A magas zsírtartalmú étrendnek való kitettség hatása a tompa ormányos keszeg májának mikroRNS-expressziójára (Megalobrama amblycephala)

Jiangsu tartomány víztáplálkozási és takarmányozási tudományának fő laboratóriuma, Nanjing Agráregyetem, Nanjing, Kína, Állattudományi és Technológiai Főiskola, Édesvízi Halászat és Csírazavarforrások Hasznosításának Fő Laboratóriuma, Mezőgazdasági Minisztérium, Édesvízi Halászati Kutatóközpont, Kínai Akadémia Halászati tudományok, Wuxi, Kína, Wuxi Halászati Főiskola, Nanjing Mezőgazdasági Egyetem, Wuxi, Kína

Jiangsu tartomány vízi táplálkozási és takarmányozási tudományának kulcsfontosságú laboratóriuma, Nanjing Mezőgazdasági Egyetem, Nanjing, Kína Állattudományi és Technológiai Főiskola

Az édesvízi halászat és a csírapláza-erőforrások hasznosításának legfontosabb laboratóriuma, Földművelésügyi Minisztérium, Édesvízi Halászati Kutatóközpont, Kínai Halászati Tudományos Akadémia, Wuxi, Kína, Wuxi Halászati Főiskola, Nanjing Mezőgazdasági Egyetem, Wuxi, Kína

Jiangsu tartomány víztáplálkozási és takarmányozási tudományának kulcsfontosságú laboratóriuma, Nanjing Mezőgazdasági Egyetem, Nanjing, Kína Állattudományi és Technológiai Főiskola

Dingdong Zhang,
Kangle Lu,
Zaijie Dong,
Guangzhen Jiang,
Weina Xu,
Wenbin Liu

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Zhang D, Lu K, Dong Z, Jiang G, Xu W, Liu W (2014) A magas zsírtartalmú étrendnek való kitettség hatása a tompa ormánymell (Megalobrama amblycephala) májának mikroRNS-expressziójára. PLoS ONE 9 (5): e96132. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0096132

Szerkesztő: Yanqiao Zhang, Ohio északkeleti orvosi egyeteme, Amerikai Egyesült Államok

Fogadott: 2014. február 9 .; Elfogadott: 2014. április 2 .; Közzétett: 2014. május 2

Finanszírozás: Ezt a munkát a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány (60901053, 31172418 és 31202005 projekt), az édesvízi halászat és a csírapláza-erőforrások hasznosításának kulcsfontosságú laboratóriumának nyílt alapja támogatta, Földművelésügyi Minisztérium, Édesvízi Halászati Kutatóközpont, Kínai Halászati Tudományos Akadémia (NO KF201310) és Jiangsu tartomány „333” projektjei. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

A tompa ormányos keszeg (Megalobrama amblycephala) egy magas gazdasági értékű halfaj, amelyet Kína édesvízi polikultúrás rendszereiben, valamint egyre inkább Ázsia más területein tenyésztenek [1]. A FAO legfrissebb halászati és akvakultúra-statisztikai évkönyve szerint Kínában a tompa ormányos keszeg teljes termelése 2010-ben elérte a 652 215 tonnát [2]. Növényevő ösztönének és a máj súlyának és a testtömeg viszonylag alacsony arányának köszönhetően a tompa ormányos keszeg nagyon érzékeny a máj steatosisára, ha intenzív tenyésztőrendszerben magas zsírtartalmú étrendet (HFD) táplálnak. Ezért ez a faj hasznos modell a lipid-anyagcsere fiziológiájának tanulmányozásához és összehasonlításához más fajok, például a zebrafish és a medaka [3], [4].

Az étkezési zsír a vízben oldódó molekulák egy csoportját tartalmazza, amely magában foglalja a koleszterint és a triglicerideket. A máj szintetizálja a lipoproteineket, és fajtól függően többé-kevésbé a zsírsavszintézis és a lipidkeringés epicentruma. A lipidcseppek felhalmozódása a hepatocitákban májsteatózist eredményez, amely számos diszfunkció, például a β-oxidáció változásának, nagyon kis sűrűségű lipoprotein szekréciójának és a zsírsavszintézisben részt vevő utak aktivációjának következményeként alakulhat ki [5]., [6]. Több májtranszkripciós faktor, beleértve a máj X receptorait [7], a retinoid X receptorokat [8], a hepatocita nukleáris faktorokat [9], a peroxiszóma proliferátor által aktivált receptorokat (PPARα, β és γ) [10], a cAMP válasz elemhez kötődő fehérjét [ 11], a szterin szabályozó elemeket megkötő fehérjék [12] és a CCAAT/enhancer kötő fehérjék [13], a lipidszintézist, a katabolizmust, a tárolást és a szekréciót szabályozó génhálózatok. Nemrégiben a mikroRNS-ek (miRNS-ek) jelentek meg a génexpresszió kritikus szabályozóiként, amelyek a máj lipid anyagcseréjét poszttranszkripciós szinten szabályozzák [14].

Anyagok és metódusok

Etikai nyilatkozat

Az összes kísérleti protokollt a Nanjing Mezőgazdasági Egyetem (Nanjing, Kína) Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá. A szövetek összegyűjtése érdekében a halakat jól szellőztetett vízben 0,01% tricaine-metánszulfonáttal (Sigma, Saint Louis, USA) érzéstelenítettük, és a kínai laboratóriumi állatok gondozásának és felhasználásának útmutatója szerint feláldoztuk őket.

Kísérleti halak és etetési kísérletek

A wuhani halkeltetőből (Hubei, Kína) gyűjtött fiatal tompa ormányos keszeget egy recirkuláló akvakultúra rendszerben nevelte. Egy hét akklimatizálás után 200 egészséges halat (súly: 20,24 ± 0,11 g) osztottak véletlenszerűen az NFD (5% zsírtartalmú étrend) és a HFD (15% zsírtartalmú étrend) csoportokba (n = 100 csoportonként). Minden 480 literes tartályban 25 hal volt. A halakat naponta háromszor kezelték látszólagos jóllakottságig (6: 00–6: 30, 12: 00–12: 30 és 18: 00–18: 30). A tompa ormányos keszeget ellenőrzött környezetben tartottuk, 12/12 órás világos-sötét ciklus mellett, 28 ° C-on. A kísérleti étrendek megfogalmazását és a környezeti minőségi preferenciákat bevett protokollokból vettük [26], [27]. Mindegyik étrendet négy ismételt tartályban tesztelték, és a vizsgálat nyolc hétig tartott.

Mintagyűjtés és RNS kivonás

Nyolc hetes nevelés után a májszöveteket eltávolították a halakból, azonnal folyékony nitrogénben lefagyasztották, majd felhasználásig -80 ° C-on tárolták. A miRNS-szekvenáláshoz összesen 16 halat (olajvörös O-festéssel validált; lásd alább) választottak ki két csoportból (egy-egy hím és egy nőstény mind a nyolc tartályból). A teljes RNS-t a mirVana microRNS izoláló készlet (Ambion, Austin, USA) segítségével extraháltuk a gyártó utasításainak megfelelően. A teljes RNS minőségét és mennyiségét Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, CA, USA) alkalmazásával határoztuk meg. A szekvenáláshoz 8,0-nél nagyobb RNS-integritású RNS-mintákat dolgoztunk fel. Az NFD csoport 8 egyenértékű RNS-koncentrációjú RNS-mintáját és az egyenértékű RNS-koncentrációjú HFD-csoport 8 RNS-mintáját egyesítettük a szekvenáláshoz, ill.

Olajvörös O festés

Háromszor foszfáttal pufferolt sóoldattal történő mosás után a szeletelt májmintákat 10% -os formalinnal foszfátpufferban rögzítettük 1 órán át szobahőmérsékleten. A mintákat ezután foszfáttal pufferolt sóoldattal mostuk, és szűrt olajvörös O (Sigma-Aldrich) oldattal (0,5 g 100 ml izopropil-alkoholban) 15 percig szobahőmérsékleten festettük. Festés után a mintákat kétszer öblítettük desztillált vízzel 15 percig. A metszeteket Mayer hematoxylinnel is ellenfestették a magok megjelenítéséhez [4].

Kis RNS könyvtár előkészítése és szekvenálása

Kis RNS-eket (16–30 nt) izoláltunk az összes RNS-mintából méretfrakcionálással, 15% denaturáló poliakrilamid gélelektroforézissel. Ezután a szabadalmaztatott adaptereket (Illumina, San Diego, USA) ligáltuk a kis RNS-ek 5 'és 3' végéhez, és a reverz transzkripciót az Illumina protokoll szerint hajtottuk végre. A keletkezett kis cDNS könyvtárakat PCR-rel amplifikáltuk az adapter szekvenciákkal komplementer primerek alkalmazásával. Ezután a cDNS könyvtárakat mélyen szekvenálták a HiSeq2000 rendszer segítségével (Illumina, San Diego, USA) a Pekingi Genomikai Intézetben (Shenzhen, Kína), a gyártó utasításainak megfelelően. Minden kis RNS és RNASeq adat az NCBI SRA-ban (Sequence Read Archive) érhető el az SRX494382 és az SRX494377 csatlakozások alatt.

Szekvenciaelemzés és miRNS azonosítás

A szekvenálási adatok differenciális expressziós elemzése

Az NFD és HFD csoportból előállított cDNS könyvtárakban a miRNS-ek expressziós szintjének összehasonlításához a szekvenálási adatokat az alábbiak szerint normalizáltuk:. Ha egy adott miRNS normalizált expressziója nulla volt, akkor annak expressziós értékét 0,01-nek állítottuk be. Ezen felül miRNS-ek normalizált expressziós értékekkel. A normalizált expressziós értékekből P-értékeket állítottunk elő, az alábbiak szerint [29], ahol N1 és N2 a tiszta olvasások teljes számát jelenti a HFD és NFD könyvtárakban, valamint x és y az adott miRNS normalizált expressziós szintjét jelenti a HFD és az NFD könyvtárakban:

Kvantitatív valós idejű PCR elemzés

A miRNS-ek reverz transzkripcióját miRNS-specifikus szár-hurok primerek és a PrimeScript RT Reagent Kit (Takara Bio, Dalian, Kína) segítségével végeztük. Minden 20 µl reakció 1 µl PrimeScript RT Enzyme Mix I-t, 4 µl 5 × PrimeScript puffert, 6 µl nukleáz-mentes vizet, 5 µl RNS-templátot és 4 µl őshurkú primert tartalmazott (S1 és S2 táblázat). . A reverz transzkripciót úgy hajtottuk végre, hogy a reakciókat 16 ° C-on 30 percig, 42 ° C-on 30 percig, majd 85 ° C-on 5 percig inkubáltuk. A valós idejű PCR-amplifikációt SYBR Premix EX Taq II Kit (Takara Bio, Dalian, Kína) segítségével végeztük. Mindegyik 25 µl reakció 1,3 µl cDNS-templátot, 12,5 µl SYBR Premix EX Taq II-t, 1 µl miRNS-specifikus forward primert (10 µM), 1 µl univerzális reverz primert (10 µM) és 9,2 µl RNáz- szabad víz. A termikus ciklust 7900HT gyors, valós idejű PCR rendszeren (Applied Biosystems, Foster, USA) hajtottuk végre az alábbiak szerint: 95 ° C 10 percig, majd 40 ciklus 95 ° C 30 másodpercig, 60 ° C 30 másodpercig, és 72 ° C-on 45 másodpercig. Olvadásgörbe programot hajtottunk végre amplifikáció után. Az adatokat összehasonlító CT módszerrel elemeztük [△ CT = CT (miRNS) - CT (Rpl13a)], endogén referenciaként Rpl13a expressziót használva [30], [31].

A relatív miRNS célgének expresszióját PrimeScript RT Master Mix Kit és SYBR Premix Ex Taq II Kit (Takara Bio, Dalian, Kína) alkalmazásával határoztuk meg. A valós idejű PCR-protokollt 95 ° C-on 10 percig indítottuk, majd 40 ciklust követett egy kétlépéses amplifikációs program (15 másodperc 95 ° C-on; 40 másodperc 60-62 ° C-on), az alkalmazott primerkészlet szerint (S3. Táblázat). Az olvadási görbéket szisztematikusan monitoroztuk az utolsó amplifikációs ciklus végén, hogy megerősítsük az amplifikációs reakció specifikusságát. Az adatokat összehasonlító CT módszerrel elemeztük [△ CT = CT (mRNS) - CT (ACTB)], az ACTB expressziót használva endogén referenciaként.

A miRNS célgének előrejelzése és elemzése

A differenciálisan expresszált miRNS-ek célgénjeit az RNAhybrid (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid) és a TargetScan (http://www.targetscan.org/) predikciós csomagok segítségével azonosítottuk. A cél előrejelzéséhez használt kritériumok a következők voltak: (i) legfeljebb négy eltérés a kis RNS és a cél között (a GU bázisok 0,5 eltérésnek számítanak), (ii) legfeljebb két szomszédos eltérés a miRNS/cél duplexben, (iii) nincsenek szomszédos eltérések a miRNS/célduplex 2–12. pozíciójában (a miRNS 5 'vége), (iv) nincsenek eltérések a miRNS/célduplex 10–11. pozícióiban, (v) legfeljebb 2,5 a miRNS/célduplex 1–12. pozíciójának (a miRNS 5'-vége) és (vi) a miRNS minimális szabad energiája (MFE) és a tökéletesre kötött miRNS MFE-jének ≥75% -a kiegészítés. Az RNAhybrid és a TargetScan által azonosított, és az M. amblycephala máj összehasonlító transzkriptóm szekvenálási elemzésünk eredményeiben jelen lévő lipid anyagcserével kapcsolatos célgéneket (az adatokat nem mutatjuk be) figyelembe vettük a további vizsgálatokhoz. Azokat a funkciókat, amelyek szignifikánsan társultak a miRNS-ek előre jelzett célgénjeihez, egy GO (http://www.geneontology.org) biológiai folyamatanalízissel és egy KEGG útvonalanalízissel (http://www.genome.jp/kegg/) határoztuk meg. pathway.html).

Eredmények és vita

A lipidek májfelhalmozódása HFD-vel táplált és NFD-táplált tompa ormányos keszegben

A HFD-nek való kitettség felhasználható a máj steatosisának kiváltására állatmodellekben [26]. A lipid anyagcsere vizsgálatához és a máj steatosishoz kapcsolódó miRNS-ek azonosításához a tompa ormányos keszeget nyolc hétig HFD-vel vagy NFD-vel etették. A májszövet-minták olajvörös O-festése súlyos máj lipidfelhalmozódást mutatott ki HFD-vel táplált halakban, de nem NFD-vel táplált halakban (1A. És 1B. Ábra).