A mechanikus szortírozás és a DNS metabarkódolás összehasonlítása az étrend elemzéséhez lebomlott farkas pikkelyekkel

Absztrakt

Bevezetés

A módszerek összehasonlításának biztosításához esettanulmányként az Alexander-szigeteki farkasra (Canis lupus ligoni) összpontosítottunk. Az Sándor-szigeteki farkast többször is benyújtották, hogy az Egyesült Államok veszélyeztetett fajokról szóló törvénye (ESA) alapján fenyegetésként szerepeljen. Ezek a farkasok viszonylagos földrajzi elszigeteltségben fordulnak elő Alaszka délkeleti részén, ahol az élőhelyek elvesztése, az elsődleges zsákmányállomány csökkenése és a farkasok betakarítása nyomán aggodalomra ad okot a populáció jövője. A délkelet-alaszkai regionális léptékű farkasállomány-becslések a Sitka fekete farkú szarvas (Odocoileus hemionus sitkensis) várható bőségén alapultak, feltételezve, hogy a farkasok szorosan kötődnek elsődleges zsákmányuk rengetegéhez. Ez nyilvánvaló az ESA legutóbbi fajállapot-áttekintésében, ahol a szarvasok élőhelyének minőségi mutatóit alkalmazták a farkasok bőségének kiszámításához (U.S. Fish and Wildlife Service 2015).

A Wales-i herceg-szigeti farkasok (POW) (1. ábra) különös aggodalomra adtak okot a legfrissebb értékelésben (2015), mert a magas farkastermés mellett a POW-n Alaszka délkeleti részén a legmagasabb az öreg növekedésű fakitermelés aránya (Albert és Schoen 2013, Person and Brinkman 2017). Az előrejelzések szerint az őzek populációja csökken, mivel az ízletes aljnövényzetű ágakat és cserjéket tartalmazó öreg erdők sűrű, egyenletes korú, zárt lombos erdőkké alakulnak (Alaback 1982, Schoen et al. 1988, Person et al. 1996, Farmer and Kirchhoff 2007, Gilbert et al. 2016, Person and Brinkman 2017, Porter 2018), amelyeket a szarvasok erőteljesen kerülnek (Wallmo és Schoen 980, Kohira és Rexstad 1997, Gilbert és mtsai 2017). A szarvasok voltak a leggyakrabban előforduló zsákmányfajok az Alexander-szigeteki farkas számára a POW-on végzett korábbi kutatások alapján (Kohira 1995, Person et al. 1996, Kohira és Rexstad 1997). A farkasfertőzések mechanikus válogatása azonban jelentős más mennyiségű zsákmányt tárt fel (Kohira 1995), és a parti farkasok ebben a régióban jelentős mennyiségű szezonálisan lazacot és egyéb tengeri erőforrásokat fogyaszthatnak (Szepanski et al. 1999, Darimont et al. 2003, 2004, 2008a, Lafferty és mtsai 2014), ami azt sugallja, hogy a farkasállomány bőségét a szarvason kívül más zsákmány elérhetősége is diktálhatja. Következésképpen a farkasok étrendjével kapcsolatos ismeretek finomítása a rendszerben fontos következményekkel jár a farkasok kezelésére, az ESA lehetséges megfontolásaira és az Alaszka délkeleti részén található erdőgazdálkodásra vonatkozóan.

Tanulmány területi térkép, amely az Alaszka délkeleti részén található Sándor-szigetcsoportot mutatja. A vörös és a sárga pont az egyes scat gyűjtési helyeket jelöli. A legtöbb scats gyűjtemény a Wales Prince-szigetre koncentrálódott (sárga pontok).

Itt adjuk meg a húsevő diéta elemzésének első hivatalos összehasonlítását mechanikus szortírozás és DNS metabarkódolás segítségével, opportunista módon gyűjtött scats felhasználásával, feltételezett lebomlási spektrumban mérsékelt éghajlatú esőerdőben, amely ellenséges a DNS megőrzésével szemben. Megvizsgáltuk, hogy a metabarkódolás sokszínűbb farkastáplálást mutatott-e be, mint a mechanikus válogatás, nagyobb rendszertani pontosságot értek-e el, és azonosítottak-e ritkán fogyasztott zsákmányfajokat. Bevettük mind a nagymértékben lebomlott, mind a frissen megjelenő scatsokat, és felmértük, hogy a molekuláris feldolgozás során bevezetett pikkelyek kora vagy torzításai befolyásolták-e a metabarkódolás által bemutatott étrendprofilt. Ezenkívül részletesen elemeztük az Alexander-szigeteki farkasdiétákat, különös tekintettel a walesi herceg-szigetre, hogy meghatározzuk a farkasok zsákmányprofilját és szarvasoktól való függését.

Anyagok és metódusok

Tanulmányi terület és terepi gyűjtés

Délkelet-Alaszka az Alexander-szigetcsoportban fekszik, amely több mint 2000 nevezett szigetből áll (1. ábra) (Cook és mtsai 2006). Ez a régió évente 130–400 cm csapadékot kap (Shanley és mtsai. 2015), így különösen vendégszeretetlenné teszi a DNS megőrzését a kitett környezeti mintákban. A szárazföldet a zord parti hegység és alacsonyabb magasságú, mérsékelt éghajlatú esőerdők támasztják alá. A természetes széttöredezettség és elszigeteltség eredményeként a Csendes-óceán északi partvidéke számos endemikus növény- és állattartást támogat, különösen a Wales Prince-szigeten, a szigetcsoport legnagyobb szigetén (Cook és mtsai. 2006, MacDonald és Cook 2007, Smith 2016). . Az erdős terület nagy része az Egyesült Államok Erdészeti Szolgálata által kezelt Tongass Nemzeti Erdőn belül található. Ez az ökoszisztéma sokféle emlősnek ad otthont, beleértve olyan ikonikus fajokat, mint a Sitka fekete farkú szarvas (Odocoileus hemionus sitkensis), az amerikai fekete medve (Ursus americanus), az észak-amerikai hód (Castor canadensis), az amerikai nyest (Martes americanus), a hegyi kecske (Oreamnos) americanus), Steller oroszlánfóka (Eumetopias jubatus), kikötőfóka (Phoca vitulina) és jávorszarvas (Alces alces). A fajok eloszlása és összetétele a régió szigetein és szárazföldi területein változik.

A farkasfertőzéseket a farkasút útvonalain, a barlangok közelében és a másodlagos utakon gyűjtöttük össze a 2014. október - 2015. december közötti tervezett scat gyűjtési felmérések során (1. ábra). Elsősorban a Wales-i herceg szigetén (55 ° 46’45.9480 ”É; 132 ° 49’ 4.7748 ”NY) (n = 145) gyűjtöttünk farkasfertőzéseket, de opportunista módon más szárazföldi és szigeti rendszerekben is gyűjtöttünk mintákat (n = 38). Becsültük a scat életkorát (friss [3 hónap]) a megjelenés, a legutóbbi helyszíni látogatás óta eltelt idő (Ciucci et al. 1996) és az expozíciós idő alapján, figyelembe véve, hogy a scats esőerdei környezetben gyorsan lebomlik (Wallmo et al. 1962, Ciucci et al. 1996, Darimont és mtsai. 2008b) (2. ábra). Az összegyűjtött farkas pelyheket műanyag zacskókban tároltuk, felcímkéztük a helyét, dátumát és a holt észlelt korát, majd fagyasztottuk (-20 ° C). Fagyasztott pelyheket szállítottak az Oregoni Állami Egyetemre minták előkészítése és elemzése céljából.

Példák a farkasfertőzésekre Alaszka délkeleti részén, a Wales Prince-sziget közelében. A bal oldali panelek (a, c és e) a friss (3 hónapos) scats példái. Az életkort a gyűjtő határozta meg; scats-ot gyűjtöttek 2014 és 2015 között.

Mechanikus válogatás

Délkelet-Alaszkában összegyűjtött farkaskutya zsákmányfajainak finomléptékű mechanikai rendezési eredményeit ábrázoló fényképek, 2014-2015. A bal felső paneltől indulva és az óramutató járásával megegyező irányban haladva a látható fajok a lazac, a fekete medve, a kopasz sas, a pecsétfóka és a szár.

Molekuláris elemzés

Az egyes scat-okból tárolt almintákat felhasználva az egyes mintákból kivontuk a DNS-t a Qiagen DNeasy Blood and Tissue kit (Qiagen, Hilden, Németország) segítségével, kis módosításokkal az alábbiak szerint: 500 ul ATL puffer, 50 ul K protein protein és 1,0 mm cirkónium/Szilika-gyöngyöket (BioSpec Products, Bartlesville, OK) adtunk az 1,7 ml-es csőhöz, amely a pikkelysömeget tartalmazta. A mintákat 10 percig vortexeltük maximális sebességgel, majd 4-6 órán át 56 ° C-on inkubáltuk. A DNS-t 100 ul teljes térfogatban eluáltuk. Negatív kontrollt extraháltunk a DNS-extrakció minden egyes körével (kb. 17 minta) a lehetséges keresztszennyeződés azonosítása érdekében.

A kezdeti PCR után az összes PCR amplikont megtisztítottuk PCRClean DX szilárd fázisú reverzibilis immobilizációs mágnesgyöngyökkel (Aline Biosciences, Woburn, MA). Mindegyik PCR-reakciót mennyiségileg meghatároztuk Accublue nagy érzékenységű dsDNS kvantitációs készlettel (Biotium, Fremont, CA), és 6 ng/ul értékre normalizáltuk. Ezután a 384 PCR termék minden csoportját egyetlen könyvtárba egyesítettük, összesen 3 könyvtárba. Ezután az egyes könyvtárakat további 6 bázispár azonosító indexel láttuk el a NEBnext Ultra II DNS Library Prep kit (New England Biolabs, Ipswich, MA) felhasználásával. Az egyesített mintákat bioanalizátorral elemeztük a fragmens méretének megerősítésére. Ezután a könyvtárakat az Illumina HiSeq 3000 2 × 150 bp PE egyik sávján szekvenálták az Oregoni Állami Egyetem Genomkutató és Biotechnikai Központjában.

Szekvenciaelemzés

A nyers szekvencia-leolvasásokat bioinformatikai csővezeték segítségével elemeztük, amelyet a leolvasott szekvencia leolvasására és szétválogatására terveztek a scat minta azonosítása szerint. A bioinformatikai folyamat vázlata a következő: (1) a nyers leolvasásokat párosítottuk a PEAR segítségével (Zhang et al. 2013); (2) ezt követi a demultiplexelés, az egyes mintákhoz hasonlóan 8 alappár pár indexszekvenciával (az eltéréseket eldobjuk); (3) végül az egyes mintákból származó szekvenciákat 100% -os hasonlósággal csoportosítottuk, és taxonómiailag hozzárendeltük a BLAST-ot a GenSank 12S gerinces szekvenciáival szemben és egy egyedi 12S adatbázisból.

Hasonlóak a De Barba és mtsai által alkalmazott lépésenkénti módszerekhez. (2014), a taxonómiailag kijelölt szekvenciákon szűrési és minőség-ellenőrzési intézkedések sorozatát hajtották végre. Kezdetben eltávolítottuk azokat a szekvenciákat, amelyekről Canis spp. és a sablon nélküli kontrollok olvasásszámán alapuló szennyeződések (amelyek elsősorban emberi szennyeződéseket tartalmaztak). Ezután eltávolítottuk azokat a mintareplikátumokat, amelyek nem tudtak amplifikálódni a PCR során, amelyek olyan mintareplikátumokat tartalmaztak, amelyek összesen kevesebb, mint 400 szekvenciaolvasást tartalmaznak. Összehasonlítottuk a taxonómiai feladatokat Délkelet-Alaszka ismert faunájával (MacDonald és Cook 2007), hogy a BLAST-szal azonosított nem régiós fajokat szorosan kapcsolódó regionális taxonokkal helyettesítsük. Ezután kizártuk azokat a zsákmányokat, amelyek 3 PCR-replikátum közül kevesebb mint 2-nél fordulnak elő. Végül egyesítettük azokat a mintareplikátumokat, amelyek amplifikálódtak, így a szekvenciaolvasások összesítésre kerültek a mintán belül az egyes fajok és a teljes minta között, és kiküszöböltük azokat a szekvenciákat, amelyek az egyedi minta összes olvasmányának kevesebb mint 1% -ában jelentek meg.

A pikkelyek kora

A feldolgozás előtt jelentős különbségeket figyeltünk meg a pikkelyek megjelenése és minősége között (2. ábra). T-teszteket végeztünk annak eldöntésére, hogy a szántóföldi gyűjtés során elért scat észlelt kora korrelál-e a mintában lévő átlagos DNS-mennyiséggel (ng/ul) (a normalizálást követően az Accublue nagy érzékenységű dsDNS kvantitációs készlet segítségével mértük (Biotium, Fremont, CA)), a mintában leolvasott szekvenciák teljes száma, beleértve a farkas defekátort, vagy a leolvasott szekvenciák teljes száma a farkas kivételével.

Az előfordulás gyakorisága

A zsákmány előfordulását a farkas étrendben egyaránt alkalmaztuk az előfordulás gyakoriságával (FOO) és a relatív bőség metrikáival (lásd alább). A FOO-t a minták száma alapján határozták meg, hogy mely zsákmányfajok és milyen gyakorisággal voltak jelen. A mechanikus osztályozási módszereknél egy faj akkor volt jelen, ha bizonyíték volt (beleértve a nyomelemeket is) egy zsákmányfajról (pl. Haj, csont, pikkelyek stb.) A pikkelysmintában. Ezután a FOO-t a zsákmányok azon hányadaként számolták ki, amelyben egy zsákmányfaj előfordult. A metabarkódoláshoz a faj előfordulását az alapján határozták meg, hogy a minőség-ellenőrzési intézkedések után egy adott fajban találtak-e egy adott fajra vonatkozó szekvenciaolvasást. Összehasonlítottuk a FOO-t a mechanikus szortírozásból és a metabarkódolásból, a mindkét módszerrel elemzett scats részhalmazát felhasználva (n = 104), de bemutatjuk továbbá a Wales-szigeti hercegeken és a környező környező szigeteken összegyűjtött összes scatter diétanalízisét (n = 118 metabarcoding; n = 98 mechanikus válogatás) az étrend leírására a POW-n.

Viszonylagos bőség

Annak tesztelésére, hogy a metabarkódolás és a mechanikus szortírozás hasonló metrikákat eredményez-e egy zsákmányfaj viszonylagos bőségére vonatkozóan, összehasonlítottuk a mechanikus rendezésből származó becsült mennyiség százalékos arányát a metabarkodálás relatív olvasási bőségével (RRA) Az egyes i fajok RRA-ját úgy számítottuk ki, hogy ni, k az i zsákmányfajok szekvenciáinak száma a k mintában, S a minták összes száma, T pedig a fajok teljes száma. Összehasonlítottuk a zsákmányfajok becsült mennyiségét mechanikus rendezésből a metabarkodálás RRA-jával egyszerű lineáris regresszió alkalmazásával (R Core Team 2018).

Mind az előfordulási gyakoriság, mind a relatív bőség-elemzés során felülvizsgáltuk a metabarkódolás és a mechanikus szortírozás eltéréseivel járó scats eredményeit annak felmérésére, hogy a metabarkódolás számos alternatív faj szekvenciaolvasását találta-e, amelyet mechanikus rendezés helytelenül rendelt be, és így valószínűleg hamis pozitív volt.