A magas zsírtartalmú étrend és a fizikai aktivitás hatása a piruvát-dehidrogenáz kináz-4-re az egér vázizomzatában

Rita Rinnankoski-Tuikka

1 Neuromuszkuláris Kutatóközpont, Fizikai aktivitás biológiai tanszék, Jyväskylä Egyetem, Jyväskylä, Finnország

Mika Silvennoinen

1 Neuromuszkuláris Kutatóközpont, Fizikai aktivitás biológiai tanszék, Jyväskylä Egyetem, Jyväskylä, Finnország

Sira Torvinen

1 Neuromuszkuláris Kutatóközpont, Fizikai aktivitás biológiai tanszék, Jyväskylä Egyetem, Jyväskylä, Finnország

Juha J Hulmi

1 Neuromuszkuláris Kutatóközpont, Fizikai aktivitás biológiai tanszék, Jyväskylä Egyetem, Jyväskylä, Finnország

Maarit Lehti

3 LIKES Sport- és Egészségtudományi Kutatóközpont, Jyväskylä Egyetem, Jyväskylä, Finnország

Riikka Kivelä

1 Neuromuszkuláris Kutatóközpont, Fizikai aktivitás biológiai tanszék, Jyväskylä Egyetem, Jyväskylä, Finnország

Hilkka Reunanen

2 Biológiai és Környezettudományi Tanszék, Jyväskylä Egyetem, Jyväskylä, Finnország

Heikki Kainulainen

1 Neuromuszkuláris Kutatóközpont, Fizikai aktivitás biológiai tanszék, Jyväskylä Egyetem, Jyväskylä, Finnország

Absztrakt

Háttér

A PDK4 expresszióját fokozza a cukorbetegség, az éhezés és más körülmények, amelyek a glükóz energiaforrásként zsírsavakra történő áttéréséből adódnak. Korábban kimutatták, hogy a peroxiszóma-proliferátor által aktivált 1α-koaktivátor (PGC-1α), az energia-anyagcsere fő szabályozója, sejtvonalakban koaktiválja a piruvát-dehidrogenáz-kináz-4 (PDK4) génexpressziót az ösztrogénnel kapcsolatos α-receptoron keresztül (ERRα). . Vizsgáltuk a hosszú távú magas zsírtartalmú étrend és a fizikai aktivitás hatásait a PDK4, PGC-1α és ERRα expressziójára, valamint a mitokondriumok mennyiségére és működésére a vázizomzatban.

Mód

Az inzulinrezisztenciát magas zsírtartalmú (HF) étrend indukálta 19 hétig C57BL/6 J egerekben, amelyek ülő vagy mozgó kerekekhez hozzáférhetőek voltak. Megmértük a PDK4, PGC-1α és ERRα vázizom expressziós szintjét, és értékeltük a mitokondriális funkció minőségét és mennyiségét.

Eredmények

A HF egerek inzulinrezisztensebbek voltak, mint az alacsony zsírtartalmú (LF) táplált egerek. A HK diéta után a PDK4 és ERRα mRNS és fehérje szintek szabályozását figyelték meg, és futással kombinálva még mélyebb hatásokat figyeltek meg az mRNS expresszió szintjén. A krónikus HF táplálás és az önkéntes futás nem volt szignifikáns hatással a PGC-1α mRNS vagy fehérje szintre. Nem találtunk figyelemre méltó különbséget a mitokondrium mennyiségében vagy funkciójában.

Következtetések

Eredményeink alátámasztják azt a nézetet, hogy az inzulinrezisztenciát nem a mitokondriumok csökkent kvalitatív vagy kvantitatív tulajdonságai közvetítik. Ehelyett a PDK4 szerepét kell fontolóra venni, mint a magas zsírtartalmú étrend okozta inzulinrezisztencia lehetséges hozzájárulóját.

Háttér

Számos tanulmány feltételezte, hogy az elhízás és az ülő életmód és a nyugati étrend okozta metabolikus szindróma csökkenti a vázizmok képességét a felgyülemlett lipidek oxidálására [1,2]. Korábban ezt javasolták a csökkent mitokondriális tartalom, valamint a mitokondriális biogenezis és funkció miatt [[3-8], ami összefüggést sejtet a mitokondriális diszfunkció és az inzulinrezisztencia között, a mitokondrium kvalitatív és kvantitatív változásai lehetnek a végső okok [9,10 ]. A legújabb tanulmányok azonban meggyőzően kimutatták, hogy a magas zsírtartalmú étrend valójában növeli a vázizom mitokondriális biogenezisét és zsírsav-oxidációs képességét [11-13], és hogy a lipidek által kiváltott inzulinrezisztencia fizikai aktivitás hiányában szorosan összefügg a hiányos β-oxidációval és mitokondriális túlterhelés vagy „mitokondriális stressz” [14]. Mitokondriális hibák önmagukban, pl. hiányos elektrontranszportlánc, úgy tűnik, nem ezek okozzák az inzulinrezisztenciát [15].

Mód

Állatok és diéták

A futó kerekeket 12 órán át lezárták az áldozat előtt. 3 órás éheztetés után az állatokat lemérjük, majd méhnyak diszlokációval feláldozzuk. Vér- és szérummintákat vettünk a triglicerid-, koleszterin- és szabad zsírsav-mérésekhez. Az izmokat extensor digitorum longus (EDL), soleus, gastrocnemius és quadriceps femoris (QF), valamint az epididymális zsírpárnákat kivágtuk az állatokból, lemértük és előkészítettük további elemzésre. A teljes RNS izolálást a bal gasztrocnemiuszból végeztük. Az izom oxigénfogyasztásának méréseit a jobb QF-ből végeztük, a Western-blotoláshoz homogenátumokat, a bal oldali QF-ből pedig szövettani mintákat készítettünk. A szövettani mintákat keresztirányban orientáltuk, és OCT vegyületre (Tissue Tek, Sakura Finetek Europe) szereltük fel, majd folyékony nitrogénnel (-160 ° C) hűtött izopentánban fagyasztva rögzítettük. Elektronmikroszkópos elemzéseket a soleus izomból végeztünk. A kísérlet felállítását és az adatgyűjtési pontokat az 1. ábra foglalja össze .

A tanulmányterv összefoglalása. A kísérlet felépítését és az adatgyűjtési pontokat összefoglaló grafikon.

Szérumelemzések

Egynapos böjt után vérmintát vettünk a 9. és a 18. héten, és meghatároztuk a vércukorszintet (HemoCue, Ängelholm, Svédország). Az inzulint egy ultraérzékeny patkány inzulin ELISA készlettel analizáltuk a gyártó protokollja szerint (Crystal Chem Inc., Downers Grove, IL, USA). Az inzulinrezisztenciát a glükóz és az inzulin éhomi értékeinek szorzatával becsültük meg. A triglicerideket, az összes koleszterint és a szabad zsírsavakat a végpont szérum mintákból mértük, amelyek közül a triglicerideket és a koleszterint a VITROS DT60 II kémiai rendszer (Ortho-Clinical Diagnostics, Rochester, NY, USA) segítségével mértük. A Wako NEFA C tesztkészletet (Wako Chemicals GmbH, Neuss, Németország) mikrolemez formátumra kicsinyítve alkalmaztuk a szabad zsírsavak (FFA) meghatározására.

RNS extrakció és cDNS szintézis

A teljes RNS-t (kb. 50 mg-ból) izoláltuk a gastrocnemiusból Trizol reagenssel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a gyártó utasításainak megfelelően. Az izommintákat FastPrep (Bio101 Systems, USA) szövethomogenizátorral homogenizáltuk Lysing Matrix D (Q-Biogene, USA) alkalmazásával. Az RNS koncentrációját és tisztaságát fotometriásan határoztuk meg 260 nm és 280 nm hullámhosszakon. Az RNS integritását agarózgél-elektroforézissel ellenőriztük. Öt mikrogramm teljes RNS-t fordítottunk át a cDNS szintetizálásához (SuperScript III Reverse Transcriptase kit, Invitrogen). A hatékony mRNS-transzkripcióhoz oligo primerek (Oligomer, Helsinki, Finnország) keverékét alkalmazták, amely 20 dT maradékot, majd további két nukleotidot tartalmazott, amelyek csak az mRNS poli (A) farka 5 ’végén hegednek.

Valós idejű kvantitatív PCR

Az ERRα, PCG-1α és PDK4 mRNS expressziós szintjét az ABI 7300 Real-Time PCR rendszerrel (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) határoztuk meg. A TaqMan primer és szonda készleteket az Applied Biosystems tervezte és szintetizálta. A génbank belépési számai és az Applied Biosystems assay azonosítói a következők voltak:> NM_007953.2 és Mm00433142_m1 (ERRα),> NM_008904.1 és Mm01208833_m1 (PGC-1α),> NM_013743.2 és Mm00443326_m1 (PDK4). Az alkalmazott PCR-ciklus paraméterek a következők voltak: + 50 ° C 2 percig, + 95 ° C 10 percig, 40 ciklus + 95 ° C-on 15 másodpercig és + 60 ° C 1 percig. Az összes mintát három példányban elemeztük. A génexpressziókat Quant-iT ™ PicoGreen® assay (Invitrogen) alkalmazásával normalizáltuk a gyártó utasításainak megfelelően. A Rico-cDNS-hibridek teljes mennyiségének kvantitatív meghatározásához PicoGreen-módszert alkalmaztunk a reverz átírással mRNS-termékek oldatából [40].

Western blottolás

Az SDH aktivitás képelemzése

A QF-izom sorozatos keresztmetszeteit (8 μm) egy kriomikrotómába vágtuk (–25 ° C). A szukcinát-dehidrogenáz (SDH) aktivitását használták az izomrostok oxidációs kapacitásának markereként, Pette és Tyler leírása szerint [43].

Az SDH-val festett keresztmetszeteket (n = 4-12 állat/csoport) színes mikroszkóppal rögzítettük (Olympus BX-50, Olympus Optical, Tokió, Japán). Digitálisan rögzített képeket (20-szoros nagyítás), izomkeresztmetszetenként legalább három látómezővel, ImageJ szoftverrel (NIH, Bethesda, MD, USA) dolgoztunk fel és elemeztünk. A képeket 8 bites szürkeárnyalatos (a szürke színtartomány 0–255) képekké alakították át. Az SDH aktivitásnak megfelelő minimális intenzitási értékeket képviselő intenzitási küszöböt manuálisan és egységesen állítottuk be az összes kép esetében (legkevésbé oxidatív szürke szint 46–90; a legoxidatívabb 140–255). A három intenzitással skálázott, a rostok különböző oxidációs kapacitását képviselő frakciókat a mért terület százalékában fejeztük ki.

A mitokondriális tartalom elektronmikroszkópos elemzése

A nyelvhal darabjait (n = 5 állat/csoport) 3% glutáraldehiddel 0,1 M foszfátpufferben rögzítettük 2–2,5 órán át + 4 ° C-on, és 1% -os ozmium-tetroxiddal utólag rögzítettük ugyanabban a pufferben + 4 ° C-on. C 1 órán át. A mintákat uranil-acetátban festettük, etanolban dehidratáltuk és LX-112-be (Ladd) ágyazottuk. A szemitin metszeteket kivágtuk, toluidinkékkel festettük és fénymikroszkóppal vizsgáltuk a keresztirányú orientáció optimalizálása érdekében. Ezt követően ultravékony metszeteket vágtak, rácsokra rögzítettek és uranil-acetáttal és ólom-citráttal festették. Az egyes blokkok legjobb részéből mikroszkópos felvételeket készítettünk Jeol JEM-1200 elektronmikroszkóppal, 2500x elsődleges nagyítással. Ellenőrizték, hogy különböző sejtekből (10–13 sejt/szakasz) készítettek-e mikrográfokat, és hogy szarkolemmális területeket is bevontak-e. Összesen 343 mikrográfot elemeztek az AnalySIS szoftver (Olympus) segítségével. A szubkolemmális mitokondriumok mennyiségét mitokondriális területként fejeztük ki (μm 2), és a szarkolemma hosszához (μm) viszonyítottuk.

A mitokondriális légzés mérései

A QF izomminták homogenizálását és a mitokondriális légzésméréshez történő izolálását főleg Wardlaw és mtsai szerint végezték [44]. kisebb módosításokkal. Röviden: a mitokondriális légzési sebességet (30 μl frissen készített mitokondriumot) mértük 25 ° C-on Clark típusú oxigénelektróddal (Hansatech Instruments Ltd, Anglia) egy reakcióközegben. A légzésszámot komplex I szubsztrátok, piruvát (5 mM) és malát (2,5 mM) jelenlétében rögzítettük. A 3. állapotú légzést 150 mM ADP (1,5 mM pufferben) hozzáadásával indítottuk el. Az oxigénfogyasztás összefüggésben volt a szuszpenzió fehérjetartalmával, amelyet három példányban határoztak meg a gyártó utasításai szerint (BCA assay kit, Pierce). A QF izomhomogenátumok mitokondriális légzési arányait ugyanazon eljárással mértük, mint az izolált mitokondriumok légzését.

Statisztikai analízis

A 19 hetes kísérlet végén megmértük a testtömeget, az epididymális zsírtömeget, valamint a gastrocnemius, a quadriceps femoris, az EDL és a soleus izmokat. Az izomtömeg mindkét végtag átlagos. * = vs. LFsed (P (ábra 2B). 2B). 12 hét után következetes különbségeket figyeltünk meg a heti futási távolságban, az LF egerek futási távolsága lényegesen magasabb volt, mint a HF egereké. Az összes kumulatív futótávolság (LF 422 ± 108 km, HF 339 ± 136 km) között azonban nem tapasztaltunk statisztikailag szignifikáns különbséget a csoportok között.

Vércukor, inzulin és lipid profil

Az éhomi glükózszint szignifikánsan magasabb volt a HF-ben az LF egerekhez képest. A HF egerek csoportján belül is volt különbség, a futóknál magasabb volt az éhomi glükózszint (táblázat (2. táblázat) .2). A HF állatoknál szignifikánsan magasabb volt az éhomi inzulinszint az LF állatokhoz képest. Becsült inzulinrezisztencia azt mutatta, hogy a HF diéta után 9 hét elteltével a HF egerek inzulinrezisztensebbek voltak, mint az LF egerek, és hogy a futás szignifikáns pozitív hatását mindkét étrendcsoportban észlelték (ábra (3. ábra). 3). HF diéta után 18 hét elteltével a HF egerek lényegesen inzulinrezisztensebbek voltak, mint az LF egerek. Azonban a HF étrend csoportban az ülő és a futó állatok között nem tapasztaltunk statisztikai különbséget, ami egyidejűleg a 2B 2B ábrán látható csökkent futási aktivitással .

2. táblázat

Az egerek vérprofiljai a 19 hetes kísérlet után

AlapadatokZsírszegény étrendNagy zsírtartalmú étrendANOVAP-értékÜlő (n = 14)Fut (n = 15)Ülő (n = 14)Fut (n = 15)DiétaFutásDiéta * Futás

Összes koleszterin (mmol/l) #	2,99 ± 0,88	2,70 ± 0,36	4,90 ± 0,54 ***	4,52 ± 0,49 ***, ¤¤¤	0,033	0,795
Trigliceridek (mmol/l)	0,97 ± 0,23	1,05 ± 0,21	1,00 ± 0,24	0,90 ± 0,13 ¤	0,274	0,807	0,089
Szabad zsírsavak (mmol/l)	0,82 ± 0,15	0,92 ± 0,16	0,49 ± 0,13 ***	0,44 ± 0,12 ***, ¤¤¤	0,572	0,108
Éhgyomri glükóz (mmol/l)	8,92 ± 1,17	8,45 ± 0,90	9,39 ± 1,12	10,53 ± 0,72 ***, §§, ¤¤¤	0.201	0,003
Éhomi inzulin (ng/ml) #	0,43 ± 0,24	0,27 ± 0,16 *	2,25 ± 1,11 ***	2,14 ± 0,82 ***, ¤¤¤	# Logaritmikus transzformáció a normalitás és az összehasonlítás érdekében.

Az éhomi vércukorszintet és az inzulint 18 hét után mértük. * = vs. LFsed (P 0,1). Fekete sáv = ülő, szürke sáv = futó.

A magas zsírtartalmú étrend hatással volt az összkoleszterinszintre és a szabad zsírsavakra (FFA), a koleszterinszint magasabb volt, és kissé váratlanul az FFA-szint alacsonyabb volt a HF csoportokban (2. táblázat). A HFexe és az LFexe csoportok az összes koleszterin, az FFA és a triglicerid szintben is különböztek.

mRNS expresszió

A PDK4 expressziós szintje (4A ábra (4A ábra) 4A) a HF-vel táplált állatokban, különösen a futással kombinálva, szignifikánsan magasabb volt, mint az LF-vel táplált állatokban. Nem figyeltünk meg változást a PGC-1α mRNS szintjének expressziójában HF diéta vagy krónikus testmozgás után (ábra (4B ábra). 4B). Az ERRα expressziója (ábra (4C ábra) 4C) szignifikánsan jobban szabályozott volt a HF-etetés után futással kombinálva, mint a három másik csoportban (P 0,1). Fekete sáv = ülő, szürke sáv = futó.

Fehérje expresszió

A fehérje expresszió szintje a QF izmokban. PDK4 (A) expresszió az összes többi csoportban magasabb expressziós szintet mutatott, összehasonlítva az LFsed egerekkel. PGC-1a (B) nem mutattak statisztikai különbségeket a csoportok között. ERRα (C) az expresszió a futás statisztikai hatását mutatta. A fehérje expresszió eredményeit az LFsed átlagértékére normalizáljuk. (D) Reprezentatív Western blot képek. n = 14-15 állat/csoport. * = vs. LFsed (P 0,1). Fekete sáv = ülő, szürke sáv = futó.

A talpizomot elektronmikroszkóppal elemeztük, amely a mitokondriumok csoportjait mutatta a szarkoléma alatt, gyakran a kapillárisok és a lipidcseppek közelében (7A. És B. Ábra). A mitokondriumok által elfoglalt terület volt

20% -kal nagyobb a HFexe egerekben, mint a HFsed egerekben és

25% -kal nagyobb, mint az LF egereknél (ábra (7A ábra, 7A), bár a különbségek statisztikailag nem voltak szignifikánsak. A mitokondrium ultrastruktúrája normális volt minden csoportban.

Elektronmikroszkóppal becsült oxidációs kapacitás. (A) Az elektronmikroszkópos mikrográfok elemzésénél a szubkolemmális mitokondrium területének egyik csoportjában sem volt statisztikai különbség a szarkoléma hosszához képest. n = 5 állat/csoport. Fekete sáv = ülő, szürke sáv = futó. (B) Elektronmikroszkópos kép a subarcolemmalis mitokondriumból. Méretarány 2 μm.