A magas zsírtartalmú étrend megváltoztatja a xenobiotikumok modulációs hatását a citokróm P450 aktivitására

Társított adatok

Absztrakt

A citokróm P450 monooxigenáz (P450) enzimek metabolizálják a kritikus endogén vegyi anyagokat, és szinte az összes xenobiotikumot oxidálják. A nem szabályozott P450 aktivitások megváltoztatják a gyógyszer-anyagcsere képességét és a sejtes stresszt. A vegyes expozíciónak a P450 expressziójára és aktivitására gyakorolt hatása változó és megfoghatatlan. A magas zsírtartalmú étrend (HFD) gyakori expozíció, amely elhízást és a kapcsolódó patológiákat eredményez, beleértve a hepatotoxicitást is. Itt beszámolunk a cigarettafüst hatásáról a normál testsúlyú P450 aktivitásra és a HFD által kiváltott elhízott egerekre. Az aktivitáson alapuló fehérje profilalkotási eredmények azt mutatják, hogy a HFD egereknél jelentősen csökkent a gyulladáscsökkentő vegyi anyagok által kiváltott P450 aktivitás, és hogy a méregtelenítésben, a xenobiotikus anyagcserében és az epesav szintézisben szerepet játszó P450 hatását HFD és füst kölcsönhatás érte. A dohányzás megnövelte az összes tüdő P450 aktivitását, és a diéta együttes expozíciója hatással volt a P450 2s1-re. A terápiás gyógyszeradagolás biztonságának és hatékonyságának növelése érdekében bővítenünk kell a megváltozott P450 anyagcseréhez kapcsolódó közös expozíció megértését.

Grafikai absztrakt

BEVEZETÉS

A felnőttkori elhízás aránya világszerte megduplázódott 1980 óta, a felnőttek 39% -a minősül túlsúlyosnak 1. Az étrend által kiváltott elhízás (DIO) krónikus gyulladással, oxidatív stresszel és fokozott érzékenységgel jár együttes betegségek széles skálájára, beleértve a 2-es típusú cukorbetegséget (T2DM), a magas vérnyomást, az alkoholmentes zsírmáj betegségeket (NAFLD), az epehólyag betegségét és néhány rákot 2. A normális testtömegű egyénekhez képest az elhízott egyéneknél is nagyobb a 3., 4. hepatotoxicitás kockázata, és olyan fiziológiai változásokat tapasztalnak, amelyek megváltoztatják a gyógyszer metabolizmusának farmakokinetikáját (PK) és farmakodinamikáját (PD). Az elhízás által kiváltott PK és PD változások változóak, és feltételezhető, hogy a véráramlás, a zsírszövet eloszlás, a 7., 8. mikrobiom összetétel és a gyógyszer metabolizáló enzimek (DME) funkcionális állapota megváltoztatja 9. Ezen ismeretek ellenére a gyógyszeradagolási ajánlások továbbra is elsősorban az egészséges testsúlyú egyének klinikai értékeléséből származnak. Az elhízott egyének nagyon alulreprezentáltak ezekben az értékelésekben, ezáltal rosszul meghatározott és potenciálisan káros gyógyszeradagolási rendekhez vezetnek az elhízott betegek számára 4–6, 10 .

A P450 aktivitás ABPP-je egyéni vagy egyidejű expozíció miatt. Az egereket HFD-nek és/vagy CSE-nek tettük ki, és a májat és a tüdőt összegyűjtöttük. A mikroszómákat izoláltuk a szöveti homogenizátumokból, és inkubáltuk aktivitásalapú próbákkal (ABP). A P450 jelölést követően click kémiai eljárással alkalmaztuk az azido biotint, és a fehérje-szonda-biotin komplexeket streptavidin gyantán dúsítottuk. Az ABP-t célzó enzimeket tripszinnel emésztettük gyantán, és a kapott peptideket kvantitatív, nagy felbontású LC-MS-sel elemeztük.

KÍSÉRLETI ELJÁRÁSOK

Állatok és étrend.

A C57BL/6J hím egereket normál étrenddel (SD) és magas zsírtartalmú étrenddel (HFD) tápláltuk, a Jackson Laboratóriumtól (Bar Harbor, ME). Csak a hím egereket vonták be ebbe a vizsgálatba, mivel a nem dokumentált tényező, amely befolyásolja egyes P450 24 kifejeződését és aktivitását, és a változók korlátozását választottuk a fókuszált vizsgálati hatókör biztosítása érdekében. Az egereket az AALAS által akkreditált állattartó létesítményhez, valamint a csak orrot tartó csövekhez igazítottuk egy hétig a CSE megkezdése előtt. A takarmányt és a csapvizet ad libitum szolgáltatták, kivéve, ha az állatokat expozíciós csövekbe helyezték. Minden állatot naponta kétszer figyeltünk meg a mortalitás és az elhullás szempontjából. Minden eljárást a Csendes-óceán északnyugati nemzeti laboratóriumának intézményi állatgondozási és felhasználási bizottságainak jóváhagyásával hajtottak végre. Az SD-diéták PMI® 5002 tanúsított rágcsáló-étrendből álltak (PMI 5002 Rodent Diet®, Richmond, IN;

13 kcal% zsír) HFD volt a D12492 rágcsáló étrend (Research Diets Inc., New Brunswick, NJ; 60 kcal% zsír), hat hetes korban kezdve, és a vizsgálat egész ideje alatt folytatódott. A HFD egereket kilenc héten keresztül etették ezt a diétát a kéthetes CSE-rendszer megkezdése előtt, ami a testtömeg jelentős növekedését eredményezte az SD állatokhoz képest ugyanabban az időszakban (2. ábra).

Átlagos testtömeg (A), és az átlagos szérum glükóz (B) boncoláskor (± SE, n = 8). 11 héten keresztül SD-n vagy HFD-n a HFD egerek jelentősen megnőttek (p 14. A füstkoncentrációt (μg WTPM/L) gravimetriásan határoztuk meg az első, harmadik és ötödik órán át gyűjtött párhuzamos szűrőmintákból. 5 órás expozíciós idő: A füstmintákat Cambridge-stílusú, 47 mm-es üvegszálas szűrőkön vettük fel, és az átlagos expozíciós koncentrációt a szűrőn összegyűjtött tömeg és a szűrőn keresztül beszívott teljes levegő térfogata alapján számítottuk, a mintadarab időtartama alapján. áramlási sebesség.

Karboxihemoglobin koncentráció meghatározása.

Az utolsó expozíciót követően az állatokat altattuk (izoflurán), és az orbitális orrmellékből vért vettünk a karboxihemoglobin (COHb) meghatározásához OSM3 hemoximéterrel (Radiométer, Koppenhága, Dánia). Az állatokat eltávolítottuk az expozíciós egységből, és belül megkezdtük a vérgyűjtést

5 perc. A vérmintákat kálium-EDTA-t tartalmazó csövekbe gyűjtöttük, és elemzésig jégfürdőbe helyeztük.

Szövetgyűjtemény.

Az utolsó expozíciót követő napon az egereket pentobarbitállal eutanizálták és exsanguálták. Minden egér máját és tüdejét összegyűjtöttük, flash-fagyasztva tároltuk -80 ° C-on.

Szérum glükózmérés.

Glükóz kalorimetrikus vizsgálati készletet (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MA) használtunk a gyártó utasításai szerint a szérum glükóz mennyiségének meghatározásához. Röviden, ez a glükóz-oxidáz alapú vizsgálat H2O2 mellékterméket eredményez a minta glükóz enzimatikus oxidációjából és az azt követő enzim reoxidációs reakcióból. A torma-peroxidáz ezután katalizálja a 3,5-diklór-2-hidroxi-benzolszulfonsav és a 4-amino-antipirin H2O2-oxidációját, így optimális abszorpcióval rendelkező termékeket képez 514 nm-en. Inkubálás után (37 ° C, 10 perc) az abszorbanciát (514 nm) mikrolemezes spektrofotométerrel (SpectraMax Plus 384, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) mértük.

ABPP minta előkészítése.

A májat és a tüdőt borotvával aprítottuk, 250 mM szacharózpufferben jégen homogenizáltuk és a mikroszómákat soros centrifugálással izoláltuk, a korábban leírtak szerint 18. Pierce Bicinchronic acid (BCA) kitet (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) alkalmaztunk a mikroszómális fehérje koncentrációk meghatározásához; a vizsgálat abszorbanciáját (562 nm) SpectraMax Plus 384-gyel mértük. A mikroszómákat 250 mM szacharózzal 1,00 mg/ml fehérjekoncentrációra állítottuk be, és minden állat- és szövettípushoz duplán mintákat készítettünk, 1,00 ml és 0,60 ml májmérettel. illetve a tüdő. Minden párból egy mintát készítettünk nullaktivitás (NA) kontroll párjaként a P450 aktivitás profilozásához előkészített mintákhoz.

Proteomikus adatok elemzése.

A peptid MS/MS spektrumokat a tömegspektrum-generáló függvény plusz (MSGF +) 25 algoritmus segítségével kerestük a nyilvánosan elérhető Mus musculus által lefordított genomszekvenciával szemben (www.uniprot.org; 2013. szeptemberi gyűjtemény). Legalább 6 aminosavmaradékra volt szükség a peptidanalízishez, és az MSGF-pontszám ≤ 1E-10 volt, ami megfelel a becsült hamis felfedezési aránynak (FDR) 26. Ezután az egyes adatsorok megfelelő peptidjellemzőit ≤ 5% -os FDR-re szűrtük, az AMT-címke konfidencia-mutatójának statisztikai eszközeivel 27 .

Az aktív és passzív dohányzást utánzó füstáramok egyidejű létrehozására módosított cigarettadohányzó készüléket a kijelölt kamrák portjaiban alkalmazták az egerek aktív vagy passzív cigarettafüstnek vagy szűrt levegőnek (NoCSE) való kitettségére. Az ACSE (250 WTPM/L; 250 ppm CO) és a PCSE (85 WTPM/L; 250 ppm CO) dóziscéljait a korábbi vizsgálatok által meghatározott szinteken alapozták 14. A tényleges leadott dózisokat az egyes célpontok 10% -án belül tartották, pl. ACS esetén 254,9 ± 10,6 WTPM/L és PCS esetében 82,0 ± 6,7 WTPM/L, a kapcsolódó CO-szintek 251,2 ± 6,6 ppm és 276,1 ± 8,8 ppm voltak. Valamennyi CSE egérnél a vér karboxihemoglobin (COHb) szintje szignifikánsan megemelkedett a NoCSE kontroll egerekhez képest, míg a COHb szint közel azonos volt az ACSE és a PCSE egereknél, és statisztikailag nem különbözött a HFD egereknél (1. táblázat).

Asztal 1.

A vér karboxihemoglobin (COHb) szintje 8 napos cigarettafüst-expozíció után.