A magas zsírtartalmú étrend hatása a pulmonalis neutrofil extracelluláris csapdák kialakulására influenza-tüdőgyulladás során BALB/c egerekben

Anandi Narayana Moorthy

1 Mikrobiológiai és Immunológiai Tanszék, Orvostudományi Kar, Szingapúri Nemzeti Egyetem, Országos Egyetemi Egészségügyi Rendszer, Szingapúr

Kong Bing Tan

2 Patológiai Osztály, Nemzeti Egyetemi Kórház, Szingapúri Nemzeti Egyetem, Nemzeti Egyetemi Egészségügyi Rendszer, Szingapúr

Shi Wang

2 Patológiai Osztály, Nemzeti Egyetemi Kórház, Szingapúri Nemzeti Egyetem, Nemzeti Egyetemi Egészségügyi Rendszer, Szingapúr

Teluguakula Narasaraju

3 Állatorvosi Egészségügyi Központ, Oklahoma Állami Egyetem, Stillwater, OK, USA

Vincent T. Chow

1 Mikrobiológiai és Immunológiai Tanszék, Orvostudományi Kar, Szingapúri Nemzeti Egyetem, Országos Egyetemi Egészségügyi Rendszer, Szingapúr

Absztrakt

Az elhízás az influenza fertőzés súlyos kimenetelének független kockázati tényezője. A magasabb étkezési zsírfogyasztás összefüggésbe hozható a nagyobb morbiditással és a súlyos influenzával egérmodellekben. Azonban az elhízott egyéneknél a neutrofil extracelluláris csapdák (NET vagy NETosis) keletkezésének mértéke influenzás tüdőgyulladás során mindeddig nem ismert. Ez a tanulmány a pulmonalis NET-ek képződését vizsgálta magas zsírtartalmú étrenddel (HFD) és alacsony zsírtartalmú étrenddel (LFD) táplált BALB/c egerekben az influenza tüdőgyulladás során. Összehasonlítottuk a klinikai betegség progresszióját, a hisztopatológiát, a tüdő reaktív oxigénfajtákat és a mieloperoxidáz aktivitást is. A HFD 18 héten át történő fogyasztása szignifikánsan magasabb testtömeghez, testtömeg-indexhez és zsírbetegséghez vezetett a BALB/c egerekben az LFD-hez képest. Az egerek (HFD-n és LFD-n) halálos fertőzése influenza A/PR/8/34 (H1N1) vírussal hasonló testsúlycsökkenéshez és hisztopatológiai súlyossághoz vezetett. A NET-ek azonban viszonylag magasabb szinten képződtek a HFD-vel táplált egerekben, annak ellenére, hogy a betegség progressziójában nem volt szignifikáns különbség a HFD- és LFD-vel táplált egerek között.

Bevezetés

A neutrofilek neutrofil extracelluláris csapdákat (NET) szabadítanak fel a kórokozók, például baktériumok és gombák befogására és megölésére (1, 2), de korlátozott számú tanulmány foglalkozik vírusfertőzésekben betöltött szerepükkel (3-5). A NET-ek TLR7- és TLR8-függő módon befoghatják és semlegesíthetik a HIV-1-et (4). Másrészt, ha a NET-ek nagy számban vannak jelen, szövetkárosodást okozhatnak azáltal, hogy citotoxikus fehérjéket szabadítanak fel az extracelluláris térbe. Korábban feltártuk az aktivált neutrofilek exuberáns infiltrációját és a pulmonalis NET kiterjedt generálódását az influenza vírussal járó egerek halálos fertőzésében, amelyek hozzájárulnak a tüdőkárosodáshoz (6). Kimutattuk az összefüggést a tüdő NETosis és a hisztopatológiai súlyosság között egerekben az influenza tüdőfertőzést követő halálos pneumococcus szuperfertőzés során (7, 8). Ezek a tanulmányok hangsúlyozzák a pulmonalis NET kóros szerepét az influenza tüdőgyulladás során.

Az elhízás krónikus alacsony fokú gyulladással járt (9). A tápanyagfelesleg korlátozza az adipociták vérellátását, ami oxigénhiányhoz vezet, ami a nekrózist és a zsírszövet makrofág infiltrációját idézheti elő, ami viszont a gyulladásgátló citokinek túlzott szekréciójához vezet (10, 11). Az adipociták maguk is szekretálnak olyan adipokineket, mint például a TNF-a és az IL-6, amelyek pro-gyulladásosak és különféle anyagcsere-állapotokkal társulnak (12, 13). Fokozott perifériás neutrofil aktivitás, például szuperoxid-képződés figyelhető meg egészséges, elhízott személyeknél, és citokineknek, például az adipocitákból kiválasztott IL-8-nak tulajdonítható (14, 15). Annak ellenére, hogy a gyulladáscsökkentő citokinek, mint például a TNF-α és az IL-8, indukálhatják a NETosis-ot (1, 16), az adipozitás és a vele járó gyulladás NETosisra gyakorolt hatása még mindig nem egyértelmű.

Az elhízást a súlyos influenza okozta szövődmények független kockázati tényezőként dokumentálták a 2009-es H1N1-járvány idején (17, 18). A diéta által kiváltott elhízás (DIO) korábbi egérmodelljei az elhízás mértékét a súlyos influenza kimenetelével, valamint az ebből következő tüdő patológiával és immunfunkcióval is összefüggésbe hozták (19–21). A tüdő NETosis és az influenzás tüdőgyulladás kimenetele közötti összefüggés elhízott személyeknél eddig nem ismert. Tekintettel arra, hogy a zsírszövetek olyan gyulladásgátló környezetet részesítenek előnyben, amely potenciálisan aktiválhatja a neutrofileket, feltételezzük, hogy a magasabb zsírtartalom hozzájárulhat a pulmonalis NET-ek nagyobb mértékű kialakulásához, ami súlyosbítja az influenza tüdőgyulladás kóros kimenetelét. Ennek a tanulmánynak a célja a magas zsírtartalmú étrend (HFD) és az alacsony zsírtartalmú étrend (LFD) hatásainak vizsgálata és összehasonlítása volt a NETosis mértékére a BALB/c egerek tüdejében a halálos influenza alatt.

Anyagok és metódusok

Állatok, etika és étrend

Minden állatkísérletet a Szingapúri Nemzeti Egyetem Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottságának szabályzata szerint hajtottak végre (protokollszám: 050/11). A négyhetes BALB/c hím egereket 1 hétig akklimatizálták standard chow-val, mielőtt megkezdték a tervezett étrendet (Research Diets). Az egereket véletlenszerűen két csoportra osztottuk, azaz mindegyik csoportot 18 héten keresztül LFD-vel (10% kcal étkezési zsírból) vagy HFD-vel (45% kcal étkezési zsírból) tápláltuk. Minden héten friss takarmányt biztosítottak. A testtömeget, a BMI-t [súly (g)/orr-végbélnyílás hossza (mm 2)] és a táplálékfelvételt hetente mértük. Az elfogyasztott kalóriákat az elfogyasztott élelmiszerek alapján számoltuk (azaz 1 g LFD = 3,85 kcal; 1 g HFD = 4,73 kcal). A vércukorszintet Accu-Check Performa glükométerrel (Roche) mértük a 18 hetes étrend kezdetén és végén. A 18. hét végén mindkét egércsoportból olyan szerveket gyűjtöttünk be, mint a tüdő, az agy, a vesék, a szív, a máj, a lép, az ivarmirigyek fehér zsírszövete, a perirenális régiók és az interscapularis barna zsírszövet (IBAT)., lemértük és metszettük a hematoxilin és az eozin (H&E) festését.

Egerek fertőzése influenza vírussal

Az American Type Culture Collectionból származó A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) influenza vírustörzset (PR8) embrióniás petesejtekben szaporítottuk, a korábban leírtak szerint (7). A 18 hetes táplálkozási ütemtervet követően mindkét étrendcsoportba tartozó egereket intratracheálisan fertőztük egy halálos dózisú PR8 vírussal, azaz 50 plakkképző egységgel (PFU). Az érzéstelenítést 75 mg/kg ketamin és 1 mg/kg medetomidin alkalmazásával végeztük, és visszafordítottuk atipamezol-hidroklorid (5 mg/ml) alkalmazásával. A kontroll egerek kizárólag foszfáttal pufferolt sóoldatot (PBS) kaptak. Az egereket a fertőzés utáni 6. és 10. napon eutanizálták, tüdejüket kivágták, az egyik lebenyt 4% paraformaldehidben rögzítették, míg a másik lebenyt a következő vizsgálatokhoz fagyasztva rögzítették.

A tüdőszövet hisztopatológiai pontozása

A formalinnal fixált tüdőket dehidratálták és paraffinba ágyazták. A H & E-vel festett tüdőszakaszokat (5 μm) módosított kritériumok alapján vakon hisztopatológiai pontozásnak vetették alá (22). A végső sérülési pontszámot a következő képlet alapján számoltuk ki: 1 × (alveoláris vérzés, 0–3) + 2 × (alveoláris infiltrátum, 0–3) + 2 × (bronchioláris infiltrátum, 0–3) + 2 × (fibrin, 0 –3) + 1 × (alveoláris septum torlódás, 0–3), ahol 0–3 0-ra utal, hiányzik, 1 = enyhe, 2 = mérsékelt és 3 = súlyos.

Hálózatok festése és mennyiségi meghatározása a tüdőszövetben

A tüdőrészekben található neutrofil extracelluláris csapdákat háromszoros immunjelöléssel számszerűsítettük, az előzőekben leírtak szerint (7). Röviden, a tüdőmetszeteket (5 μm) H2B hiszton (Abcam), mieloperoxidáz (MPO, Abcam) és DAPI (Life Technologies) elleni antitestekkel festettük. A NET-eket egyetlen szálakként vagy klaszterként azonosították, és az előre meghatározott kritériumok (0–10) alapján értékelték. Húsz mezőt elemeztek, és az összeget kiszámították a NETs végső pontszámához.

A vírusos titerek meghatározása

A fagyott tüdőszöveteket a szelíd MACS szövet disszociátorral (Miltenyi Biotech) homogenizáltuk. A vírustitereket plakkvizsgálattal határoztuk meg, a korábban leírtak szerint (23).

Hidrogén-peroxid és mieloperoxidáz vizsgálatok

A hidrogén-peroxid (H2O2) koncentrációját a tüdőben az Amplex vörös hidrogén-peroxid/peroxidáz vizsgálati készlet (Invitrogen) segítségével mértük. Az MPO aktivitást a korábban leírtak szerint határoztuk meg (8). Röviden: 10 μl tüdőhomogenátumot összekevertünk 190 μl frissen elkészített vizsgálati oldattal (26,9 ml H2O, 2,0 ml 0,1 M nátrium-foszfátpuffer, pH 7,0, 0,1 ml 0,1 M H2O2 és 0,048 ml guaiacol), és az abszorbanciát azonnal leolvastuk. 470 nm-en 1 percig. Az MPO-aktivitást egység/ml = (ΔO.D. × Vt × 4)/(E × Δt × Vs) × 2 egységben számoltuk, ahol ΔO.D. = optikai sűrűség változás, Vt = össztérfogat (milliliter), E = 26,6 mM -1 cm -1 (tetraguaiacol termék extinkciós együtthatója), Δt = mérési idő (perc), Vs = mintatérfogat (milliliter), és 2 az átszámítási tényező 1 cm hosszúságúra. Minden értéket a tüdőfehérje-tartalomra normalizáltunk, a Bradford-módszerrel (Bio-Rad) mért.

Statisztikai elemzések

A statisztikai elemzéseket az SPSS (22. verzió) segítségével végeztük. A parametrikus adatok elemzéséhez a Student t-tesztjét használták, míg a nem parametrikus adatok elemzéséhez a Mann – Whitney U tesztet használták. Tukov post hoc korrekcióval rendelkező ANOVA-t alkalmaztak több mint két csoport összehasonlítására. A 0,05-nél, 0,01-nél és 0,001-nél kisebb P-értékeket változó mértékben szignifikánsnak tekintették.

Eredmények

A HFD egerek nagyobb testtömeget és testzsírt nyernek az LFD egerekhez képest

A HFD-n lévő egereknél szignifikánsan nagyobb volt a testtömeg (P (1A, B ábra. 1 A, B). Bár az elfogyasztott élelmiszer mennyisége általában hasonló volt a csoportok között, a HFD egerek egérenként több kalóriát fogyasztottak, mint az LFD egerek, a HFD magasabb zsírszázaléka miatt (P (1C, D ábrák. 1 C, D). Vércukorszintjük azonban nem mutatott ki szignifikáns különbséget (P = 0,239) (az adatokat nem közöltük).

A HFD egerek magasabb testtömeg-paramétereket mutatnak, mint az LFD egerek. Az 5 hetes BALB/c egereket HFD-vel vagy LFD-vel tápláltuk 18 héten keresztül. Ezen étrend befejezése után a HFD egerek száma szignifikánsan magasabb volt (A) súlygyarapodás és (B) BMI. Habár (C) egérenkénti heti táplálékfelvétel összehasonlítható volt a két csoport között, (D) a tényleges elfogyasztott kalóriák a HFD magasabb étkezési zsírtartalma miatt változtak. Az értékek a táplálékcsoportonként (3 független tétel) 15 egér átlagát ± SE-t adják, ANOVA segítségével, Tukey post hoc korrekcióval.

A HFD egereknél viszonylag nagyobb WAT felhalmozódás mutatkozott az ivarmirigyben (P = 0,1) és a perirenalis zsírpárnákban (P = 0,2), IBAT (P = 0,1) (ábra (2A ábra). 2A). Az olyan szervek, mint a szív (P = 0,7) és a vesék (P = 0,4), valamint a zsírpárnák viszonylag nagyobb súlyt mutattak az LFD egerekhez képest, bár statisztikailag nem szignifikánsak (ábra (2B ábra). 2 B). A lép (P = 0,2), a tüdő (P = 1,0) és a máj (P = 1,0) súlya kissé csökkent a HFD egereknél, míg az agy súlya (P = 1,0) összehasonlítható volt a két csoport között. Nem észleltünk szignifikáns különbséget a zsírszövet szövettanában a két csoport között (az adatokat nem közöljük).

A HFD egerek viszonylag nagyobb testzsír felhalmozódást mutatnak, mint az LFD egerek. (A) LFD és HFD egerek WAT és IBAT bruttó anatómiája. A zsírpárnák (különösen az ivarmirigyek) nagyobbnak tűntek a HFD csoportban. (B) A különböző szervek nedves súlya és az LFD és HFD egerek zsírpárnái 18 hetes étrendjük után. Az értékek három egér átlagát ± SE-t jelzik étrendcsoportonként (egy adagban), Mann – Whitney U-teszt alapján.

A fertőzött HFD egerek viszonylag megnövelték a tüdő vírusterhelését, de hasonló tüdőpatológiát mutatnak, mint az LFD egerek

Az influenza A vírussal végzett halálos fertőzés után az LFD és a HFD egerek egyaránt hasonló testsúlycsökkenést mutattak (P (3A ábra). 3 A). A tüdő vírustiterje a HFD csoportban majdnem háromszor magasabb volt, mint az LFD csoportban, bár statisztikailag nem szignifikáns (P = 0,401) (ábra (3B ábra). 3 B). Egy korábbi DIO-tanulmány szintén kissé megemelkedett influenza vírustitereket figyelt meg a HFD egerekben, jelezve, hogy az elhízás csak marginális hatást gyakorol a vírus replikációjára a gazdán belül (19). Noha a hisztopatológiai elemzések a teljes súlyossági pontszám relatív csökkenését mutatták a fertőzött HFD csoportban 6 DPI-nél (P = 0,108), a pontszám 10 DPI-vel lett összehasonlítható a fertőzött LFD-csoporttal (P = 0,725) (ábrák (3C, D ábrák) 3 C, D). Az egerek mindkét csoportja az alveoláris septák megvastagodását, fokozott gyulladásos sejtes infiltrációt mutatott az alveolaris és bronchiolaris terekben, és 10 DPI-vel fokozta az alveoláris fibrin lerakódását.

A fertőzött HFD egerek hasonló testsúlycsökkenést mutatnak, de viszonylag magasabb tüdő vírustiterek, mint a fertőzött LFD egerek. Az egereket halálos dózissal (50 PFU) influenza A PR8 vírussal fertőztük meg, és a tüdőt 6 és 10 DPI-vel gyűjtöttük össze. (A) A fertőzött HFD (INF) és LFD (INF) egerek mindkét csoportja hasonló mértékű, jelentős testtömeg-csökkenést mutatott, de a PBS-t kapó kontroll egerek (MOCK) nem. (B) A vírustiterek viszonylag magasabbak voltak a fertőzött HFD csoportban 6 DPI-nél. 10 DPI-nél nem észleltek vírust. (CD) A fertőzött csoportok hisztopatológiai súlyossági mutatói nem különböztek szignifikánsan. AV, alveolusok. Nagyítás: panelek = 100 ×, betétek = 1000 ×. Az értékek csoportonként öt egér átlagát ± SE jelentik (két független kísérlet). A diákok t-tesztjét alkalmaztuk a vírustiter meghatározásához és az ANOVA-t Tukey post hoc korrekcióval a testtömeghez és hisztopatológiai elemzésekhez.

A tüdő ROS és NET-ek viszonylag fokozott képződése fertőzött HFD egerekben

A H2O2 koncentráció a tüdőben viszonylag magasabb volt a fertőzött HFD egerekben 6 DPI mellett (P = 0,08), ami a tüdőben megnövekedett oxidatív stresszt jelzi az LFD egerekhez képest (ábra (4A ábra). 4 A). Az MPO aktivitás azonban viszonylag alacsonyabb volt (P = 0,151 és 0,128; 6 és 10 DPI) a fertőzött HFD egerekben az LFD egerekhez képest (ábra (4B ábra). 4B). A fertőzött HFD egerek viszonylag magasabb NET-ek képződésének tendenciáját mutatták tüdejükben 6 DPI (P = 0,104) és 10 DPI (P = 0,111) mellett (ábrák (4C, D ábrák). 4 C, D). Eredményeink egybevágnak az elhízott egyének fokozott neutrofil aktivitását dokumentáló korábbi jelentésekkel és az egér DIO modelljeivel (14, 15, 24).

A fertőzött HFD egerek viszonylag magasabb pulmonális NET-pontszámot és H2O2-koncentrációt mutatnak. (A) A H2O2 koncentrációja a fertőzött HFD egerek tüdejében viszonylag magasabb volt 6 DPI-nél. 10 DPI-re mindkét fertőzött csoportban hasonlóak voltak a koncentrációk. (B) A MPO aktivitás a fertőzött LFD egerek tüdejében viszonylag magasabb volt 6 DPI-nél. 10 DPI-re az MPO aktivitás általában alacsony volt mind az LFD, mind a HFD csoportokban. (C) Háromszoros immunjelölt tüdőszövet reprezentatív képei a NET-ek azonosításához (kék = DAPI, zöld = hiszton H2B és piros = MPO), skála sáv = 25 μm. (D) A fertőzött HFD egerek tüdeje viszonylag nagyobb NET képződést mutat be az LFD egerekhez képest, mind 6, mind 10 DPI-nél. Az értékek csoportonként öt egér átlagát ± SE jelentik (két független kísérlet). Tukov post hoc korrekcióval ellátott ANOVA-t használtunk.

Vita

Az elhízás széles körű elterjedése aggodalomra ad okot az egészségügyi hatóságok számára világszerte. Amellett, hogy számos anyagcserezavarhoz vezet, például a 2-es típusú cukorbetegséghez és az érelmeszesedéshez, az elhízás hatással lehet a légzőszervek egészségére is (25). Az elhízás fokozza az érzékenységet az influenzával kapcsolatos szövődményekre és a közösség által szerzett tüdőgyulladásra (17, 26). Míg a DIO-val és az influenzával kapcsolatos korábbi vizsgálatok elsősorban az immunsejtek, például a T-sejtek, a makrofágok és a neutrofilek működésére összpontosítottak, mindeddig nincsenek hírek az elhízott egyénekben keletkező NET-ek mértékéről. Mivel a NET-ek sok kóros állapotban érintettek, jelentőségük az elhízásban, különösen az influenza tüdőgyulladása során, fokozott figyelmet igényel (6, 7, 27, 28).

Bár tanulmányunk feltárta, hogy a HFD-n és az LFD-n lévő BALB/c egerek mindkét csoportja hasonló klinikai progresszióban szenvedett az influenza tüdőgyulladás során, a tüdő patofiziológiájában és az immunválaszban finom különbségek lehetnek. Felmértük és összehasonlítottuk a vírustiteret, a H2O2 koncentrációt, az MPO aktivitást, a hisztopatológiai súlyosságot és a pulmonalis NET kialakulását a két étrendi csoport között. Ha a HFD fogyasztása megváltoztatja az egerek immunválaszát, az befolyásolhatja a vírus replikációját. A magasabb pulmonalis vírusterhelés fokozott NET-stimulációt eredményezhet a megnövekedett pro-gyulladásos citokin-jelátvitel és az oxidatív stressz miatt, tekintettel arra, hogy a NETosis oxidatív folyamat.

Ebben a tanulmányban BALB/c egereket használtunk a konzisztencia érdekében, és összehasonlítottuk korábbi modelljeinkkel az influenza tüdőgyulladás alatti NET-ekről. Bár a HFD-n lévő BALB/c egereket nem tekintették szigorúan „elhízottaknak”, elegendően nagyobb mennyiségű zsírszövetet mutattak ki ahhoz, hogy szignifikáns különbséget eredményezzenek a BMI és a testtömeg között, amelyek szintén humán vizsgálatok során alkalmazott paraméterek (17, 18). Ugyanakkor a HFD-n lévő más egér törzseket (pl. C57/BL6, svájci albínó egerek) szintén meg kell vizsgálni a NET-ek keletkezésének mértékét az influenza okozta fertőzés után. Vizsgálatunk a tüdő NETosis adipozitással összefüggő általában magasabb trendjét tárta fel. Ez arra utal, hogy morbid elhízott egyéneknél a pulmonalis NET-ek jelentős mértékben kialakulhatnak az influenza fertőzésre adott válaszként, ami súlyosbíthatja a tüdőkárosodást és az influenza tüdőgyulladás szövődményeit. Összegzésként bemutatjuk, hogy a HFD hosszan tartó fogyasztása miatt megnövekedett zsírbetegség viszonylag nagyobb NET-ek kialakulásához vezethet az egér tüdőben súlyos influenza-tüdőgyulladás során.

Etikai nyilatkozat

A kísérleteket az állatokon elvégzendő összes eljárás jóváhagyásának megszerzését követően végeztük el a Szingapúri Nemzeti Egyetem Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottságától (protokollszám: 050/11).

Szerző közreműködései

Az AM megtervezte és elvégezte a kísérleteket, elemezte az adatokat és megírta a kéziratot. SW és KT hozzájárult a hisztopatológiai pontozáshoz. A TN hozzájárult az adatok elemzéséhez. A VC megtervezte és felügyelte a kísérleteket, és megírta a kéziratot.

Összeférhetetlenségi nyilatkozat

A szerzők kijelentik, hogy a kutatást bármilyen kereskedelmi vagy pénzügyi kapcsolat hiányában végezték, amely potenciális összeférhetetlenségként értelmezhető.

Köszönetnyilvánítás

Hálásak vagyunk M. C. Phoon, S. H. Lau és F. L. Yan technikai segítségéért. A tanulmányt a Szingapúri Nemzeti Egyetem támogatta.