdiet.com/indexlabdiethome.htm). A Purina 5V00 étrend 400 ppm teljes izoflavont tartalmaz (13, 15). Élelmet és vizet ad libitum minden egérnek biztosítottunk. Ha feltételezzük, hogy felnőtt egérenként napi 4 g pelletált adagot fogyasztunk, az 5V00, illetve az 5001 étrendből napi 200, illetve 1600 μg teljes izoflavont fogyasztunk. Normális esetben a Vanderbilt egereit a Purina 5001 diétán tartják fenn.

Uterotróf és sejtproliferációs vizsgálatok. Az egerek 6 héten át Purina 5V00 vagy 5001 diétán voltak. Ezután petefészek-eltávolítást végeztek, és véletlenszerűen több csoportra osztották őket. A megfelelő étrend további 2 hétig tartó elfogyasztása után az egereket injektáltuk s.c. szezámolajjal (0,1 ml/egér), P4-vel (2 mg/egér), ösztradiol-17β-val (E2; 100 ng/egér) vagy ugyanazon dózisú P4 és E2 kombinációjával. Az egerek kontroll csoportja nem kapott kezelést. Az egereket a szteroidos kezelések után 6 és 24 órával leöltük, és feljegyeztük a testtömegét. BrdUrd oldatot (40 mg/testtömeg-kg; Zymed) i.p. 2 órával az áldozat előtt injekciózták. A méhszarvakat levágódott zsírtól és mesentériától mentesen boncoltuk. Mérés után egy méhkürtöt 10% -os pufferolt formalinban rögzítettünk immunfestés céljából, és az ellenoldali szarvat gyorsfagyasztottuk génelemzés céljából. A méh növekedési reakcióját a méh nedves tömegéhez és a méh súlyának és a testtömeg arányához viszonyítva t-próbával elemeztük, majd varianciaanalízissel és a kovariancia elemzésével spss szoftverrel (SPSS, Chicago).

Beültetés „Ablak” és késleltetett beültetés. Az egereket Purina 5V00 vagy 5001 diétával etették 8 hétig. A terhesség kiváltására a nőstényeket egy éjszakán át termékeny hímekkel helyezték el, és másnap reggel (hüvelydugó = 1. nap) ellenőrizték a hüvelydugókat. Az étrendnek az implantáció idejére gyakorolt hatásának tanulmányozásához a vemhes nőstényeket 2000, 2200 vagy 2400 órakor ölték meg a 4. napon este, és a beültetési helyek számát kék sávokkal elhatárolva iv. chicagói kék B festékoldat injekciói (20). A terhesség igazolására a beültetéstől mentes méheket átöblítették, hogy helyreállítsák az implantálatlan blasztocisztákat. Az étrendi fitoösztrogének hatásának vizsgálatára a beültetendő méh előkészítésére késleltetett implantációs modellt alkalmaztunk. Ezt az állapotot a vemhes egerek ovariectomizálásával indukálták a 4. napon reggel (0830–0900 óra), és napi P4 injekciókkal (egérenként 2 mg) tartották fenn az 5. és a 7. nap között. Az implantáció megkezdéséhez a P4-re kezelt nőstények különböző injekciókat kaptak E2 dózisok (1,5, 3,0 vagy 10 ng/egér) a 7. napon. Az egereket 24 órával később leöltük, és az implantációs helyek számát kék festék módszerrel rögzítettük.

Immunhisztokémia. Sejtproliferációt formalinban rögzített, paraffinba ágyazott szakaszokban (5 μm) Zymed BrdUrd festő készlet segítségével detektáltunk. A progeszteronreceptor (PR) és az ösztrogénreceptor-a (ERα) immunolokalizációját monoklonális egér anti-PR antitest (Zymed) és poliklonális nyúl anti-ERα antitest (Santa Cruz Biotechnology) alkalmazásával hajtottuk végre. Histostain-Plus (DAB) kitet (Zymed) alkalmaztunk az antigén vizualizálására. A vörösesbarna lerakódások a pozitív immunfestés helyeit jelzik.

In situ hibridizáció. Az in situ hibridizációt fagyasztott szakaszokban (10 μm) hajtottuk végre, ahogyan azt korábban leírtuk (21).

RT-PCR. Az RNS extrakciót, az RT-t és az összehasonlító PCR reakciókat (25 ciklus) korábban leírtuk (22). Az LF (laktoferrin), a LIF (leukémiát gátló faktor), a PR (nukleáris progeszteron receptor), az ERα (a nukleáris ösztrogén receptor α) és az sFRP2 (szekretált frizzelt rokon fehérje 2) mRNS-ek korrekcióját korrigáltuk az rPL7-vel.