A lincosamid képződésének vizsgálata befejezi a lincomicin A bioszintetikus útját

Keresse meg ezt a szerzőt a Google Tudósban
Keresse meg ezt a szerzőt a PubMed oldalon
Keresse meg ezt a szerzőt ezen a webhelyen
ORCID-rekord Hung-wen Liu számára
Levelezés céljából: [email protected]

Szerkesztette: Chi-Huey Wong, Academia Sinica, Tajpej, Tajvan, és jóváhagyta: 2020. augusztus 20. (áttekintésre érkezett: 2020. május 10.)

Jelentőség

A linkomicin A egy antibiotikum, amelyet klinikailag használnak a gram-pozitív bakteriális fertőzések kezelésében. Bioszintézise az egyedülálló kéntartalmú tiooktóz mag miatt nagy figyelmet keltett. A linkomicin-bioszintézis megértése terén elért jelentős előrelépés ellenére a GDP-ᴅ-eritro-α-ᴅ-glüko-októz GDP-ᴅ-α-ᴅ-linkozamiddá érlelődésének mechanizmusa homályban marad. A régóta keresett hiányzó kapcsolat két epimerizációból áll: egy 6,8-dehidrációs és egy négy enzim által katalizált transzaminációs reakcióból. Továbbá, ellentétben a többi, regiospecifikusan működő epimerázzal, egyetlen enzimről van szó, amely két különböző lokuszon katalizálja az epimerizációt. A dehidráció a két enzim által katalizált α, γ-dehidrációnak is bizonyul. Ez a tanulmány így kiegészíti a linkomicin bioszintetikus útjának leírását, és kiemeli a szokatlan cukor bioszintézis összetett mechanikus finomságait.

Absztrakt

A linkomicin A szerkezete egy szokatlan, nyolcszénes tioszukor magból álló metil-linkozamidból (MTL) áll, amelyet egy függő N-metil-prolinil-rész díszít. Az MTL bioszintézisével kapcsolatos korábbi tanulmányok a GDP-ᴅ-eritro-α-ᴅ-glükóz-októzt és a GDP-ᴅ-α-ᴅ-linkozamidot javasolták az út legfontosabb köztitermékeiként. Azonban az enzim által katalizált reakciók, amelyek a GDP-ᴅ-eritro-α-ᴅ-glükóz-októz átalakulását GDP-ᴅ-α-ᴅ-linkozamiddá alakítják, még nem tisztázottak. Itt négy enzim - az LmbM, az LmbL, a CcbZ és a CcbS (az LmbZ és az LmbS ekvivalensek a szorosan kapcsolódó celesztetetin útvonalon) - aktivitásait magában foglaló bioszintetikus alutat jelentenek. Ezek az enzimek katalizálják a korábban ismeretlen bioszintetikus lépéseket, beleértve a 6-epimerizációt, a 6,8-dehidratálást, a 4-epimerizációt és a 6-transzaminálást, amelyek a GDP-ᴅ-eritro-α-ᴅ-glükóz-októzt GDP-ᴅ-α-ᴅ-vé konvertálják. -lincozamid. Ezeknek a reakcióknak az azonosítása kiegészíti a teljes linkomicin bioszintetikus út leírását. Ez a munka azért jelentős, mert nemcsak a tioszálcukrot tartalmazó természetes termék októzmag-összeállításának hiányzó kapcsolatát oldja meg, hanem a szénhidráttranszformációkban részt vevő enzimek katalitikus logikájában rejlő kifinomultságát is bemutatja.

Linkomicinek (1 és 2) (1 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –6), Bu-2545 (3) (7, 8), dezalicetin (4) és a celesztetin (5.) (9, 10) linkoszamid típusú antibiotikumok, amelyek Gram-pozitív baktériumok ellen hatnak (1A. Ábra). Különösen a lincomicin A blokkolhatja a baktériumok fehérjeszintézisét az 50S riboszomális alegység peptidiltranszferáz doménjéhez való kötődés révén, mivel szerkezeti hasonlósága van az 1 -Pro-Met-transzfer RNS (tRNS) és a dezacetilezett tRNS 3'-végével (11, 12 ). A lincomicineket klinikailag alkalmazták bakteriális fertőzések kezelésére olyan betegeknél, akik nem használhatnak penicillint, cefalosporint és makrolid antibiotikumokat (13).

(A) Lincosamid antibiotikumok szerkezete. (B) A linkomicin A bioszintetikus géncsoportjai (1) és a celesztetin (5.). A mindkét fürtben (lmb és ccb) található homológ gének szürkén vannak feltüntetve. A színes gének a tanulmány középpontjában állnak. Az összes fehér gén olyan ORF-eket képvisel, amelyek közvetlenül nem szükségesek az októzmag bioszintéziséhez.

A lincosamid típusú antibiotikumok szerkezetét egy atipikus tiooktózmag jellemzi (alkiltiolinkozamid, 6.) függő alkilprolin részdíszekkel díszített. Ezek az egyedülálló szerkezeti jellemzők és bioszintézisük a közelmúltban felkeltették a természetes termék vegyészeinek érdeklődését (14 ⇓ ⇓ ⇓ –18). A linkomicin A bioszintéziséhez szükséges géneket (lmb klaszter) a Streptomyces lincolnensis 78–11 (19) és American Type Culture Collection (ATCC) 25466 (20) törzsekből izoláltuk és szekvenáltuk. A celesztetin bioszintetikus génfürtjét (ccb-klaszter) szintén azonosították, és nyilvánosan elérhető. Mindkét klaszter erősen homológ (1B. Ábra). Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a 1 az LmbR által katalizált transz-aldol-reakcióval állítják elő, amelyben ᴅ-ribóz-5-foszfát (7) szolgál C5 akceptorként, és vagy ᴅ-fruktóz-6-foszfát (8.) vagy ᴅ-szedoheptulóz-7-foszfát (9.) szolgál C3 donorként (15). Ezt követi a kapott addukt LmbN által közvetített 1,2-tautomerizációja az októz-8-foszfát előállításához 10. (15 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –21). Az LmbP, az LmbK és az LmbO által katalizált későbbi átalakulások a legfontosabb köztitermékhez, a GDP-ᴅ-eritro-α-ᴅ-glüko-októzhoz vezetnek (11.) (2A. Ábra) (16).

(A) A lincomicin A bioszintézisében részt vevő enzimek (1). (B) A 11. nak nek 12.

Külön erőfeszítésként Zhao és mtsai. (17) kimutatta, hogy a kén beépülését a GDP LmbT által katalizált szubsztitúciója indítja el 12. ergotioneinnal (EGT) (13.) hozamot 14. Az ezt követő N 6 -amidáció, amely termel 15 az LmbC, az LmbN és az LmbD közvetíti (19, 22 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –30). Amint a 2A. Ábra mutatja, az utolsó érlelési lépések magukban foglalják az EGT kiszorítását 15 mikotiollal (MSH) (16.), amelyet az LmbV katalizál 17., A prolin N-metilezése 17. az LmbJ katalizálja, az MSH molekularész LmbE által katalizált hidrolízisével együtt 18. (17), a piruvát és az ammónium eltávolítása a 18. a piridoxal-5′-foszfát (PLP) -függő LmbF katalizálja a termeléshez 19. (31 ⇓ –33) és S-metilezése 19. az LmbG katalizálja a linkomicin A (1). A celesztetin bioszintézisében feltételezhetően analóg útvonal működik. Így a linkomicin képződésének teljes bioszintetikus útja lényegében teljesen ki van alakítva, kivéve a GDP-októz konverziójáért felelős alutat (11.) a GDP-ᴅ-α-ᴅ-linkozamidhoz (12.).

Eredmények és vita

(A) LmbM, LmbL és CcbZ reakciók HPLC elemzése GDP-októz felhasználásával (11.) mint szubsztrát (termék 24. később elhatározták 24a). (B) Az LmbL és CcbZ reakciók HPLC elemzése 24a mint szubsztrát. Minden reakcióelegy NAD + -ot tartalmaz. (C) CcbS aktivitás HPLC elemzése 20 és 23 generált 11. LmbM/LmbL/CcbZ katalízissel (1–4. nyom), az LmbM aktivitása 20 (6. nyom), és a fordított transzaminációs reakciót a CcbS katalizátorával katalizáljuk 12. mint szubsztrát (7. nyom). Az 1–4. És 6. nyomokban lévő reakcióelegyek NAD-t tartalmaznak + .

A termék előállítását akkor is észrevették, amikor az LmbM-t inkubálták az LmbL és/vagy a CcbZ mellett (3A. Ábra, 5. és 6. nyom). Ez utóbbi eredmények azt sugallják, hogy sem az LmbL, sem a CcbZ nem képes katalizálni az LmbM termék fogyasztását. Az LmbM termék a 11., mivel mindkét vegyület molekulatömege azonos (a C18H29N5O18P2 [M-H] képletre számítva: 664,0910; megfigyelt: 664,0923 az LmbM termékre és 664,1078 a 11.). Ez a termék azonban nem állt összhangban a GDP-ᴅ-eritro-α-ᴅ-galakto-októz (22.) (SI függelék, S2.3) a HPLC elemzés alapján (SI függelék, S2 ábra). Az NMR-vizsgálattal végzett további elemzés kimutatta, hogy az izolált LmbM termék megtartja az α-ᴅ-glüko-piranóz-csontvázat J1,2 = 3,0 Hz kapcsolási állandóval H1 és H2 között, és nagy, 9,6 Hz-es kapcsolási állandókkal H2/H3 esetén., H3/H4 és H4/H5, összhangban az utóbbi C – H kötések diaxiális elrendezésével (SI függelék, S3. Ábra). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy az LmbM a C6 vagy C7 epimerizációját katalizálja 11. (4. ábra) az átalakítás első lépéseként 11. nak nek 12. nem pedig az LmbM gén annotációja szerinti várható C4 epimerizáció.

A enzim átalakulása 11. nak nek 12. (D = 2 H látható szerkezetekben).

Mivel vegyület 24a által generált LmbM az első enzimatikus termék 11., ennek a következő lépésnek a szubsztrátjának kell lennie: 12.. Amint azt a 3B. Ábra mutatja, miközben 24a inert önmagában az LmbL-re vagy a CcbZ-re, az LmbL és a CcbZ 1: 1 moláris keverékével metabolizálódva olyan terméket nyerhet, amelynek HPLC-retenciós ideje ~ 22,0 perc (3B. ábra, 4. nyom). Ezt a vegyületet meghatároztuk 20 mert NaBD4-gyel végzett redukció (6R) - [6-2 H] képződését eredményezte.-28. mint fő redukált termék az NMR és a tömegspektrometriás elemzés alapján (SI függelék, S6 – S8. ábra). Bár az LmbL és a CcbZ együttesen képesek katalizálni a 24a, ugyanez nem igaz 11. (3A. Ábra, 7. nyom). Ezek a megállapítások kizárták a 11. nak nek 20 és hangsúlyozta az LmbM által katalizált epimerizáció fontosságát 11. nak nek 24a az útvonalon (4. ábra).

A reakciót az LmbM katalizálja.

Az LmbM két jól tanulmányozott epimerázhoz kapcsolódik, nevezetesen az ADP-l-glicero-ᴅ-manno-heptóz-6-epimerázhoz (AGME) (21% [I]/33% [S]) (38 ± 40) és UDP-ᴅ-galaktóz-4-epimeráz (GALE) (32% [I]/47% [S]) (34 ⇓ ⇓ –37) (SI függelék, S3. Táblázat). Az AGME katalizálja az ADP-ᴅ-glicero-β-ᴅ-manno-heptóz közötti átalakulást 30 és ADP-l-glicero-β-ᴅ-manno-heptóz 31 a lipopoliszacharidok és a heptóz antibiotikumok bioszintézise során, és így C6 epimerázként működik (5. ábra) (38 ⇓ – 40). Ezzel szemben a GALE egy C4 epimeráz, amely katalizálja az UDP-α-ᴅ-glükóz interkonverzióját 32 és UDP-a-ᴅ-galaktóz 33 a galaktóz-anyagcsere Leloir-útvonalában (34 ⇓ –36). A szekvenciaelemzés azt mutatja, hogy mindhárom enzimnek van egy NAD + -kötő motívuma, a GxxGxxG, amely jellemző a rövid láncú dehidrogenáz/reduktáz család tagjaira (37), és egy YxxxK motívum, amelyet fontosnak tartanak az NDP- 4-hidroxilcsoportjával való kölcsönhatások szempontjából. piranóz cukor szubsztrát (SI függelék, S9. ábra) (41 ⇓ –43).

(A) LmbM katalizált 6-epimerizációja 11. nak nek 24a. (B) Az ADP-ᴅ-glicero-β-ᴅ-manno-heptóz AGME által katalizált 6-epimerizációja (30) nak nek 31. (C) LmbM katalizált 4-epimerizációja 20 nak nek 23. (D) GALE által katalizált 4-epimerizáció az UDP-α-ᴅ-glükóz (32) és az UDP-α-ᴅ-galaktóz (33).

Az LmbL/CcbZ-katalizált dehidráció mechanizmusai.

Az LmbL és a CcbZ együttesen redox-semleges 6,8-dehidratációt katalizál; nem világos azonban, hogy az egyes géntermékek milyen szerepet játszanak ebben a reakcióban. Míg az NDP-cukor-4,6-dehidratázok elterjedtek a természetben, általában egy nyitott leolvasási keretben (ORF) kódolt enzim képviseli őket (44 ⇓ ⇓ ⇓ –48). Ezenkívül az LmbL/CcbZ által katalizált 6,8-dehidratáció mechanizmusa várhatóan hasonló lesz a többi NDP-cukor-4,6-dehidratáz esetében megfigyelt mechanizmussal; van azonban négy fő út, amelyen keresztül a katalízis folytatódhat, amint azt a 6. ábra mutatja. Mindegyik esetben az első lépés a 24a a víz eltávolításának megkönnyítése érdekében két oxidációs útvonal lehetséges, attól függően, hogy a dehidrogénezés C6 vagy C7 helyen történik-e (A és B útvonal). Az ezt követő enolizáció a közös intermedierhez vezetne 36, amelynek generálása 6,8-elimináción eshet át 37 redukció előtt, amely a két lehetséges út egyikén haladhat (azaz C, illetve D út).

(A) Az LmbL/CcbZ által katalizált 6,8-dehidratáció javasolt mechanizmusai. A második felében csak a színes deuterid sorsa következik be az redukált NAD-koenzimben, amely az első féléves reakcióban keletkezik. (B) Az X3 inkubálásából származó főbb termékek proton NMR spektrumának összehasonlítása 24a (1. spektrum), [6-2H]-24a (2. spektrum) és [7-2H]-24a (3. spektrum) LmbL/CcbZ-vel, majd NaBD4 redukcióval (D = 2H látható a szerkezetekben). A szennyeződésekből származó csúcsokat nehéz volt eltávolítani, mivel a minták ismételt tisztításkor hajlamosak voltak lebomlani.

A) Megállapított út a 11. nak nek 12. a linkomicin bioszintézisében. Az LmbM, CcbZ és LmbL által katalizált reakciók a 24a nak nek 20 vannak kiemelve. A jelölt szénatomok (C6, C7 és C8) 35 nak nek 39 koplanárisak a sp7 konfigurációjú C7-gyel. A CcbZ aktív helyén található NAD + koenzim valószínűleg a fenti sík si oldalán található (lásd: 35, 39). (B) A reakció CDP-α-ᴅ-glükóz 4,6-dehidratáz által katalizált. A jelölt szénatomok (C4, C5 és C6) 43 és 44. várhatóan koplanáris is lesz.

Következtetés

Anyagok és metódusok

Anyagok és baktériumtörzsek.

Az enzimek általános klónozása és expressziója.

Kémiai szintézis.

A kémiai szintézis és szerkezete 11, 12, 22., [6-2 H]-11., és [7-2H]-11. az SI függelék S2.1 – S2.3, S2.7 és S2.8.

Általános HPLC-eluálási körülmények.

A GDP-oktok tisztítását és az enzimatikus termékek HPLC elemzését Dionex CarboPac PA1 analitikai oszlop (1 ml/perc áramlási sebesség) vagy Dionex CarboPac PA1 félpreparatív oszlop (4 ml/perc áramlási sebesség) alkalmazásával végeztük UV-abszorbancia detektálással 254 ° C-on. nm. A gradiens eluálást két oldószeres rendszerben hajtottuk végre H2O oldószerrel A oldószerrel és 1,0 M NH4OAc (vizes) oldószerrel B oldószerrel a következő körülmények között: 0–2 perc 10% B oldószer, 2–10 perc 10–50% oldószer B, 10-25 perc 50-90% B oldószer, 25-27 perc 90% B oldószer és 27-30 perc 90-10% B oldószer.

Az enzimatikus tevékenység általános szűrése.

Egy adott szubsztrát enzimatikus aktivitását úgy határozzuk meg, hogy 100 μM vizsgálandó vegyületet és 50 μM NAD + -ot összekeverünk 2,5 μM enzimmel vagy enzimek kombinációjával 100 mM Tris pufferben (pH 8,0) szobahőmérsékleten 30 percig vagy 1 órán át. Inkubálás után az enzimeket centrifugális szűréssel eltávolítottuk YM-10 szűrők alkalmazásával. A szűrletet HPLC-vel analizáltuk Dionex CarboPac PA1 analitikai oszlop alkalmazásával.

CcbS Activity Assay.

A feltételezett szubsztrátot CcbS fehérjével (33 μM), 1-glutamáttal (2 mM) és PLP-vel (66 μM) inkubáltuk 100 mM Tris pufferben (pH 8,0) szobahőmérsékleten 1 órán át. A fehérjék YM-10 szűrőkkel végzett centrifugális szűréssel történő eltávolítása után a szűrletet HPLC-vel analizáltuk Dionex CarboPac PA1 analitikai oszlop alkalmazásával.

A GDP fordított transzaminálása-ᴅ-α-ᴅ-Linkozamid (12), CcbS.

Szintetikus GDP-ᴅ-α-ᴅ-linkozamid 12. (66 μM) (SI függelék, S2.2) inkubáltuk CcbS-sel (33 μM), α-ketoglutaráttal (2 mM) és PLP-vel (66 μM) 100 mM Tris pufferben (pH 8,0) szobahőmérsékleten 2 órán át. . Inkubálás után az enzimeket centrifugális szűréssel eltávolítottuk YM-10 szűrők alkalmazásával. A szűrletet HPLC-vel analizáltuk Dionex CarboPac PA1 analitikai oszlop alkalmazásával.

Az enzimatikus reakciótermékek redukciója NaBD4 vagy NaBH4 alkalmazásával.

Inkubálás után az enzimeket centrifugális szűréssel eltávolítottuk YM-10 szűrők alkalmazásával. A szűrletet ezután 5 mM NaBD4-gyel vagy NaBH4-gyel ddH20-ban inkubáljuk 30 percig, majd a reakciót acetonnal leállítjuk. A kapott elegyet HPLC-vel analizáltuk Dionex CarboPac PA1 analitikai oszlop alkalmazásával, és a termékeket szükség esetén Dionex CarboPac PA1 szemipreparatív oszlopon tisztítottuk.

Adatok elérhetősége.

Az ezekhez a vizsgálatokhoz kapcsolódó összes adatot a fő szöveg vagy az SI függelék tartalmazza.

Köszönetnyilvánítás

A cikk egyes részeit a C.-I.L. (2015) és az S.-A.W. (2019), a texasi egyetem, Austin. Ezt a munkát az NIH (GM035906) és a Welch Alapítvány (F-1511) támogatásai támogatták. Az Austini Texas Egyetemen működő Bruker AVANCE III 500 NMR-t az NSF támogatta (1 S10 OD021508-01).

Lábjegyzetek

S. 1 S.-A.W. és C.-I.L. egyformán járult hozzá ehhez a munkához.

↵ 2 Jelenlegi cím: Természettudományi Kémiai Laboratórium, Gyógyszerésztudományi Doktori Iskola, Tokiói Egyetem, 113-0033 Tokió, Japán.

↵ 3 Jelenlegi cím: Alkalmazott Biológiai Kémia Tanszék, Agrár- és Élettudományi Doktori Iskola, Tokiói Egyetem, 113-8657 Tokió, Japán.