Kombinált metabolom és transzkriptóm elemzés feltárja a teljes kiszáradási tolerancia kulcsfontosságú elemeit egy anhidrobiotikus rovarban

Keresse meg ezt a szerzőt a Google Tudósban
Keresse meg ezt a szerzőt a PubMed oldalon
Keresse meg ezt a szerzőt ezen a webhelyen
ORCID-rekord Oleg Gusev számára
Levelezés céljából: kikawada @ affrc.go.jpoleg.gusev @ riken.jp

Szerkesztette: David L. Denlinger, Ohio Állami Egyetem, Columbus, OH, és jóváhagyta: 2020. július 6. (áttekintésre beérkezett: 2020. február 27.)

Jelentőség

Az anhidrobiózis egy reverzibilis ametabolikus állapot, amely súlyos kiszáradásra reagálva jelentkezik. Az ismert legnagyobb anhidrobiotikus állat az afrikai Polypedilum vanderplanki chironomid lárvája. Itt megvizsgáltuk, hogyan változik a lárvák anyagcseréje a szárítási – rehidratációs ciklus során, és hogy az egyszerű biokémiai folyamatok hogyan határozzák meg a kironomid életképességét. A főbb megállapítások azt sugallják, hogy a trehalóz ismert anhidroprotektív szerepe mellett a rehidráció fő energiaforrásaként működik. A száraz állapotban felhalmozódott citrát és adenozin-monofoszfát lehetővé teszi az anyagcsere gyors helyreállítását a helyreállítási szakaszban. Végül az anyagcsere-hulladékokat stabil vagy nem toxikus vegyületekként tárolják, mint például allantoin, xanthurénsav vagy szemészeti sav, amelyek antioxidánsként is működhetnek.

Absztrakt

Anhidrobiózissal kapcsolatos transzkripciós aktivitás jelentős ismerete ellenére azonban keveset tudunk a kapcsolódó nemenzimás biokémiai folyamatokról és metabolikus zavarokról. A kiszáradás utolsó szakaszában és a rehidráció kezdeti szakaszában nem lehet enzimaktivitás (mivel a vízszint rendkívül alacsony), következésképpen a homeosztázist és a sejtek szerkezetét kis molekulákkal kell fenntartani. Noha a kritikus szakaszon kívül kétségtelenül szükséges a génszabályozás, az erősen dehidrált „alvó” organizmusban az egyszerű biokémiai és biofizikai folyamatoknak kell túlsúlyban lenniük.

Javasoljuk, hogy akár a száraz állapotra való felkészülés, akár a felépülés után a lárvák túlélését nagyrészt az ilyen nonenzimatikus kémiai reakciók határozzák meg. Ebben a tanulmányban a deszikkációs – rehidrációs folyamat hatását vizsgáltuk a P. vanderplanki lárvák metabolitjainak tartalmára és arányára. Főbb eredményeink arra utalnak, hogy 1) a trehalóz fő energiaforrásként működik, amely fenntartja a rehidratáló lárvák helyreállítását, 2) a felhalmozódott citrát és az adenozin-monofoszfát (AMP) elősegíti az energia-anyagcsere gyors helyreállítását a rehidratálás után, és 3) a mérgező hulladék felhalmozódását. a metabolitokat inert társaik vagy potenciálisan antioxidáns vegyületek előállításával lehet elkerülni.

Eredmények és vita

Általános észrevételek.

A P. vanderplanki lárvák metabolikus profilalkotása során 266 metabolit (124 metabolit kationos és 142 metabolit anionos módban) tárult fel a három vizsgált fiziológiai állapotban: hidratált (D0), kiszáradt (D48) és rehidrált (R3). A detektált metabolitok teljes listája elérhető az S1 adatkészletben, a megfelelő relatív csúcsterületekkel és abszolút mennyiségi meghatározással. Ezen három fő fiziológiai állapoton végzett ismételt elemzés mellett egyszeri lefutású elemzést is végeztek a P. vanderplanki lárvák kiszárítási és rehidratációs folyamata során, összehasonlítva a kongén generációs szárításra érzékeny P. nubifer faj letális kiszáradásával. (S2 adatkészlet). A Human Metabolome Database 4.0 (https://hmdb.ca/) hierarchikus osztályozás (SI függelék, S1. Ábra) szerint a fő replikált elemzés során azonosított metabolitok többsége a „szerves savak és származékok” és a „nukleozidok közé esett., nukleotidok és analógok ”kategóriák.

A fő komponens analízist (PCA) alkalmazták a metabolit tartalom változásának változékonyságának meghatározására a P. vanderplanki deszikkációs – rehidrációs ciklus során. A PCA nagy elterjedést mutatott a három fiziológiai állapot között, az egyes állapotok három ismétlődése között jó egyetértéssel (1A. Ábra). Összességében az első két fő komponens a teljes variabilitás 77% -át tette ki. A PC1 (43,9%) az anhidrobiotikus ciklusban (kiszáradás – rehidráció) magyarázza az intakt hidratált lárvák és a lárvák közötti metabolitok koncentrációdinamikájának általános irányát, míg a PC2 (33,1%) a száraz és a rehidratált szakasz közötti eltérést.

A PCA eredményei. (A) PCA-diagram. Az egyes fiziológiai állapotok három ismétlődését különböző színű pontok mutatják (lásd a billentyűt). A PC1 a változók 43,9% -át teszi ki, és megmagyarázza a metabolitok tartalmának változását az anhidrobiosis során; A PC2 a változók 33,1% -át teszi ki, és megmutatja a kiszáradt és a rehidratált lárvák metabolomái közötti különbséget. (B) Faktorterhelés. A metabolitokat pontokkal jelölik. A szaggatott vonalak olyan küszöbértékeket képviselnek (0,0 a PC1-hez, 0,05 és –0,05 a PC2-hez), amelyeket a metabolitcsoportok osztályozására használnak, az anhidrobiosis stádiumára való reagálóképességük (e metabolit tartalmának változási mintázata) alapján. A különböző expressziós mintázattal rendelkező metabolitcsoportok különböző színnel vannak jelölve (lásd a kulcsot), beleértve az ANOVA nem jelentős metabolitokat is. (C) A különböző reakciókészségű csoportok metabolit-tartalmának változásának átlagos mintázatát ábrázoló vonaldiagramok, faktorterheléssel kiválasztva. A hibasávok mutatják az SE középértékét; a hegedűk a metabolitok normalizált mennyiségének eloszlását tükrözik. Az alábbi táblázatok felsorolják a 10 legnagyobb terhelésű csoport metabolitjait.

A PCA-terhelések azt mutatták, hogy a magas pozitív PC1-értékű metabolitok szignifikáns növekedést mutatnak a koncentrációban az anhidrobiosis legalább egyik szakaszában (1B. Ábra). A PC2-terhelések különbségei lehetővé tették a metabolit-tartalom változásának három fő mintázatának azonosítását: 1) felhalmozódás kiszáradás során, 2) felhalmozódás rehidráció során és 3) felhalmozódás az anhidrobiosis mindkét szakaszában. E csoportok mindegyikéhez meghatároztuk a változás átlagos mintázatát (1C. Ábra). Az egyes csoportok 10 legnagyobb terhelésű metabolitjait is bemutatjuk; ezek valószínűleg fontosak a csoportok közötti megkülönböztetés szempontjából. Ezek közé tartozik a trehalóz-6-foszfát (T6P), amely egy ismert anhidroprotektív tulajdonságokkal rendelkező vegyület (azaz trehalóz) prekurzora; a glutation (GSH) útjának közbenső termékei (gamma-amino-vajsav, gamma-glutamil-cisztein és szemészeti sav); a triptofán lebomlási útjának neuroaktív köztitermékei (kinurenin [KYN] és kinurénsav [KA]); és AMP, amelyek felhalmozódása a P. vanderplanki lárvákra jellemző anhydrobiosis során.

A trehalóz szerepe az anhidrobiózisban: optimális energiaforrás az anyagcsere gyors folytatásához.

A P. vanderplanki lárvák metabolikus profilozása jelentős zavarokat tárt fel a különböző szénhidrát-intermedierek szintjében (2. ábra). A kiszáradt lárvák metabolomjában a trehalóz bioszintézis prekurzora, a T6P volt az egyetlen cukor, amelynek szintje emelkedett (47-szeresére a hidratált lárvákhoz képest). Amint fentebb említettük, a trehalóz számos anhidroprotektív tulajdonsággal rendelkezik (12 ⇓ –14), és ennek a diszacharidnak a felhalmozódását is meghatározták a P. vanderplanki lárvák kiszáradási toleranciájának alapvető meghatározójaként (11).

A trehaláz az az enzim, amely a trehalózt glükózzá alakítja. Meglepő módon a kiszáradás utolsó szakaszában a trehaláz messenger RNS (mRNS) szintje drasztikusan megnő, talán azért, hogy a trehaláz fehérje termelése a vízzel való újbóli expozíció után azonnal újraindulhasson, ezáltal lehetővé téve a gyors glükóztermelést. Ez kiegészül a száraz lárvákban inaktív formában már jelen lévő trehaláz fehérjével, amely aktiválódik rehidrálás után (15). Fontos hangsúlyozni, hogy a lárvák anhidrobiózissal történő előrehaladtával a transzkripciós és transzlációs mechanizmusok teljesen kiszáradnak, és ezért működésüket megszüntetik. Tehát feltételezzük, hogy a trehaláz gén expressziója, amely lehetővé teszi a megfelelő mRNS felhalmozódását a száraz lárvákban, egyedülálló adaptációs stratégia a trehalóz gyors posztrehidrációs katabolizmusának biztosítása érdekében, míg a pontos transzlációs vagy transzkripciós mechanizmusok, amelyekkel a nem kívánt trehaláz aktivitás blokkolódik a dehidratálás során a lárvákat még meg kell érteni.

A rehidratált lárvákban a G6P tartalma 48-szorosára nőtt a kiszáradt lárvákhoz képest (2A. Ábra és SI függelék, S2. Ábra). Ennek a jelenségnek oka lehet a trehaláz hatása. A G6P számos fontos szénhidrát-utat köt össze, beleértve a glikolízist, a pentóz-foszfát-utat (PPP) és más cukrok termelését. A PPP aktiválása részt vesz a citoprotekcióban, ahol korlátozza az oxidatív károsodást azáltal, hogy redukált NADPH-t biztosít. A reaktív oxigénfajok (ROS) termelésének növekedése gyorsan átkapcsolja a G6P fluxusát a PPP-re (18). A glükóznak a PPP-hez hasonló tolatása szintén csökkenti az oxidatív károsodást a nektárt tápláló hawkmothokban (19). Mivel a rehidráció megkezdődik a P. vanderplanki lárvákban, a TPS aktivitása csökken, lehetővé téve a G6P számára, hogy a glikolízis helyett a PPP-t táplálja, így a NADPH visszatér a kontrollszintre (2. ábra), ami valószínűleg növeli a rehidrált lárvák antioxidáns potenciálját.

A trehaláz szerepének szemléltetésére, valamint a trehalóz lebontásának és az antioxidatív potenciál PPP aktivációval történő fokozásának kapcsolatának ellenőrzésére rehidrációs kísérleteket végeztünk trehaláz inhibitorral, validoxilamin A-val (VAA) kezelt lárvákkal. Az álinjektált kontrollokhoz képest a VAA által injektált lárvák, amelyek dehidratáltak voltak, majd rehidrálás után 16 órával értékelték, károsodott gyógyulást mutattak, a lárvák közel 80% -a rehidratált, de mozdulatlan volt (3C. Ábra). Minden mozgás nélküli lárva a rehidratálástól számított 48 órán belül elpusztult. Ez az eredmény azt mutatja, hogy a trehalóz rehidrálás utáni aktív lebomlása szükséges a lárvák túléléséhez. Bár a VAA-kezelés korlátozta a trehalóz felhalmozódását a száraz lárvákban, valószínűleg a trehalózszintetizáló enzimek mellékhatásainak interferenciája miatt, a várt módon hatékonyan gátolta a rehidráció után a trehalóz lebomlását (SI függelék, S3. Ábra). Az összes antioxidáns potenciált kontroll és VAA-val kezelt lárvákban vizsgálták (SI függelék, S4. Ábra), de a VAA száraz lárvák trehalóz-felhalmozódására gyakorolt mellékhatása miatt nem sikerült egyértelműen megerősíteni vagy cáfolni a trehalóz lebontásának szerepét. oxidatív stressztoleranciában a lárvákban rehidrálás után.

Mivel a trehaláz VAA általi gátlása várhatóan blokkolja a fő szénhidrátforrás mobilizálódását a rehidratált lárvákban (3A. Ábra és SI függelék, S3. Ábra), a VAA-val kezelt lárvák rehidrálás utáni pusztulása nagyrészt a glikolízis károsodásával magyarázható. és ennek következtében az energiaellátás (3C. ábra). Ennek a hipotézisnek az igazolásához leállítottuk a trehaláz gén expresszióját RNS interferencia (RNAi) segítségével a P. vanderplanki szárítás-toleráns sejtvonalában, a Pv11-ben (SI függelék, S5. Ábra). Bár a trehaláz leütése nem befolyásolta a Pv11 sejtek életképességét közvetlenül a rehidratálás után (SI függelék, S6A ábra), a későbbi sejtnövekedést a kezelés jelentősen gátolta (SI függelék, S6B ábra). Mivel a Pv11 sejteket cukrokban gazdag táptalajban (szacharóz, maltóz, d-glükóz stb.) Növesztik, a glikolitikus úton történő csökkent fluxus nem magyarázhatja ezt a sejtnövekedési különbséget. Tehát egy másik, a trehalóz lebontásától függő metabolikus hatásnak kell felelnie a trehaláz RNSi-vel kezelt Pv11 sejtek sejtnövekedésének gátlásáért.

Összefoglalva, metabolomanalízissel, valamint in vivo és in vitro kísérletsorozattal bemutattuk a trehalóz egy még nem teljesen vizsgált szerepét, mint a lárvák túlélésének kritikus energiaforrását a rehidratálás során. A trehalóz felhalmozódása nemcsak a védő üveges mátrix kialakulásához szükséges száraz állapotban, hanem a rehidrálás utáni gyors lebomlása, amely elengedhetetlen a túléléshez, elősegíti a glikolízist és az energiatermelést, valamint a PPP aktiválódását, amely valószínűleg csillapítja a károsodás következtében bekövetkező károkat. oxidatív stresszhez.

Citromsav-ciklus és energia-anyagcsere: Adaptív gyors újraindítás a folyadékpótlás után.

A citromsav-ciklus (CAC) vagy a Krebs-ciklus az enzimreakciók ciklikus sorozata minden aerob organizmusban, amely energiát generál adenozin-trifoszfát (ATP) formájában (20, 21). A CAC első terméke a citromsav, amely számos anyagcsere út központi eleme, és szabályozza a sejtek energiaszintjét. Túlzott mennyiségben a citromsav gátolja a glikolízist, serkenti a glükoneogenezist és gátolja a CAC későbbi reakcióit (22).

A P. vanderplanki lárvák kiszáradása során (4. ábra) az összes CAC köztitermék jelentősen csökkent szintet mutatott, kivéve a citrátot és a cisz-akonitátot, amelyek tartalma egyaránt megduplázódott. A citromsav felhalmozódása az anhidrobiosis stádiumától függően kettős hatást gyakorolhat. A kiszáradás során vészfékként működhet a lárvák anyagcseréjének lassítására az „alvás” időszakában. A citrát felhalmozódása azonban hasznos lehet az aszály túlélése szempontjából is. Például a citromsav vízmentes (vízmentes) formában létezhet, kelátképző tulajdonságokkal, valamint különféle antioxidáns és antikoaguláns hatásokkal rendelkezik (23 ⇓ –25). A rehidratálás során a citokrat mitokondriális készletei valószínűleg lehetővé teszik a CAC-funkció és az energia-anyagcsere viszonylag gyors újraindítását anélkül, hogy a citoplazmában a glikolízis szénhidrátot adna.