A magas zsírtartalmú étrend megváltoztatta a szív metabolikus génprofilját Psammomys obesus futóegér

Absztrakt

Háttér

Metabolikus rendellenességekben a szívizom zsíros beszivárgása kritikusan összefügg a lipotoxikus kardiomiopátiával.

Mód

Húsz Psammomys obesus a futóegéreket véletlenszerűen rendeltük normál növényi vagy magas zsírtartalmú étrendhez. Tizenhat héttel később a szívizomból mintát vettek a kórélettani értékelés céljából.

Eredmények

A tizenhat hetes, magas zsírtartalmú étrend a szívizom szerkezetének dezorganizálódását eredményezte, kollagén lerakódásokkal, lipidfelhalmozódással, kardiomiocita apoptózissal és gyulladásos sejtek beszűrésével. A glükóz transzporter GLUT1 és a piruvát-dehidrogenáz (PDH) inhibitor, a PDH kináz (PDK) 4 szívizom expressziója nőtt, míg az inzulin által szabályozott GLUT4 expresszió változatlan maradt. A zsírsavtranszportot szabályozó molekulák, a CD36 és a zsírsavkötő fehérje (FABP) 3 miokardiális expressziója fokozódott, míg a sebességet szabályozó zsírsav-β-oxidáció, a karnitin-palmitoil-transzferáz (CPT) 1B expressziója csökkent. Az AMP-aktivált protein-kináz (AMPK) szívizom-expressziója csökkent, míg a peroxiszóma-proliferátor-aktivált receptorok (PPAR) -α és -γ expressziója nem változott.

Következtetés

A magas zsírtartalmú étrendben Psammomys obesus, a táplálkozás által kiváltott metabolikus szindróma eredeti kísérleti modellje, amely a genetikai hajlamot és a környezeti kölcsönhatásokat ötvözi, rövid ideig tartó magas zsírtartalmú táplálkozás elegendő volt a szívizom szerkezeti elváltozásainak kiváltásához, összefüggésben a szívizom metabolikus gén expressziójának megváltozásával a lipid felhalmozódás javára.

Háttér

A normális felnőtt szívben a zsírsavak az ATP-termelés fő szubsztrátjai, míg a glükóz-oxidáció kevésbé járul hozzá az energiatermeléshez [1]. A megváltozott anyagcsere-profil mellett a krónikus, magas zsírtartalmú étrend-fogyasztás hozzájárul a szabályozatlan glükóz- és zsírsav-anyagcseréhez, ami általános szabályozatlan energia-homeosztázishoz vezet [2]. A szívben ez a szívizom szerkezetének és működésének sokféle adaptációjával és változásával jár együtt, amelyek az alanyokban fordulnak elő, amikor a zsírszövet és a lipidek rendellenesen halmozódnak fel, még társbetegségek, például 2-es típusú cukorbetegség vagy magas vérnyomás hiányában is [3]. Az elhízás fokozott szívizom lipid felhalmozódással járt [4, 5], amely összefüggésben volt a diasztolés diszfunkcióval [6]. A trigliceridek fokozott szívizom intracelluláris szintjét az elhízás különféle kísérleti modelljeiben is gyakran leírták [7, 8]. A szabad zsírsavak magas plazmaszintjének krónikus expozíciója toxikus lipid intermedierek felhalmozódását okozhatja a kardiomiocitákban, ami összefüggésben van a szív lipotoxicitásával [9]. Az elhízás okozta kardiomiopátiához vezető mechanizmusok azonban nagyrészt ismeretlenek [10].

A tápanyagfelesleghez való sajátos kóros alkalmazkodása miatt, Psammomys obesus az elhízás és a metabolikus szindróma eredeti táplálkozási szempontból kontrollált és genetikailag előre meghatározott kísérleti modellje [11]. Halofil növényekből álló természetes étrendjén, Psammomys obesus egészséges, a sivatagi élethez igazodó anyagcsere-endokrin rendszerrel. Fogságban spontán és természetes módon cukorbetegség, diszlipidémia és elhízás alakul ki, amikor standard laboratóriumi rágcsáló-chow-diétával etetik őket [11]. Ez a kóros alkalmazkodás a tápanyagfelesleghez megbízható kísérleti modellt jelenthet az inzulinrezisztencia és a metabolikus szindróma kialakulására való hajlam hátterében álló mechanizmusok tanulmányozásához olyan embereknél, akik a hiánytól a bőséges táplálékfelvételig fejlődnek [12]. Ezekben az állatokban a magas zsírtartalmú étrend rövid ideje jelentős súlygyarapodást és a keringő zsírsavak szintjének növekedését, valamint a kalciumkezelő kontrakciós fehérjék szívizom-expressziójának megváltozását eredményezte [13].

Ebben a kontextusban a jelen tanulmány célja annak feltárása volt, hogy a magas zsírtartalmú étrend kiválthatja-e a szerkezeti változásokat, az energia-anyagcserét és a kardiomiocita életképességet ezekben a vad rágcsálókban, genetikai hajlammal az elhízás kialakulására.

Mód

Állati modell

Felnőtt Psammomys obesus futóegéreket fogtak el a Beni-Abbes algériai régióban (északi szélesség 30 ° 7 és nyugati hosszúság 2 ° 10), és két hétig 12 órán át tartó világos/sötét ciklusban külön ketrecekben helyezték el őket. Az akklimatizáció ezen időszakában az állatokat halofil növényekből álló természetes táplálékukkal etették [14, 15]. Ezt követően a 93 ± 9 g súlyú nemi egyeztetésű, nyolc hetes futóegéreket 2 csoportra osztottuk az alábbiak szerint: 1) a kontroll állatokat természetes halofil növények normál étrendjével etettük (Salicornia; a halofil növények összetétele: víz 80,8 g; ásványi sók 6,9 g; lipidek 0,4 g; fehérjék 3 g; szénhidrátok 8,4 g és 45–50 kcal/100 g); 2) a másik állatcsoport magas zsírtartalmú étrendet kapott, amely halofil növényeket tartalmaz, valamint napi egy negyed (5 g) főtt tojássárgája hozzáadása (főtt tojássárgája összetétele: víz 40–46 g; fehérjék 13,5–17,5 g; szénhidrátok 0,2 g; lipidek 30–31 g; koleszterin 1,2–1,3 g és 370–400 kcal/100 g) 16 hét alatt.

A kiinduláskor és tizenhat hetes, magas zsírtartalmú étrend után az állatokat elvérezték a retro-orbitális vénás plexusból. A vérmintákat azonnal centrifugáltuk 3000 fordulat/perc sebességgel szárított csöveken. A protokoll végén az állatokat lefejezéssel feláldoztuk. A szíveket azonnal feldarabolták, folyékony nitrogénben lefagyasztották, és - 80 ° C-on tartották a patobiológiai elemzéshez (n = 10 minden csoportban), vagy háromnapos rögzítés után Bouin vizes oldatában, parafinba totóba ágyazva hisztopatológiai értékelés céljából (n = 10 minden csoportban).

Biokémiai elemzés

A glükóz-, triglicerid- és az összkoleszterin-koncentrációt BIOSYSTEM készletekkel (Barcelona, Spanyolország) határoztuk meg plazmamintákban, a gyártó utasításainak megfelelően. Plazmát alkalmaztunk a lipoproteinek meghatározására agarózgélen Kalwakami módszerével [16]. A plazma kreatin-foszfokináz (CPK) szintjét COBAS INTEGRA Analyzer (Roche; CA, USA) alkalmazásával mértük.

A szív morfometriája

Öt mikrométeres szívizom metszetet vettünk a szív hossztengelye mentén, és az általános morfológiai elemzéshez hematoxillin-eozinnal festettük, amint azt korábban leírtuk [17]. Masson Trichrome festését alkalmazták a kollagén felhalmozódásának és a fibrózisnak a szívizom szakaszokon belüli értékelésére.

Immunhisztokémia: Apoptózison áteső szívizomsejtek kimutatása

A szív apoptotikus sejteket a terminális Deoxynucleotidyl Transferase dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) festéssel detektáltuk. ApopTagPlus peroxidáz In Situ Apoptózis detektáló készlet (Chemicon, Temecula, Kalifornia), a gyártó utasításainak megfelelően. TdT enzim nélküli negatív kontrollt és DNase-I-vel előkezelt pozitív kontrollt teszteltünk. Minden szívmintához tíz különböző, véletlenszerűen kiválasztott mezőt vizsgáltunk. A szív apoptotikus sebességét az apoptotikus magok (TUNEL-pozitív vagy barna magok) és az összes mag (barna + kék mag) arányaként számítottuk (× 100 százalékban kifejezve). Az összes számlálást két független nyomozó vakon végezte. Az elemzéshez átlagértéket használtunk.

Valós idejű kvantitatív polimeráz láncreakció (RTQ-PCR)

A teljes RNS-t kivettük a fagyasztott szívizomszövetből QIAGEN RNeasy®Mini kit (QIAGEN, Hilden, Németország) felhasználásával, a gyártó utasításainak megfelelően. Az RNS koncentrációt standard spektrofotometriás technikával határoztuk meg, és az RNS integritását a GelRed (Biotium, Hayward, Kalifornia) festett agaróz gélek vizuális ellenőrzésével értékeltük. A reverz transzkripciót random hexamer primerek és Superscript II reverz transzkriptáz (Invitrogen, Merelbeke, Belgium) alkalmazásával hajtottuk végre, a gyártó utasításainak megfelelően.

Az RTQ-PCR esetében az sense és az antiszensz primereket (1. táblázat) Primer3 programmal terveztük a Rattus norvegicus oldott hordozócsalád 2 tagja 1 (Slc2a1 vagy GLUT1) és 4 (Slc2a4 vagy GLUT4), karnitin-palmitoiltranszferáz1B (CPT1B), zsírsav transzlokáz CD36, zsírsavat kötő fehérje 3 (FABP3), peroxiszóma proliferátor által aktivált receptorok (PPAR) -alfa és gamma, AMP-aktivált protein-kináz (AMPK), piruvát-dehidrogenáz-kináz (PDK) 4, szétkapcsoló fehérje (UCP) 3, inzulinreceptor-szubsztrátok (IRS) 1 és 2, natriuretikus B-peptid (NPPB) és hipoxantin-foszforibozil-transzferáz (HPRT) 1 mRNS szekvenciák. A maradék genomi DNS nem megfelelő amplifikációjának elkerülése érdekében intron-átívelő primereket választottunk ki, amikor ismertek exonszekvenciákat. Mindegyik minta esetében az amplifikációs reakciót három példányban hajtottuk végre SYBR Green PCR Master Mix (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD, USA), specifikus primerek és hígított templát cDNS alkalmazásával. Az eredmények elemzését iCycler rendszer (BioRad Laboratories) segítségével végeztük. A relatív kvantifikálást az összehasonlító 2 -ΔΔCt módszerrel a háztartási génnel (HPRT1) végzett normalizálással értük el. Az eredményeket relatív szeres növekedésként fejeztük ki a 16 hetes normál diéta relatív mRNS-expressziójának átlagértékéhez képest, tetszőlegesen rögzítve 1.

Statisztikai analízis

Valamennyi adatot átlag ± ± átlaghibának (SEM) adtuk meg. A statisztikai elemzéseket a StatView 5.0 szoftver segítségével végeztük. A csoportok közötti különbségeket egyirányú varianciaanalízissel (egyirányú ANOVA) értékeltük, amelyet Student t-teszt követett. o

Eredmények

A krónikus, magas zsírtartalmú étrend testtömeg-növekedést és szisztémás hiperlipidémiát okozott

Amint azt a 2. táblázat szemlélteti, az alap testtömeg és a biokémiai paraméterek hasonlóak voltak a két vizsgálati csoport között Psammomys obesus futóegér. Tizenhat hetes, magas zsírtartalmú étrend után a testtömeg nagyobb mértékben nőtt, mint a normál táplálékkal etetett állatoknál (2. táblázat).

A biokémiai paramétereket tekintve a tizenhat hetes magas zsírtartalmú étrend a lipidek, köztük a trigliceridek, az összes koleszterin, az alacsony sűrűségű (LDL-c) és a nagy sűrűségű lipoprotein koleszterin (HDL-c) szintjének emelkedésével járt együtt a plazmában (2. táblázat) . Kiszámítottuk a plazma aterogén Castelli I-es kockázati indexét (az összkoleszterin és a HDL-koleszterin arányaként értékelve) és a -II-t (az LDL-koleszterin és a HDL-koleszterin arányaként értékelve). Megállapították, hogy jelentősen megnövekedtek a tizenhat hetes magas zsírtartalmú étrend után (2. táblázat). Csak a plazma magasabb glükózszintje volt (de nem szignifikáns) (a normál étrendhez képest 32% -kal nőtt) (2. táblázat). A CPK plazmaszintje nőtt (2. táblázat).

A szívizom felépítése megváltozott a tizenhat hetes, magas zsírtartalmú étrend után

Amint azt az 1a. És b. Ábra szemlélteti, a hematoxilin- és az eozinfestés normális szövettani szívfelépítést mutatott normál étrenddel etetett állatok szívizomszeleteiben myofibrillákkal és izomkötegekkel. Tizenhat hetes, magas zsírtartalmú étrend után a beszivárgó gyulladásos sejtek myocardialis felhalmozódása és a szívizomsejtek apoptózisa következett be (1c. Ábra). Ez összefüggésben volt a miokardium lipid-lerakódásával (1d. És e. Ábra), amelyek határozottan arra utalnak, hogy a szívizom lipotoxicitása valószínűleg hozzájárul a depressziós szívműködéshez és a kardiomiopátiához [18].

Reprezentatív hematoxilin és eozinnal festett szívizom szakaszok Psammomys obesus normál étrenddel táplált futóegéra, b) vagy magas zsírtartalmú étrend (c-e) 16 hét alatt. A szívizom szakaszokat 1000-szeresen kaptuk (a-d; Mérlegsorok: 20 μm) és 400-szorosak (e; Méretarány: 50 μm) nagyítás. Normál táplálékkal etetett állatokban a szívizom szakaszok normális szövettani szívfelépítést mutattak myofibrillusokkal és izomkötegekkel (a, b). A 16 hetes, magas zsírtartalmú étrenddel etetett állatokban a hematoxilin és az eozin festett szívizom szakaszai beszűrődő gyulladásos sejteket mutattak (c) és a lipidek felhalmozódása (d, e)

A fibrózis és a kollagén lerakódás felmérésére Masson Trichrome festését végeztük. A normál étrenddel etetett állatokban a szívsejtek rendezetten voltak elrendezve, strukturált szívizomrost-szerveződéssel és a perivaszkuláris területen is kevés kollagénrost-lerakódással (2a. És b. Ábra). Tizenhat hetes, magas zsírtartalmú étrend okozta a szívizom szerkezeti diszorganizációját kardiomiocita veszteséggel (2c. És e. Ábra), szívizom diffúz intersticiális (2e. Ábra) és perivaszkuláris fibrózissal (2c. És d. Ábra), ami az infiltráló sejtek myocardialis felhalmozódásával járt ( 2e) és lipidlerakódások (2f. Ábra).

A reprezentatív Masson Trichromtól festett szívizom szakaszai Psammomys obesus normál étrenddel táplált futóegéra, b) vagy magas zsírtartalmú étrenddel (c-f) 16 hét alatt. Trichrome Masson festést végeztek a fibrotikus területek detektálására (zöld színnel festett kollagén rostok; a-e). A szívizom metszeteket 400-szorosan (a-e; skála: 50 μm) és 1000-szeres (f; skála sáv: 20 μm) nagyítás. A normál étrenddel etetett állatokban a szívsejtek rendezetten voltak elrendezve, strukturált szívizomrost-szerveződéssel és kevés kollagénrost-lerakódással (a, b). 16 hetes, magas zsírtartalmú étrenddel etetett állatokban a Trichrome Masson-nal festett szívizom szakaszok diffúz fibrózist mutattak (főleg perivaszkuláris területeken; c és d) és lipidlerakódás (f)

A kardiomiocita apoptózist tizenhat hetes, magas zsírtartalmú étrend váltotta ki

Annak felmérésére, hogy a lipidek ezen miokardiális felhalmozódása összefüggésben lehet-e a szívsejtek apoptózisával, TUNEL festést végeztünk a szívizom szakaszain. Amint azt a 3a. Ábra szemlélteti, a tizenhat hetes, magas zsírtartalmú étrend diffúz apoptózist váltott ki a kardiomiocitákban. A miokardiumban megnőtt az apoptotikus sebesség Psammomys obesus magas zsírtartalmú étrenddel táplálva (3b. ábra).

A magas zsírtartalmú étrend megváltoztatta a glükóz és a lipid anyagcserében szerepet játszó molekulák szívizom-expresszióját

A magas zsírtartalmú étrend viszonylag rövid periódusának a szívenergia-termelést, beleértve a szívcukorszintet és a zsírsavanyag-anyagcserét, valamint az inzulinszignalizációt moduláló gének expressziós profiljára gyakorolt hatásainak meghatározására RT-QPCR kísérleteket végeztek. A tizenhat hetes, magas zsírtartalmú étrend növelte a szívizom gén expresszióját a fő glükóztranszporterben, a GLUT1-ben, míg az inzulinnal szabályozott glukóz transzporter, a GLUT4 expressziója változatlan maradt (4a. Ábra). A zsírsavtranszport egyik fő sejtszabályozója, a CD36 és az FABP3, a zsírsavfelvételben és az intracelluláris transzportban részt vevő intracelluláris zsírsavkötő fehérje miokardiális expressziója fokozódott, míg a zsírsav β-oxidáció sebességét szabályozó enzim expressziója fokozódott. út, a CPT1B csökkent (4b. ábra). Mindezek az eredmények arra utalnak, hogy az energiatermelő mediátorok megváltoztatták a szívizom expressziós profilját a szívizom zsírsavfelvételének és -felhalmozódásának (csökkent zsírsav-β-oxidáció) javára tizenhat hetes magas zsírtartalmú étrend után. Psammomys obesus futóegér.

Ezen metabolikus mediátorok expresszióját szabályozó jobb mechanizmusok megértése érdekében értékelték a nukleáris transzkripciós faktorok és a lipid- és glükóz metabolizmus szabályozásában, valamint az adipocita differenciálódásában szerepet játszó enzimek expresszióját. Amint azt a 4c. Ábra szemlélteti, a PPAR-α és -γ myocardialis expressziója nem változott krónikus, magas zsírtartalmú étrend után. Az AMPK, a sejtenergia-érzékelő és az UCP3, az energiaegyensúly-szabályozásban szerepet játszó mitokondriális transzporter expressziója azonban csökkent a magas zsírtartalmú étrenddel etetett állatok szívében, míg a PDK4 expressziója, amely foszforilálja (és így deaktiválja) a piruvát-dehidrogenázt (PDH) és gátolja a glükóz oxidációját, növekedett (4d. Ábra). Az IRS1 és 2 miokardiális kifejeződése nem változott (4e. Ábra).

A falszakaszra reagáló gén, a natriuretikus B peptid (BNP) szívizom expressziója

A szív megnyújtásakor a BNP koncentrációja jelentősen megnő, jelezve, hogy a szív keményebben dolgozik, és több problémát okoz a test igényeinek kielégítése, például szívelégtelenség esetén [19]. A jelen tanulmányban a magas zsírtartalmú étrenddel etetett állatok szívizomában fokozódott az NPPB, a BNP prekurzor gén expressziója (5. ábra).

Vita

Jelen eredmények azt mutatják, hogy a tizenhat hetes, magas zsírtartalmú étrend a szív szerkezetének súlyos megváltozását eredményezi, kollagén és lipid felhalmozódással, valamint az apoptotikus folyamatok diffúz aktivációjával. Psammomys obesus futóegérek, vad rágcsálók, akiknek genetikai hajlamuk van az elhízás, a cukorbetegség és a metabolikus szindróma kialakulására. Ehhez társult az energia-anyagcserét szabályozó molekulák megváltozott kardiális expressziója a szív lipidfelhalmozódása érdekében, a CD36 és FABP3 fokozott expressziója, mindkettő a sejt zsírsav transzportjában, és a PDK4, a glükóz oxidációjának kulcsszabályozója, míg a CPT1B expressziója csökkentette a zsírsav β-oxidációjának sebességét szabályozó enzim és az egyik legfontosabb sejtenergia-érzékelő AMPK értékét.

Tanulmányozza az erőt és a korlátozottságot

Psammomys obesus a metabolikus szindróma eredeti táplálkozási szempontból kontrollált és genetikailag előre meghatározott kísérleti modellje, amely tartós szívizom-biológiai elváltozásokhoz kapcsolódik [13]. A szívműködést és a kardiospecifikus biomarkerek plazmaszintjét azonban önmagában nem értékelték. Ezt további vizsgálatokban kell értékelni.

Következtetések

Összegzésképpen elmondhatom, hogy egy tizenhat hetes, magas zsírtartalmú étrend után a Psammomys obesus lipotoxikus kardiomiopátia jeleit mutatta, amelyet metabolikus átalakulás és káros metabolikus kapcsolás jellemez, ami lipid felhalmozódáshoz vezet. A táplálkozás által kiváltott metabolikus szindróma ezen egyedülálló kísérleti modellje lehetővé tette számunkra a magas zsírtartalmú étrend myocardialis hatását azoknál az állatoknál, akiknek genetikai hajlamuk van az elhízás, a 2-es típusú cukorbetegség és a metabolikus szindróma gyors kialakulására. Hasznos lehet az inzulinrezisztencia és a metabolikus szindróma kialakulására való hajlam hátterében álló mechanizmusok tanulmányozásában olyan embereknél, akik a hiánytól a bőséges táplálékfelvételig fejlődnek.

Az adatok és anyagok rendelkezésre állása

A jelenlegi tanulmány során előállított és elemzett összes releváns adat tartalmazza ezt a cikket.