A megnövekedett mitokondrium-függő nekrózis mechanizmusai a Wiskott-Aldrich-szindróma vérlemezkékben

Absztrakt

1. táblázat: Wiskott-Aldrich-szindrómás betegek jellemzői.

Vérvétel és vérlemezkék izolálása

A vizsgálatokat a Helsinki Nyilatkozatnak megfelelően, a Gyermekek Hematológiai Etikai Bizottságának jóváhagyásával hajtották végre, és minden betegtől (vagy szüleiktől) és donortól írásos tájékoztatáson alapuló beleegyezést kaptak. A megmosott vérlemezkéket lényegében a korábban leírt módon készítettük el

Konfokális mikroszkópos kísérletek: általános tervezés

Az üveg fedőlemezeket megtisztítottuk és 1 mg/ml fibrinogénnel vagy foszfáttal pufferolt sóoldatban lévő monaframmal vontuk be. A megmosott vérlemezkéket rögzítettük a fehérjével bevont felületre úgy, hogy 20 percig inkubáltuk őket 1,3x10/μl-nél (vagy a WAS-nál elérhető maximális koncentrációnál trombocitopénia esetén), majd 1,5 mM CaCl2-val A-pufferrel öblítettük. A PS frakciót további 30 percig tartó inkubálás után számláltuk.

Citoszolos kalcium jelátviteli és mitokondriális membránpotenciál változás

Ezeknek a vizsgálatoknak a módszertana lényegében máshol leírt volt.18 A ratiometriai mérések kalibrálását külön végeztük egészséges és WAS vérlemezkék esetében. A kalciumkoncentrációkat a ratiometrikus mutatók egyenletének felhasználásával számoltuk ki. 19 A mitokondriális potenciál dinamikájának kimutatására tetrametil-rodamin-metil-észtert (TMRM) használtunk.

A TRAP-6-ra adott vérlemezke-válasz jellemzése vérlemezkékben gazdag plazmában

A vérlemezkékben gazdag plazma mintáit vérlemezkében szegény plazmával hígítottuk 20 000/ml végkoncentrációra, és HEPES-sel pufferoltuk pH = 7,4 (100 μM végkoncentráció) mellett. Az irreverzibilis Phe-Pro-Arg-klór-metil-ketont (PPACK) adtuk a 100 μM végkoncentrációhoz annak érdekében, hogy blokkolják a spontán trombinképződést az újrakalcifikálás után. A vérlemezkéket kalcium-klorid hozzáadásával (végkoncentráció 20 mM, amely 2 mM szabad kalcium20-nak felel meg) újraszámoltuk, és 25 μM TRAP-6-tal (trombinreceptor-agonista peptid-6) aktiváltuk 5 percig szobahőmérsékleten.

ATP mérés vérlemezkékben

Röviden összefoglalva, a minták vérlemezkeit liizáltuk (90 μl dimetil-szulfoxid hozzáadásával 10 μl vérlemezke-szuszpenzióhoz) és luciferáz-luciferin vizsgálattal elemeztük a korábban leírt módon2221, míg a másik részt CD61-FITC-vel és annexin V-Alexa Fluor 647-gyel festettük. áramlási citometriával elemezzük.

A vérlemezke funkcionális aktivitásának áramlási citometriás jellemzése

A kísérleteket lényegében az előzőekben leírtak szerint2423 végeztük, kisebb módosításokkal.

Transzmissziós elektronmikroszkópia

A protokoll lényegében máshol leírt volt.25

Statisztika

Az adatokat átlag ± szórásként adjuk meg. A csoportok közötti különbségek statisztikai szignifikanciáját párosított minták nemparametrikus Mann – Whitney U-tesztjével (P) vagy Wilcoxon jelölt rangú tesztjével (P *) határoztuk meg. A különbségeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük, amikor a P-érték volt

1. ábra: Foszfatidil-szerin expozíció Wiskott-Aldrich-szindróma vérlemezkékkel fibrinogénkötéskor. (A) Egészséges (bal oldali) és Wiskott-Aldrich szindróma (WAS) (jobb oldali) vérlemezkék konfokális mikroszkópos képei, miután 30 percig terjedtek egy fibrinogén felületen 1,5 μM Ca2 + jelenlétében. A vérlemezkéket CD61-vel (zöld) és Annexin V-vel (piros) jelölik; skála: 10 μm. (B) A WAS-betegek (27 beteg,> 7500 sejt), egészséges, egészséges (18 donor,> 6500 sejt) és 0-7 éves, WAS nélküli gyermekek (6 gyermek) foszfatidil-szerin-pozitív (PS +) vérlemezkefrakciója, életkor: 0, 0, 2, 3, 4, 7 év, 2300 vérlemezke) fibrinogén felületen. (C) W + vérlemezkék PS + frakciója a fibrinogén felületén, a romiplostimmal kezelt és kezeletlen WAS betegek összehasonlítását mutatva, P = 0,94. (D) A Monafram bevonatú fedőlemezek nem változtatták meg a PS + frakciót, P = 0,86, n = 4, 2500 vérlemezke. w/o: nélkül; FG: fibrinogén.

A Wiskott-Aldrich-szindróma vérlemezkék funkcionális aktivitása

2. ábra A Wiskott-Aldrich-szindróma és az egészséges vérlemezkék funkcionális válasza. (A-G) A teljes vérlemezkéket stimuláljuk (A-val jelöljük) vagy nem (jelöljük N/A-val) trombinreceptor-agonista-peptid-6 plusz kollagénnel rokon peptiddel, és áramlási citometriával elemezzük. Az egészséges gyermekek (n = 21, 0-13 éves kor, medián 5,0) és Wiskott-Aldrich-betegek (17 romiplosztimmal kezelt, 11 nem kezelt) betegek paraméterei a következők: a vérlemezke nagysága, a fluoreszcencia átlagos intenzitásával mért előrefelé történő szórás alapján (MPI) (A); CD42b szint, MPI (B); CD61 szint, MFI (C); PAC1-pozitív vérlemezkék,% (D); CD62p-pozitív vérlemezkék,% (E); sűrű granulátum felszabadulás a mepakrin szint alapján, MFI (F); és foszfatidil-szerin-pozitív vérlemezke-frakció,% (G). P: Mann – Whitney U-teszt, P *: Wilcoxon aláírt rangú teszt. FSC: előre szórás, WAS: Wiskott-Aldrich szindróma; PS +: foszfatidil-szerin-pozitív.

Jelző események egyetlen fibrinogénhez kötődő Wiskott-Aldrich szindróma vérlemezkékben

A WAS vérlemezkék PS externáliájának mechanizmusainak azonosításához egyszerre vizsgáltuk a kalcium dinamikáját a citoszolban, a mitokondriális membránpotenciált és a PS expozíciót a WAS és a kontroll vérlemezkékben (3. ábra). Az átlagos intracelluláris citoszolos kalciumszint a WAS vérlemezkékben négyszer nagyobb volt, mint az elején a kontroll vérlemezkékben, és az átlagos különbség idővel nőtt (3A. Ábra). Míg az egészséges, nem stimulált vérlemezkék, a korábbi jelentésekkel összhangban, a 3218-nak csak alkalmi kalcium-csúcsai voltak, amikor fibrinogénhez kötődtek (3B. Ábra), a WAS-betegek stimulálatlan vérlemezkeinek gyakori oszcillációi voltak hosszabb tüske-időtartammal (3C. Ábra, D). A WAS vérlemezkék mitokondriumai egymás után elvesztették membránpotenciáljukat, és ha mindegyikük TMRM-negatívvá vált, a sejt 10 másodpercen belül elkezdett kötődni az annekvin V-hez (3D ábra), pontosan úgy, ahogyan arról korábban beszámoltunk a egészséges donorok TRAP-6-tal vagy trombinnal.2718 Ez összhangban áll a prokoaguláns vérlemezkék képződésének mitokondriális kalcium-túlterhelés okozta nekrózisának forgatókönyvével.

3. ábra A citoplazmatikus kalcium, a mitokondriális potenciálok és az egyes vérlemezkék foszfatidil-szerin expozíciójának dinamikája. A diagramok az intracelluláris kalciumkoncentráció dinamikáját és az egyes vérlemezkékhez kötődő V-kötődést mutatják be fibrinogénnel végzett inkubálás során 1,5 mM extracelluláris kalcium jelenlétében. (A) Átlagolt kalciumdinamika (± szórás) az aktiválatlan (N/A) vérlemezkéknél Wiskott-Aldrich-szindrómában (WAS) szenvedő betegeknél (4 beteg, 34 vérlemezke) és egészséges donorok vérlemezkeinél (HD), amelyek 10 μM TRAP-tal aktiválva (3 HD, 30 vérlemezke) vagy nem aktiválva (3 HD, 26 vérlemezke). (B) Dinamika egyetlen egészséges foszfatidil-szerin-negatív (PS -) vérlemezkén; (C) ugyanaz a WAS PS - thrombocyta esetében; (D) ugyanaz a WAS PS + vérlemezke esetén. A TMRM jel a TMRM-pozitív mitokondriumok számaként jelenik meg a vérlemezkében (B-D). A mitokondrium által kiváltott PS-expozícióhoz vezető intracelluláris események a citoplazmatikus kalcium-növekedés és a PS-expozíció következtében összeomlanak. Mindhárom folyamat szinte egyidejű volt, másodpercek évtizedeiig tartott. A WAS (E) és a normál (nem látható) PS + vérlemezkék is elvesztették mitokondriális potenciáljukat. Méretarány: 1 μm az összes mikroszkopikus képhez. TRAP: trombinreceptor agonista peptid; TMRM: tetrametil-rodamin-metil-észter.

Fontos, hogy az időintervallum-képalkotás feltárta, hogy a mitokondriális összeomlás a kevés mitokondriumot tartalmazó WAS-vérlemezkékben viszont a citoszol-kalcium gyors növekedéséhez vezetett (Online kiegészítő S3A ábra, 116 s időpont). Ha megfordult, akkor a kalciumkoncentráció is csökkent (Online kiegészítő S3A ábra, időpont 146 s). Ez drasztikusan különbözik az egészséges donorok aktivált vérlemezkeitől, amelyekben a kalcium nem volt annyira érzékeny egyetlen mitokondrium összeomlására.18 Érdekes módon a nagyszámú mitokondriumot tartalmazó WAS-vérlemezkéknél megnőtt a citoszol-kalcium és gyakori oszcillációk, de nem voltak érzékenyek az egyes mitokondriumok összeomlása (Online S3B. ábra).

A foszfatidil-szerin expozíciót a Wiskott-Aldrich-szindróma vérlemezkéken a mitokondriális permeabilitás átmeneti pórusnyílása közvetíti

A mitokondriálisan vezérelt nekrózis kritikus eleme a mitokondriális permeabilitás átmeneti pórusnyílása. Ennek ellenőrzésére fibrinogénnel végzett vérlemezke-inkubáció (ciklosporin A, necrostatin-1, Z-VAD-FMK) vagy terjedés (kalpeptin) során számos, a sejthalált szabályozó jelátviteli út számos inhibitorát adtuk hozzá. A mitokondriális permeabilitás átmeneti pórusgátló ciklosporin A (5 μM) jelentősen csökkentette a fibrinogénen a WAS vérlemezkék által képződött PS frakciót (4A. Ábra). Más inhibitorok, köztük a nekroptozin-gátló nekrosztatin-1, a kalpain inhibitor kalpeptin és a pan-kaszpáz inhibitor Z-VAD-FMK, nem gyakoroltak szignifikáns hatást a PS expozícióra (4B. Ábra). Ezek az adatok határozottan arra utalnak, hogy a mitokondriális permeabilitás átmeneti pórusnyílásának nekrotikus mechanizmusa a felelős a megnövekedett PS-expozícióért a WAS vérlemezkékben.

A kalcium homeosztázis, a sejtek energetikája és a reaktív oxigénfajok szerepe a foszfatidil-szerin expozícióban Wiskott-Aldrich-szindróma vérlemezkékkel

Annak érdekében, hogy további betekintést nyerhessünk a felülethez kötődő WAS vérlemezkék nekrózisába, xesztospongin C-vel (inozitol-triszfoszfát receptor blokkoló) vagy thapsigarginnal (szarko-endoplazmatikus retikulum Ca ATPáz inhibitor), vagy A pufferben adagolás nélkül kezelték őket. kalcium-klorid (4C. ábra). A Xestospongin C gátolta a PS-expozíciót, ami az inozitol-triszfoszfát szignalizáció részvételére utal, míg a thapsigargin erősen fokozta a thrombocyta nekrózist. Ezzel szemben a hatás drasztikusan csökkent az extracelluláris kalcium hiányában.

A thrombocyta nekrózis közvetlenül korrelál a mitokondriumok számával

A rendszerbiológiai szimulációk feltárják a mitokondriális szám és a felület/térfogat arány kritikus szerepét a programozott sejtpusztulásban Wiskott-Aldrich-szindrómában

A mitokondrium-függő nekrózis mechanizmusainak boncolgatása céljából a WAS-ban kidolgoztuk a kalcium szignalizáció számítási rendszerbiológiai modelljét (6. ábra). Az összes kamrát és a fő kalcium-jelátviteli mechanizmust magában foglaló modellben megvizsgáltuk a vérlemezke-kalcium válasz függését a WAS-vérlemezkék két fő változójától, a mitokondriumok számától és a vérlemezke-mérettől.

6. ábra: Megnövekedett citoszol-kalcium a leépítés eredményeként: számítógépes rendszerek biológiai szimulációja a kalcium szignalizáció normál és Wiskott-Aldrich szindróma vérlemezkékben. A Wiskott-Aldrich-szindróma (WAS) vérlemezkéiről feltételeztük, hogy a jelátviteli fehérjék azonos tartalommal rendelkeznek, a kompartmentek megfelelő térfogatára méretezve. (A, B) Két (A) vagy négy (B) mitokondriumot tartalmazó normál vérlemezkék aktivációjának sztochasztikus szimulációja 10 nM trombinnal. Egy mitokondrium összeomlásával az átlagos citoszol-kalcium 1,5-szeresére nő (A) két mitokondrium esetén, vagy nem változik (B) négy mitokondrium esetén. (C-E) 1 nM trombinnal stimulált normál és WAS vérlemezkék sztochasztikus és determinisztikus szimulációi.

A modell kimutatta, hogy a mitokondriumok számának csökkenésével a vérlemezkéket érzékenyebbé kell tenni a mitokondriumok összeomlása iránt, és magasabb kalciumnövekedést kell eredményeznie, mivel a fennmaradó mitokondrium nem tudta elviselni az ATP termelési terhelést (6A, B ábra), ami jól egyezik a kísérleti megfigyelések. Szimuláltunk különböző méretű vérlemezkéket is; méretezésükkor a felületi és térfogatmolekulák aránya természetesen megváltozott (6. ábra), mivel a térfogat arányos a harmadik fok méretével, míg a felület arányos a második fokozat méretével. Stimuláció után a kisebb méretű virtuális vérlemezkék térfogata összehasonlítható aktív foszfolipáz C-vel volt (6C. Ábra), de több inozitol-triszfoszfát és végül sokkal több kalcium volt (6E. Ábra), mert több inozitol-triszfoszfát receptor volt térfogatonként (mivel ezekről feltételezték, hogy legyen arányos a felülettel). Ez ismét összhangban áll a fent bemutatott kísérleti adatokkal, amelyek a WAS-ban megnövekedett kalciumszintet mutattak még a mitokondriális permeabilitás átmeneti pórusnyitás előtt, valamint a jelenség xesztospongin C iránti érzékenységével.

A modell tehát azt jósolta, hogy a kezeletlen WAS-betegek vérlemezkéinek mérete negatívan befolyásolja a vérlemezkék PS spontán expozíciójának képességét, és (ha ez a trombocitopénia hátterében álló mechanizmus) pozitívan befolyásolja a betegek vérlemezkeszámát. Érdekes, hogy a kezeletlen WAS-betegek között szignifikáns pozitív korreláció volt a vérlemezkék nagysága és a vérlemezkeszám között (Online kiegészítő S7A ábra). Bár nem figyeltünk meg szignifikáns összefüggéseket a PS-expozícióval, valószínűleg a korlátozott számú minta eredményeként (Online kiegészítő ábra S7B, C), érdekes, hogy a 18. számú (piros nyíllal jelölt) beteg normál méretű A vérlemezkék és az enyhe fenotípus szintén a legkevesebb PS-expozíciót tették immobilizáláskor, és mellesleg a legnagyobb volt a vérlemezkeszám.

Vita

A jelen tanulmányban vizsgált jelenségek jól egyeznek Shcherbina és mtsai. 1110 korábbi megfigyeléseivel, akik a WAS betegek vagy a WAS knockout egerek vérlemezkéinek megnövekedett, felgyorsult vagy spontán expozíciójáról számoltak be, amelyek nyugalmi állapotban megnövekedett kalciumszinttel jártak, és molekuláris alapot nyújtanak az előző jelentésekhez. Ennek a masszív PS expozíciónak a mechanizmusa a WAS vérlemezkékben lényegében hasonlónak tűnik az agonista által kiváltott prokoaguláns vérlemezkék képződésének meghatározásához a fiziológiás, erős vérlemezke aktivációban: 373634332618 a citoszol kalcium növekedése, majd mitokondriális kalcium túlterhelés és összeomlás, ami végül nekrotikus sejtpusztuláshoz vezet . A különbség az volt, hogy a WAS-ban a PS-expozíciót gyenge ingerek váltották ki, mint például a fibrinogén kötődése, amelyet bár aktiváló ingerként ismernek el, 38 önmagában elhanyagolható PS-expozíciót eredményezett az egészséges donor vérlemezkékben. Úgy tűnik, hogy a PS vérlemezkék magas százaléka a betegség univerzális jellemzője, függetlenül annak súlyosságától és hiányától \ egyéb WAS jellemzők jelenléte.

Ezeknek a jelenségeknek a hasonlósága (normál vérlemezkék PS-expozíciója trombin- és/vagy kollagénreceptorokon keresztül és PS-expozíció a fibrinogén kötődés által kiváltott WAS-vérlemezkék által) odáig terjed, hogy a TRAP-6 esetében itt figyelték meg a kevesebb mitokondriumot tartalmazó vérlemezkék domináns nekrózisának jelenségét - vagy trombinnal stimulált egészséges vérlemezke-aktiváció is. Ez önmagában érdekes, és a jelen tanulmány keretein kívül is lehetnek következményei: bár számos korábbi tanulmány megkísérelte azonosítani a vérlemezkék tulajdonságait, amelyek hajlamosítják őket a prokoaguláns képződésre, például az életkor vagy a nyugalmi kalciumkoncentráció, a hatások sokkal kisebbek voltak, mint a a mitokondriumok száma, és a terepen általában azt feltételezik, hogy nem világos, hogy mely vérlemezkék válnak nekrotikussá és melyek nem.