A ketogén diéta nem kivitelezhető terápiaként CD-1 nu/nu egér vesesejtes karcinóma modellben, a Stauffer-szindróma jellemzőivel

Mutatók: PDF 1056 megtekintés | HTML 3016 nézetek | ?

Silvia Vidali, Sepideh Aminzadeh-Gohari, René Günther Feichtinger, Renaud Vatrinet, Andreas Koller, Felix Locker, Tricia Rutherford, Maura O’Donnell, Andrea Stöger-Kleiber, Bridget Lambert, Thomas Klaus Felder, Wolfgang Sperl _ és Barbara Kofler

Absztrakt

Silvia Vidali 1, Sepideh Aminzadeh-Gohari 1, René Günther Feichtinger 1, Renaud Vatrinet 2, Andreas Koller 1, Felix Locker 1, Tricia Rutherford 3, Maura O'Donnell 3, Andrea Stöger-Kleiber 3, Bridget Lambert 3, Thomas Klaus Felder 4, Wolfgang Sperl 5 és Barbara Kofler 1

1 Bassi Laura Szakértői Központ-THERAPEP, Receptorbiokémiai és Tumormetabolizmus Kutatási Program, Paracelsus Orvostudományi Egyetem, Gyermekgyógyászati Klinika, Salzburg, Ausztria

2 Gyógyszerészeti és Biotechnológiai Tanszék (FABIT), Bolognai Egyetem, Bologna, Olaszország

3 Klinikai táplálkozás, Vitaflo International Ltd, Liverpool, Egyesült Királyság

4 Laboratóriumi Orvostudományi Tanszék, Paracelsus Orvostudományi Egyetem, Salzburg, Ausztria

5 Paracelsus Orvostudományi Egyetem Gyermekgyógyászati Klinika, Salzburg, Ausztria

Kulcsszavak: vesesejtes karcinóma, mitokondrium, ketogén étrend, anyagcsere, Warburg-hatás

Beérkezett: 2017. március 10. Elfogadva: 2017. június 27. Megjelent: 2017. július 17

BEVEZETÉS

A veserák a nyugati országokban a 10 leggyakoribb rák egyike, a felnőttkori rosszindulatú daganatok körülbelül 2-3% -át teszi ki, és a vesesejtes karcinóma (RCC) az összes veserák körülbelül 90% -át teszi ki [1, 2]. Szervi zárt betegségben szenvedő betegeknél a műtéti reszekció a szokásos terápia és kiváló eredményekkel jár [3]. Más jelenlegi kezelések, mint például az érrendszeri endothel növekedési faktor (VEGF), a vérlemezkéből származó növekedési faktor (PDGF), valamint a rapamicin (mTOR) antitestek és inhibitorok emlős célpontja, kimutatták, hogy növelik a progresszió nélküli túlélést, de a válasz inkább átmeneti [4]. Ezenkívül az RCC-t gyakran későn diagnosztizálják, amikor a gyógyító kezelés nem lehetséges. Valójában a metasztatikus RCC rendkívül ellenálló a kezeléssel, általában gyenge eredménnyel és egy évnél rövidebb diagnózis után a medián túléléssel [1, 5].

Sok daganatos sejt különleges metabolikus aláírást mutat, amelyet magas glükózfelvétel és aerob glikolízis jellemez, amely megfelelő oxigénmennyiség jelenlétében is megakadályozza a piruvát metabolizálódását a mitokondriumok légzésével, nevezetesen az oxidatív foszforilációval (OXPHOS) [6–9] . Ez az anyagcsere-váltás Warburg-hatás néven ismert [10, 11]. A legtöbb esetben az anyagcsere ezen elmozdulása az OXPHOS-aktivitás általános lefelé történő szabályozásával jár [12–15], vagy magában foglalhatja az OXPHOS-komplexek közül kettő vagy három hiányát [16, 17], vagy az egyik egyik hibáját. az OXPHOS alegységek [18–20].

Az RCC Warburg-hatást is mutat. Valójában az RCC-ben a glikolitikus fehérjék növekedését és számos mitokondriális enzim kimerülését figyelték meg [12, 21]. Ezenkívül az agresszívebb típusú RCC-ket a hipoxia-indukálható faktor (HIF) stabilizálása jellemzi, még normoxiában is, a von Hippel-Lindau (VHL) gén funkcióvesztése miatt. A HIF emellett hozzájárul számos glikolitikus enzim up-szabályozásához és a mitokondriális glükóz oxidációjának elnyomásához [4, 22].

A ketogén étrend (KD) magas zsírtartalmú, kevés szénhidrátot és fehérjét tartalmaz, és éhezést vagy hosszan tartó testmozgást utánoz, anélkül, hogy korlátozná az energiafogyasztást. A megnövekedett keton testszint (pl. Acetoacetát és β-hidroxi-butirát) és a vér glükózszintjének csökkenése jellemzi. Mivel a daganatsejtek energiatermelésében nagymértékben függenek a glükóztól, a glükózellátás KD segítségével történő korlátozásának daganatellenes hatása lehet. Sőt, arról számoltak be, hogy a KD elősegíti az immunitást, csökkenti mind a gyulladást, mind az angiogenezist, és fokozza az apoptózist [23–25]. Végül a KD jó potenciált mutatott a rákos sejtek kemoterápiával szembeni érzékenységének fokozásában és a normál sejtek sugárterápiától való megvédésében. Így a KD lehetővé teszi a rák kezelését alacsonyabb dózisú kemoterápiás szerekkel, ami szintén javíthatja a betegek megfelelőségét [6, 26, 27].

A KD nemrégiben kimutatták, hogy különösen hatékony az agydaganatok, például a rosszindulatú glioma kezelésében [25, 28], és számos klinikai vizsgálatban alkalmazták adjuváns terápiaként glioblastoma, astrocytoma, a gyomor-bél traktus daganatai és más előrehaladott áttétek esetén. ráktípusok [28–32]. A legtöbb esetben a betegek stabil betegséget vagy általános klinikai javulást mutattak, fokozott progresszió nélküli túléléssel. Egyetlen esetben a tumor megismétlődött a KD szuszpenzió után [24].

A preklinikai vizsgálatokban a KD kiváló eredményeket adott adjuváns terápiaként a neuroblasztóma kezelésében egér xenograft modellben [6, 33]. A neuroblastoma és az RCC hasonló metabolikus aláírással bír, csökkent mitokondriális DNS-tartalommal és általános OXPHOS-aktivitás csökkenéssel [9, 12]. Bizonyíték van arra, hogy a közepes láncú trigliceridek (MCT) alapú KD-k ugyanolyan hatékonyak a kezelhetetlen epilepszia étrendi kezelésében, mint a hosszú láncú triglicerideken (LCT) alapulóak [34], és az MCT a KD-kbe tartozik, mivel gyorsabban metabolizálódik. és kevésbé valószínű, hogy a zsírszövetben tárolódnak az LCT-khez képest [35, 36]. Ezen feltételezések alapján feltételeztük, hogy az RCC-betegek is részesülhetnek a KD-terápiában. Így annak tisztázása érdekében, hogy a KD alkalmazható-e potenciális adjuvánsként az RCC kezelésében, immunhiányos egerekben létrehoztuk a humán RCC xenograftjait, és randomizáltuk az egereket egy kontroll étrendcsoportba és három KD csoportba MCT dúsítással vagy anélkül.

EREDMÉNYEK

Az emberi RCC xenograftok hasonló légzési jellemzőkkel rendelkeznek, mint az emberi RCC

Annak biztosítása érdekében, hogy a 786-O sejtek humán RCC xenograftjainak hasonló légzési jellemzői legyenek, mint az emberi RCC-nek, az 5 OXPHOS komplex és a porin (mitokondriális tömeg marker) immunhisztokémiai (IHC) festését végeztük RCC 786-O xenograft szövetszelvényeken. A xenograftok normál mitokondriális tömeget mutattak, de az OXPHOS I – IV komplexek szintje szignifikánsan alacsonyabb volt a normál veséhez viszonyítva (1. ábra), összhangban a humán RCC minták légzéskárosodásáról korábban publikált adatokkal [12]. Ezek az eredmények tehát megerősítették az aerob mitokondriális metabolizmus általános csökkenését az RCC 786-O xenograft modellben.

1. ábra: Az RCC az I – IV OXPHOS komplexek csökkent szintjét mutatja. A porin és az OXPHOS komplexek immunhisztokémiai festését végeztük (A1 – F1) normál emberi vesén, (A2 – F2) és RCC xenograftokon. (A3 – F3) A grafikonok a festés intenzitásának pontszámát mutatják. Az adatokat átlag ± SEM formában adjuk meg. A statisztikai elemzést a diákok segítségével végeztük t teszt (párosítatlan minták), ## o 2. ábra: A KD-k általában a tumor növekedésének csökkenését, de a túlélést is okozták. (A1 – A4) Daganatnövekedés az egyes egerekben különböző étrendek alatt. (B) A grafikon a daganat tömegének átlagát mutatja a kezelési idő alatt. Az adatokat átlag ± SEM formában adjuk meg. A statisztikai elemzést kétirányú ANOVA (Dunnett többszörös összehasonlító teszt) alkalmazásával végeztük, n = 5 a CTRL és LCT/MCT8 csoportok esetében; n = 6 az LCT és az LCT/MCT10 csoportok esetében, az étrendi beavatkozás kezdetén. (C) Kaplan-Meier túlélési görbék a különböző KD-kkel kezelt RCC xenograft recipienseknél. A túlélési görbék statisztikai elemzését Log-rank teszttel (Mantel-Cox) végeztük: CTRL vs. LCT, o = 0,2414; CTRL vs. LCT/MCT8, o = 0,1205; CTRL vs. LCT/MCT10, o = 0,0204.

Érdekes, hogy az RCC xenografttal rendelkező egerek gyakran hatalmas és általában hirtelen fogyást tapasztaltak, ami az összes KD csoportban rosszabb volt a CTRL csoporthoz képest (3A1–3A4 ábra). A 20% -nál nagyobb súlycsökkenés volt az egyetlen oka a kezelés korai leállításának és az eutanáziának. Az egyik MCT-tartalmú étrendet fogyasztó egereknél kifejezett súlycsökkenés volt tapasztalható. A CTRL csoportban az egerek meglehetősen stabil testtömeget tartottak 50–60 napig (3A1. Ábra). Feltűnő ellentétben az összes LCT-diétát kapó daganatos egér 26-30 napos kezelés után súlycsökkenést szenvedett, és 67% -uk elvesztette kezdeti súlyának több mint 20% -át (3A2. Ábra). Az LCT/MCT8 csoportban 40% -uk 15-20 nap elteltével szenvedett jelentős súlyvesztést (3A3. Ábra), az LCT/MCT10 csoportban pedig az egerek körülbelül 70% -a kezdett fogyni már 10 nappal a kezelés megkezdése után. (3A4. Ábra). A súlycsökkenést szenvedő egerek kissé letargikusnak tűntek (adatok nem láthatók, a kísérletező szubjektív megfigyelése).

Amikor a tumor mérete elérte a 600–700 mm 3 -et, az egereket különféle ad libitum diétás intervenciós csoportokba randomizálták (n = 5–6) és csoportos elhelyezésű. A xenograft befogadókat heti kétszer ellenőriztük a testtömeg szempontjából, digitális mérleg alkalmazásával, és a daganat térfogatát féknyereg segítségével, és a térfogatot a (szélesség × magasság × hosszúság)/2 képlet szerint számoltuk ki. A vércukorszintet és a keton test (β-hidroxi-butirát) szintjét hetente egyszer monitoroztuk egy specifikus enzim alapú készlet alkalmazásával (Precision Xceed, Abbott Laboratories, Ausztria). A méréseket kétórás éhgyomri periódus után hajtották végre.

A xenograftok esetében az egereket eutanizálták 65 nappal a tumorsejtek injektálása után, vagy amikor a terminációs kritériumok teljesültek, az ilyen testsúlycsökkenés meghaladja a nettó testtömeg 20% -át; az egerek egyike sem volt skarifikálva a daganat mérete miatt, mivel az egyik xenograft nem érte el az egér nettó tömegének 10% -át. A daganat központi részéből egy 5 mm vastag szeletet formalinban rögzítettek és paraffinba ágyaztak szövettani elemzés céljából, és a fennmaradó rákszövetet folyékony nitrogénben lefagyasztották. A májat is összegyűjtöttük és folyékony nitrogénben lefagyasztottuk. Végül az elejtés előtt az egereknek 10 μl/g érzéstelenítő keveréket (20,5 mg ketamint, 5,4 mg xilazint, 5,4 mg xilazint, 270 μg/ml acepromazint sóoldatban) injektáltunk, és miután megvizsgáltuk, hogy a mancsot, szívszúrást hajtottak végre, és a vért csövekbe gyűjtötték (BD Microtainer ® PST TM LH csövek) (BD Biosciences, Ausztria). Amint azt a gyártási protokoll javasolja, a csöveket 10-szer megfordítottuk, és 10000 g-vel 90 másodpercig centrifugáltuk a plazma elválasztása céljából; A plazmát ezután összegyűjtötték és folyékony nitrogénben lefagyasztották.

Az egészséges állatokon végzett kísérletet 40 napos kezelés után leállítottuk, és ugyanazt az eutanázia-protokollt és a xenograftot hordozó egereknél használt mintagyűjteményeket alkalmaztuk. Az összes fagyasztott mintát az elemzésig -80 ° C-on tároltuk.

Diétás beavatkozás

Az egereket négy étrendi csoportba randomizálták, akiket ad libitum-mal etettek: kontroll étrend (CTRL); hosszú láncú zsírsav KD (LCT); 25% 8 szénatomos közepes láncú zsírsav és 49,6% LCT KD (LCT/MCT8); és 25% 10 szénatomos közepes láncú zsírsav és 49,6% LCT KD (LCT/MCT10) (Sniff Spezialdiäten GmbH, Németország). Ezenkívül az étrendeket vitaminokkal és ásványi anyagokkal dúsították (1. táblázat).

1. táblázat: A különböző étrendek összetétele és energiaellátása