A megváltozott vese lipid anyagcsere szerepe a magas zsírtartalmú étrend által kiváltott vesekárosodás kialakulásában

Absztrakt

A metabolikus szindróma, amelyet az elhízás, diszlipidémia, hiperinsulinémia, hiperglikémia és magas vérnyomás egyidejű jelenléte jellemez, az elhízás fokozott előfordulása miatt egyre gyakoribb. Ez a szindróma egyre növekvő egészségügyi probléma a szív- és érrendszeri betegségek és az idő előtti halálozás kockázatának növekedése miatt. 1,2 Ezenkívül egy nemrégiben készült jelentés azt sugallta, hogy a metabolikus szindrómában szenvedő egyéneknek fokozott a kockázata a krónikus vesebetegségek kialakulásában. 3

A metabolikus szindrómában a vesekárosodás kialakulásának alapjául szolgáló számos patomechanizmust javasoltak. 4–8 Közülük a renalis lipid felhalmozódásról, a lipotoxicitásról számoltak be, hogy fontos szerepet játszik a metabolikus szindrómában bekövetkező vesekárosodás patogenezisében, bár a vese lipid felhalmozódásának pontos mechanizmusát nem sikerült teljesen tisztázni. 9–12 A túlzott energiafogyasztás, beleértve a magas zsírtartalmú étrendet is, hozzájárul a metabolikus szindróma kialakulásához. A HFD vese lipid felhalmozódást és vesekárosodást is okoz. 13 Ezért a HFD alatt a vese lipidfelhalmozódásáért felelős pontos mechanizmusok tisztázása felvetheti a metabolikus szindrómában bekövetkező vesekárosodás kialakulásának lehetséges mechanizmusait, és ezáltal javíthatja a vesekárosodás elleni új terápiás stratégiák kialakítását.

Különböző sejten belüli molekulák szabályozzák a helyi lipid anyagcserét több szövetben, például vázizomban és májban. 14–17 A megváltozott szisztémás glükóz- és lipidmetabolizmus alatt az ilyen szövetekben a lipogenezis és a lipolízis közötti egyensúlyhiány hozzájárul a helyi lipidfelhalmozódáshoz és az azt követő patofiziológiai változásokhoz. 16,18,19 A vesékben azonban a helyi lipid-anyagcsere szerepe a lipidfelhalmozódásban és az azt követő vesekárosodás metabolikus szindrómában még nem teljesen meghatározott.

A tanulmány célja a vese lipid-metabolizmus szerepének további tisztázása volt a metabolikus szindróma vesekárosodásának kialakulásában. Először megvizsgáltuk, hogy a HFD hogyan befolyásolhatja a vese lipid anyagcserét. Különösen a lipogenezis és a lipolízis egyensúlyára összpontosítottunk a vesében önmagában. Azt is megvizsgáltuk, hogy a HFD alatti kedvező szisztémás metabolikus körülmények miként befolyásolhatják a vese lipid anyagcserét és a vesekárosodást, heterozigóta peroxiszóma proliferátor-aktivált receptor-γ-hiányos (PPAR-γ +/−) egerek alkalmazásával, amelyekről korábban beszámoltak arról, hogy védettek HFD által kiváltott elhízás és inzulinrezisztencia.

EREDMÉNYEK

Szisztémás anyagcserezavarok

A kísérleti időszak 16 hetes négy csoportjának jellemzőit az 1. táblázat mutatja be. A HFD-n lévő PPAR-γ +/+ egerek szignifikánsan nehezebbek voltak, mint a zsírszegény étrenden (LFD) szenvedő PPAR-γ +/+ egerek. Ezek az elhízott egerek szignifikánsan magas plazma triglicerid-, koleszterin-, TNF-α- és monocita kemoattraktáns protein-1 (MCP-1) szintet mutattak, összehasonlítva LFD-s társaikkal. HFD-n a PPAR-γ +/+ egerek plazmaadiponektin szintje szignifikánsan alacsonyabb volt, mint LFD-n lévő PPAR-γ +/+ egereknél. Ezenkívül a HFD-n lévő PPAR-y +/+ egerek hiperinsulinémiát mutattak 4 hét HFD alatt (1A. Ábra) és hiperglikémiát mutattak 8 hét HFD alatt (1B ábra). Ezzel szemben a PPAR-γ +/− egerek szignifikánsan védettek voltak az elhízástól, az inzulinrezisztenciától és a megváltozott adipokin szekréciótól a 16 hetes HFD során, bár a PPAR-γ +/+ és a PPAR-γ között nem figyeltek meg különbségeket az étkezés során +/− egerek (1. táblázat, 1. ábra, A és B). A PPAR-γ +/+ egerek 16 hetes HFD-jén a glükóz intoleranciát (intraperitoneális glükóz tolerancia teszttel meghatározva) és az inzulin rezisztenciát (intraperitonealis inzulin tolerancia teszttel meghatározva) PPAR-γ +/+ egerekben gyengítettük (1. ábra, C és D). A PPAR-γ +/+ egerek a metabolikus szindróma jellemzőit mutatták a HFD korai stádiumától kezdve, míg ezek a változások HFD alatt inzulinérzékeny PPAR-γ +/− egerekben csillapodtak, amint arról korábban beszámoltunk. 20,21

(A) Plazma inzulinszintek 16 hét kísérleti periódus alatt az egerek minden csoportjában. Az adatok átlagok ± SEM minden csoportban 5–11 egér esetében. (B) A vércukor éheztetése 16 hét kísérleti periódus alatt az egerek minden csoportjában. Az adatok a csoportok 11 egérének átlagai ± SEM. (C) Glükóz tolerancia teszt a 16 hetes kísérleti periódusban az egerek minden csoportjában. Az adatok átlag ± SEM hét egér esetében minden csoportban. (D) Inzulin tolerancia teszt a 16 hét kísérleti periódusban az egerek minden csoportjában. Az adatok átlag ± SEM hét egér esetében minden csoportban. * P +/+ egerek LFD-n; † P +/− egerek HFD-n.

A négy egércsoport jellemzői a 16 hetes kísérleti időszak végén a

Vese sérülések

Megerősítettük a PPAR-γ expressziójának szignifikáns downregulációját a PPAR-γ +/− egerek veséiben mindkét étrenden, összehasonlítva a PPAR-γ +/+ egerekkel (2. táblázat). HFD alatt a PPAR-γ +/+ egerek szignifikánsan növelték a vizelet albumin kiválasztódását 16 hetes korban, bár a 4 és 8 hetes négy csoport között nem figyeltünk meg szignifikáns különbséget (2. ábra). A vizelettel történő albuminkiválasztás növekedése 16 hét után szignifikánsan gátolta a PPAR-γ +/− egereket HFD-n (2. ábra). A vese hisztopatológiai változásainak vizsgálata periodikus sav-Schiff (PAS) alkalmazásával négy csoportban azt mutatta, hogy a HFD mesangialis expanziót indukált a PPAR-γ +/+ egerekben (3. ábra, B és M). A fibronektin expressziója szignifikánsan megnőtt a PPAR-γ +/+ egerek glomerulusaiban és interstitiumjában egy HFD-n (3. ábra: F és N, valamint J és O). Ezzel szemben ezek a HFD által kiváltott glomeruláris és interstitialis elváltozások szignifikánsan gyengültek a PPAR-γ +/− egerekben (3. ábra: D és M, H és N, valamint L és O). Mind a PPARγ +/+, mind a PPARγ +/− egy LFD-n nem figyeltünk meg glomeruláris és interstitialis elváltozásokat (3. ábra: A, C, E, G, I és K). Továbbá HFD alatt a fibronektin, a IV típusú kollagén, a plazminogén aktivátor-1 és az MCP-1 mRNS expressziós szintje szignifikánsan megemelkedett a PPAR-γ +/+ egerek vesekéregében, és ezek a változások jelentősen gyengültek a PPAR-ban -γ +/− egerek (2. táblázat).

Huszonnégy órás vizeletalbumin kiválasztás a 16 hetes kísérleti periódus alatt az egerek minden csoportjában. Az adatok átlagok ± SEM minden csoportban 6–11 egér esetében. * P +/+ egerek LFD-n; † P +/− egerek HFD-n.

(A-tól D-ig) PAS-festett vese metszetek reprezentatív fotográfiái az egyes csoportok egereitől. (E-H) A fibronektinre immunfestett vese szakaszok glomerulusainak reprezentatív fotomikrográfiái. (I-től L-ig) A fibronektinre immunfestett vese metszetek interstitiumának reprezentatív fotomikrográfiái. (M) A mesangiális terület kvantitatív elemzése egérenként 20 glomerulusból. Az adatok a csoportok 11 egérének átlagai ± SEM. (N) A fibronektin pontszámának kvantitatív elemzése egérenként 20 glomerulusból. Az adatok a csoportok 11 egérének átlagai ± SEM. (O) A fibronektin pontszámának kvantitatív elemzése egérenként 20 véletlenszerű mezőből. Az adatok a csoportok 11 egérének átlagai ± SEM. * P +/+ egerek LFD-n; † P +/− egerek HFD-n. Nagyítások: × 400 A-tól H-ig; × 200 az I-től L-ig.

Az mRNS expresszió szintje a vesekéregben a 16 hetes kísérleti időszak végén a

Vese lipid felhalmozódása

A PPAR-γ +/+ egerekben megnövekedett vese trigliceridtartalmat figyeltek meg a HFD 8 és 16 hét múlva, bár 4 hét HFD-nél nem figyeltünk meg szignifikáns növekedést (4A. Ábra). Ezenkívül a HFD által kiváltott vesetriglicerid-tartalom növekedése 8 és 16 hét HFD mellett szignifikánsan csökkent a PPAR-γ +/− egereknél (4A. Ábra). A kísérleti időszak alatt nem figyeltek meg szignifikáns különbségeket a vesekoleszterin-tartalomban a négy csoport között (4B. Ábra). A négy csoport vese szakaszainak olaj-vörös O festése azt mutatta, hogy a HFD jelentős semleges lipid felhalmozódást okozott mind a glomeruláris, mind a tubulointerstitialis elváltozásban (5. ábra, B és F). Ezek a felhalmozódások jelentősen csökkentek a PPAR-γ +/− egerekben (5. ábra, D és H). Mind a PPARγ +/+, mind a PPARγ +/− egy LFD-n nem figyelték meg ezeket a vese semleges lipid felhalmozódásokat (5. ábra, A, C, E és G).

Triglicerid (A) és koleszterin (B) tartalom az egerek veséjében minden csoportban. Az adatok átlagok ± SEM minden csoportban 5–11 egér esetében. * P +/+ egerek LFD-n; † P +/− egerek HFD-n.

(A-tól H-ig) Olajvörös O-festett vese metszetek reprezentatív fotográfiái az egerek minden csoportjában. Nagyítás: × 200 A-tól D-ig; × 400 E-től H-ig.

Vese lipid anyagcsere

A szterint szabályozó elemhez kötődő protein-1c (SREBP-1c) egy transzkripciós faktor, amely szabályozza a lipogenezisben részt vevő enzimek, a zsírsavszintáz (FAS) és az acetil-CoA karboxiláz (ACC) transzkripciós aktivitását. 17,22 Mind a négy csoport veséjében 4 és 16 hét mértük az SREBP-1c, FAS és ACC mRNS expresszióját. Ezeknek a molekuláknak az mRNS expressziós szintje mindkét időpontban megemelkedett a PPAR-γ +/+ egerek veséjében HFD-n (2. és 3. táblázat). Ezeket a változásokat azonban nem figyelték meg a PPAR-γ +/− egereknél (2. és 3. táblázat). Továbbá HFD alatt az ACC fehérjetartalom a PPAR-γ +/+ egerek veséjében 16 hét múlva nőtt, a PPAR-γ +/− egereknél azonban nem (6. ábra, A és B ábra).

(A) A foszfo-AMPKa (Thr172), az AMPKa, a foszfo-ACC (Ser79) és az ACC reprezentatív immunblottjai az egerek vesekéregéből történő fehérjekivonatban az egyes csoportokban. A béta-aktint belső kontrollként töltöttük be. (B) Az ACC fehérje expressziójának kvantitatív elemzése. (C) A foszfo-AMPKa (Thr172) kvantitatív elemzése. (D) A foszfo-ACC (Ser79) kvantitatív elemzése. Az adatok átlagok ± SEM minden csoportban öt-nyolc egér esetében. * P +/+ egerek LFD-n; † P +/− egerek HFD-n.

Az mRNS expresszió szintje a vesekéregben 4 hét múlva

Ezután megmértük a lipolízisben részt vevő molekulák mRNS expressziós szintjét. Mind a 4, mind a 16 héten nem figyeltünk meg különbséget a PPAR-α, az acil-CoA-oxidáz ((ACO) és az acil-COA-dehidrogenáz (MCAD) mRNS expressziós szintjeiben a vesékben a négy csoport között (2. és 3). 4 és 16 hét HFD-nél azonban a karnitin-palmitoil-transzferáz-1 (CPT-1) mRNS-expressziójának szignifikáns csökkenését figyelték meg a PPAR-γ +/+ egerek veséjében, bár ez a PPAR- γ +/− egerek (2. és 3. táblázat).

Az 5 ′ AMP-aktivált protein-kináz (AMPK) foszforilálja és inaktiválja az ACC-t, ami a malonil-CoA intracelluláris szintjének csökkenését eredményezi, enyhítve ezáltal a CPT-1 aktivitás gátlását és felgyorsítva a lipolízist. 23 Az AMPKα (Thr172) (6. ábra, A és C ábra) és az ACC (Ser79) (6. ábra, A és D ábra) foszforilációja szignifikánsan csökkent a PPAR-γ +/+ egerek veséiben, HFD-nél 16 hetes korban. Ezzel szemben ezeket a HFD által kiváltott AMPKα (Thr172) (6. ábra, A és C ábra) és ACC (Ser79) (6. ábra, A és D ábra) foszforilációjának csökkenését a PPAR-γ +/− egereknél nem figyelték meg.

VITA

Itt megmutatjuk, hogy a HFD a vesében a lipogenezis és a lipolízis közötti önmagában bekövetkező egyensúlyhiány, valamint a szisztémás anyagcsere-rendellenességek, valamint az azt követő vese lipidfelhalmozódás és vesekárosodás miatt váltja ki a vese lipidanyagcseréjét. Ezenkívül ezek a veseelégtelenségek HFD alatt inzulinérzékeny PPAR-γ +/− egerekben enyhülnek.

Nemrégiben arról számoltak be, hogy a HFD vesekárosodást vált ki, bár a pontos mechanizmusokat nem sikerült teljesen tisztázni. 13,24 Számos jelentés szerint a vese lipidfelhalmozódása, lipotoxicitása összefügg az ilyen vese sérülések kialakulásával. Érdekes, hogy eredményeink azt mutatják, hogy a HFD szisztémás anyagcsere-rendellenességeket, például inzulinrezisztenciát indukál 4 hét HFD alatt és ezt követő vese lipidfelhalmozódást 8 hét HFD alatt, végül vesekárosodást 16 hét HFD-nél. Ezenkívül ezek a HFD által kiváltott vesebetegségek enyhülnek inzulinérzékeny PPAR-γ +/− egerekben. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a lipotoxicitás a vesében lehet az egyik fontos mechanizmus a metabolikus szindrómával járó vesekárosodás kialakulásában.

A vese lipidfelhalmozódásának pontos mechanizmusait a mai napig nem határozták meg teljesen. Egyre több bizonyíték van azonban arra, hogy a fokozott vese lipogenezis szerepet játszik a vesekárosodás patogenezisében. 11,13,25,26 Ezért megvizsgáltuk, hogy a HFD növeli-e a lipogenezisben szerepet játszó SREBP-1c, FAS és ACC vese mRNS expressziós szintjét. A korábbi jelentésekhez hasonlóan ezeknek a molekuláknak 11,13,25,26 mRNS-expressziós szintje megnőtt a PPAR-γ +/+ egerek veséiben 4 hét HFD alatt, míg az inzulinérzékeny PPAR veséiben ezeket nem figyelték meg. -γ +/− egerek. Ezért megmutathatjuk, hogy a vese lipogenezisének növekedése a HFD korai szakaszától kezdve, a semleges lipid felhalmozódás előtt figyelhető meg. Ezek a megfigyelések további bizonyítékokat szolgáltatnak arra vonatkozóan, hogy a felgyorsult vese lipogenezis hozzájárul a vese lipid felhalmozódásának kialakulásához inzulinrezisztencia alatt.

A vese lipogenezise mellett megvizsgáltuk a HFD hatását a vese lipolízisére, hogy meghatározzuk annak szerepét a vese lipid felhalmozódásának kialakulásában. Eredményeink azt mutatták, hogy a CPT-1, amely a lipolízis egyik kulcsfontosságú enzime, mRNS expressziós szintje szignifikánsan csökkent a HFD 4 hete alatt, de PPAR-γ +/− egereknél nem. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az inzulinrezisztencia alatt csökken a vese lipolízise, ami hozzájárulhat a vese lipidfelhalmozódásához. A PPAR-α a különböző szövetekben a lipolízist is szabályozza. 27 A négy csoport között azonban nem találtunk szignifikáns különbségeket a vese mRNS expressziójának PPAR-α szintjén. Továbbá nem figyeltük meg az ACO és MCAD vese mRNS expressziójának különbségeit, amelyek a PPAR-α transzkripciós célmolekulái. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a HFD nem befolyásolhatja a PPAR-α expresszióját vagy a PPAR-α aktivitását a metabolikus szindróma ezen egérmodelljében.

Több kutató arról számolt be, hogy a PPAR-y agonisták gyulladáscsökkentő és antifibrotikus hatásuk révén védekezhetnek a különféle vesekárosodások ellen. 30–32 Ezzel szemben eredményeink azt mutatták, hogy a PPAR-γ expresszió szisztémás csökkentése javíthatja a HFD által kiváltott vesekárosodást. Ezért azt javasoljuk, hogy mind a PPAR-y agonisták, mind a PPAR-y elégtelenség ligandumok hiányában megvédhetnek a vesekárosodástól, amely legalább részben a glükóz és a lipid anyagcsere rendellenességeivel jár, mind a szisztémás, mind a vese lipid anyagcsere csillapításán keresztül. Ezenkívül számos jelentés azt mutatja, hogy a PPAR-y más transzkripciós ko-represszor komplexeket toboroz ligandum hiányában, és hogy ezek a társ-represszorok képesek a PPAR-y által közvetített transzkripciós aktivitás csökkentésére. 33,34 Ez lehet egy másik mechanizmus, amelyen keresztül a ligandum PPAR-γ-hoz való kötődése és a ligandummentes PPAR-γ hiány elősegítheti a vese védelmét.

Itt mutatunk be bizonyítékot arra, hogy a HFD fokozza a vese lipogenezisét és a csökkent vese lipolízist, vese lipid felhalmozódást és vesekárosodást okoz, míg ezek az eltérések inzulinérzékeny PPAR-γ +/− egerekben csillapodnak. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a vese lipogenezise és a lipolízis közötti egyensúlyhiány javulása a vese lipidfelhalmozódásának csökkenését és az inzulinrezisztencia alatti vesekárosodás ezt követő gyengülését eredményezi. Ezért azt javasoljuk, hogy a vese lipid metabolizmusának gyengülése új terápiás stratégiaként szolgáljon a CKD kialakulásának megakadályozására metabolikus szindrómában.

RÖVID MÓDSZEREK

Állati modellek

PPAR-y +/− egereket állítottunk elő az előzőekben leírtak szerint. 21 A hathetes egereket dobozketrecekben helyezték el, 12 órás világos/12 órás sötét ciklusban tartották őket, és LFD-t (a kilokalória 10% -a zsírból) vagy HFD-t (a kilokalóriák 45% -a zsírból) tápláltak. a Research Diets-től (New Brunswick, NJ) 16 hétig. A 16 hét múlva a testtömeg, a BP és a vércukorszintet mértük. A tudatos egerek BP-jét állandó állapotban mértük programozható farok-mandzsetta vérnyomásmérővel (BP98-A; Softron, Tokió, Japán). Az egereket metabolikus egyensúlyi ketrecekbe helyeztük 24 órás vizeletgyűjtés céljából az albuminkoncentráció mérésére. Az egereket altattuk és perfúzióval végeztük, ahogy azt korábban leírtuk. 11 A jobb vese paraffinba ágyazódott PAS festés és immunhisztokémia céljából, vagy lefagyasztva olaj-vörös O festés céljából. Az összes RNS-t és fehérjét kivontuk a bal vese megmaradt vesekéregéből. A Shiga Orvostudományi Egyetem Állattudományi Kutatóközpontja minden kísérletet jóváhagyott.

Antitestek

Anti-foszfo-acetil CoA karboxilázt (Ser79) az Upstate Cell Signaling (Lake Placid, NY) cégtől kaptunk. Az antifoszfo-AMPKα (Thr172), az anti-AMPKα (23A3) és az anti-ACC a Cell Signaling Technology cégtől (Beverly, MA).

Vér- és vizeletelemzés

A koleszterint vagy a triglicerideket a koleszterin CII készlet vagy az L típusú TG H készlet segítségével (Wako Chemicals, Richmond, VA) mértük. A plazma inzulint ELISA (Exocell, Philadelphia, PA) alkalmazásával határoztuk meg. A plazma leptint, az MCP-1-et és a TNF-a-t immunvizsgálati készlettel (R&D Systems, Minneapolis, MN) vizsgáltuk. A plazma adiponektint egér-specifikus ELISA készlettel (Linco Research, St. Charles, MO) határoztuk meg. A vizelet albumin kiválasztását egér-specifikus szendvics ELISA rendszerrel (Albuwell; Exocell) mértük, és 24 órán belül kiválasztott teljes mennyiségként fejeztük ki.

Fehérje extrakció és Western blot elemzés

A vese kéregét jéghideg lízispufferben homogenizáltuk, amely 150 mmol/l NaCl-ot, 50 mmol/l Tris-HCl-t (pH 8,0), 0,1% SDS-t, 1% Nonidet P-40-t és proteázgátló koktélt tartalmaz (Boehringer Mannheim, Lewes, Egyesült Királyság). Ezeket a mintákat 10% -os SDS-PAGE-val választottuk el és polivinilidén-fluorid membránokra (Immobilon, Bedford, MA) vittük át. A membránokat a megfelelő antitestekkel inkubáltuk, mostuk és torma-peroxidázzal kapcsolt másodlagos antitestekkel inkubáltuk (Amersham, Buckinghamshire, Egyesült Királyság). A blotokat egy továbbfejlesztett kemilumineszcencia detektáló rendszer (Perkin Elmer Life Science, Boston, MA) segítségével vizualizáltuk.

RNS extrakció és kvantitatív valós idejű PCR

A teljes RNS-t izoláltuk a vesekéregből a TRIzol protokoll alapján (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). A cDNS-t reverz transzkripciós reagensek alkalmazásával szintetizáltuk (Takara, Otsu, Japán). Az iQSYBR Green Supermix-et (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) használtuk valós idejű PCR-re (ABI Prism TM 7500 Sequence Detection System; Perkin-Elmer Applied Biosystems). Ezen molekulák mRNS-expressziójának szintjét standard görbe módszerrel számszerűsítettük. A standard görbéket sorozatban hígított standard sablon felhasználásával készítettük. Ct értéket használtunk az mRNS expresszió szintjének kiszámításához a standard görbéből. Az analitikai adatokat belső kontrollként a β-aktin mRNS-expressziójának szintjével állítottuk be. Az alkalmazott primereket a 4. táblázat ismerteti.