Határok a mikrobiológiában

Vízi mikrobiológia

Szerkesztette
Ramiro Logares

Instituto de Ciencias del Mar, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), Spanyolország

Felülvizsgálta
Nico Jehmlich

Helmholtz Környezetkutató Központ (UFZ), Németország

Magnus Ø. Arntzen

Norvég Élettudományi Egyetem, Norvégia

A szerkesztő és a lektorok kapcsolatai a legfrissebbek a Loop kutatási profiljukban, és nem feltétlenül tükrözik a felülvizsgálat idején fennálló helyzetüket.

mikrobiális

  • Cikk letöltése
    • PDF letöltése
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Kiegészítő
      Anyag
  • Exportálás
    • EndNote
    • Referencia menedzser
    • Egyszerű TEXT fájl
    • BibTex
OSZD MEG

Eredeti kutatás CIKK

  • 1 Biológiai és Környezettudományi Osztály, Természettudományi Kar, Stirlingi Egyetem, Stirling, Egyesült Királyság
  • 2 Proteomikai és Mikrobiológiai Tanszék, Mons Egyetem, Mons, Belgium
  • 3 Biológiai Oceanográfia Tanszék, Leibniz Balti-tenger Kutató Intézet, Rostock, Németország
  • 4 Sorbonne Universités, UPMC Université Paris 06, USR 3579, LBBM, Observatoire Océanologique, Banyuls-sur-Mer, Franciaország

Bevezetés

A metaproteomika célja a mikrobiális közösségekből nyert összes fehérje jellemzése (Wilmes és Bond, 2004), és a metagenomikával együtt egy adott ökoszisztéma funkcionális komplexitásának feltárása (Franzosa et al., 2015). A Chesapeake-öbölben végzett első környezeti metaproteomikai vizsgálat óta (Kan és mtsai., 2005) számos vizsgálatot végeztek különféle környezetekben leíró, összehasonlító és/vagy kvantitatív megközelítések alkalmazásával (Matallana-Surget et al., 2018) . Az összehasonlító metaproteomikát gyakran alkalmazták a vízi ökoszisztémák térbeli és szezonális változásainak leírására (i) in situ (Morris és mtsai, 2010; Teeling és mtsai, 2012; Williams és mtsai, 2012; Georges és mtsai, 2014), (ii) mezokozmoszok (Lacerda és Reardon, 2009; Bryson és mtsai, 2016), vagy (iii) a mikrokozmoszok (Russo et al., 2016) megközelítései.

A tengeri ökoszisztémák metaproteomikája gyorsan bővülő terület, amely kihívást jelentő lépések és kritikus döntések sorozatát vonja maga után munkafolyamatába (Wilmes et al., 2015; Heyer et al., 2017; Matallana-Surget et al., 2018; Saito et al., 2019). A tengeri metaproteomikus munkafolyamat főként négy lépésből áll: (i) mintavétel és fehérje-extrakció, (ii) fehérje-szétválasztás, (iii) tömegspektrometria és (iv) fehérje-azonosítás/annotáció (Wöhlbrand et al., 2013). Eddig a szabványosított kísérleti protokollok még mindig hiányoznak, ami módszertani következetlenségekhez és adatértelmezési torzulásokhoz vezet a metaproteomikai vizsgálatok során (Leary et al., 2013; Tanca et al., 2013; Timmins-Schiffman et al., 2017).

A metaproteomikus adatok elemzése taxonómiai és funkcionális annotációt is magában foglal. A fehérje következtetési probléma miatt (vagyis ugyanaz a peptid található a homológ fehérjékben) a metaproteomikában gyakran találkoznak pontatlan fehérje annotációkkal (Herbst et al., 2016). Ennek a problémának a kiküszöbölése érdekében a fehérje-azonosító eszközök, például a Pro Group algoritmus (Absciex, 2014), a Prophane (Schneider et al., 2011) vagy a MetaProteomeAnalyzer (Muth és mtsai, 2015b) automatikusan csoportosítják a homológ fehérjeszekvenciákat. Vizsgálatunk során az mPies eszközt (Werner és mtsai, 2019) használtuk, amely szekvencia alapú összehangolást használ a taxonómiai konszenzus annotációjának kiszámításához a fehérje csoportokon az utolsó közös ős (LCA) használatával (Huson és mtsai, 2016; Heyer és mtsai. ., 2017). Az mPies új konszenzusú funkcionális annotációt is nyújt az UniProt segítségével, amely pontosabb betekintést nyújt a fehérjefunkciók sokféleségébe, összehasonlítva a korábbi stratégiákkal, amelyek tágabb funkcionális kategóriákra, például KEGG-re (Kanehisa et al., 2018) vagy COG-kre (Galperin et al., 2015).

A módszertan milyen mértékben befolyásolja a metaproteóm értelmezését már vizsgálták mesterséges mikrobiális közösségekben (Tanca et al., 2013) és a bél mikrobiomákban (Tanca et al., 2016; Rechenberger et al., 2019), de ennek hatása a tengeri mintákra még mindig továbbra is rosszul dokumentált (Timmins-Schiffman et al., 2017). Ebben a tanulmányban egy robusztus kísérleti tervet használtunk, összehasonlítva a fehérje keresés DB választásának és a fehérje frakcionálás megközelítésének együttes hatását ugyanazon a tengerfelszín mintán. Ebből a célból két gélalapú és gélmentes megközelítésből származó peptidspektrum-készletet kerestünk négy DB-vel szemben, amelyek ugyanazokból a nyers metagenomikus adatokból származnak. Az eredményül kapott nyolc metaproteómát kvantitatív és kvalitatív összehasonlítással demonstráltuk, hogy a metaproteomikus munkafolyamat diverzifikálása mennyiben teszi lehetővé a mikrobiális közösségek dinamikájának legátfogóbb megértését.

Anyagok és metódusok

Mintavétel

Tengervízminták (n = 4) nyáron (2014. június) gyűjtötték a SOLA állomáson, 500 méterre Banyuls-sur-Mer partjától, a Földközi-tenger északnyugati részén (ÉSZ 42 ° 49′, NY 3 ° 15′). Mindegyik minta 60 liter tengeri felszíni vízből állt, amelyet előzetesen 5 μm-nél szűrtünk, majd ezt követően egymást követően 0,8 és 0,2 μm pórusméretű szűrőkön (polieterszulfon membránszűrők, PES, 142 mm, Millipore) átszűrtük. Négy független szűrőkészletet kaptunk, és folyékony nitrogénné fagyasztva fagyasztva -80 ° C-on tároltuk őket.

Fehérje izolálás gélalapú és gélmentes megközelítésekhez

Gél alapú proteomikai megközelítés

Protein-izolátumok Laemmli-pufferben (2% SDS, 10% glicerin, 5% β-merkaptoetanol, 0,002% bróm-fenol-kék és 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8) hígítva és vízfürdőben hatszor 1 percig szobahőmérsékleten ultrahanggal kezelve. . 1 percig 90 ° C-on végzett inkubálás után a fehérjeoldatokat szobahőmérsékleten 15 percig 13 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk. A fehérje-keverékek SDS-PAGE-ját 4–20% előre elkészített poliakrilamid-minigélek (Pierce) alkalmazásával végeztük. A fehérjecsíkokat festéssel vizualizáltuk az Imperial Protein Stain (Thermo) segítségével a gyártó utasításainak megfelelően. A megfelelő fehérjéket tartalmazó gélsávot 17 darab 1 mm-es darabra vágtuk. Az enzimatikus emésztést 10 μl módosított szekvenálási minőségű tripszin (0,02 mg/ml) hozzáadásával 25 gM NH4HCO3-ban adtuk minden géldarabhoz. A mintákat 15 percig 4 ° C-on helyeztük, és egy éjszakán át inkubáltuk 37 ° C-on. A reakciót 1 μl 5% (v/v) hangyasavval állítottuk le. A triptikus peptideket folyadék-kromatográfiával tandem tömegspektrometriával elemeztük.

Folyadékkromatográfia tandem tömegspektrometriás elemzés

Adatbázisok létrehozása és fehérje azonosítása

A fehérje kereséseket a ProteinPilot alkalmazásával végeztük (ProteinPilot Software 5.0.1; Revision: 4895; Paragon Algorithm: 5.0.1.0.4874; AB SCIEX, Framingham, MA, Egyesült Államok) (Matrix Science, London, Egyesült Királyság; v. 2.2). A Paragon kereséseket 34 LC MS/MS Triple TOF 5600 rendszer műszerbeállításokkal végeztük. A kereséshez használt egyéb paraméterek a következők voltak: Mintatípus: Azonosítás, Cys-alkilezés: Jód-acetamid, Emésztés: Tripszin, ID-fókusz: Biológiai módosítások és aminosav-helyettesítések, Keresési erőfeszítések: Alapos azonosító, Detektált fehérje-küszöb [Unused ProtScore (Conf)] >: 0,05 (10,0%).

Három DB-t hoztak létre ugyanazon metagenóm felhasználásával (EMBL-EBI Projekt száma: ERP009703, Ocean Sampling Day 2014, minta: OSD14_2014_06_2m_NPL022, ID ID: ERR771073) (MiSeq Illumina Technology), és mPies v 0.9-vel állítottuk elő, a közelmúltban házunkban kifejlesztett mPies program ingyenesen elérhető a https://github.com/johanneswerner/mPies/ címen (Supplementary Presentation 1; Werner et al., 2019). A három DB: (i) nem összeállított metagenóm eredetű DB (NAM-DB), (ii) összeszerelt metagenómából származó DB (AM-DB) és (iii) rendszertanból származó DB (TAX-DB) ) (Asztal 1). Röviden: az mPies először nyírta le a szekvenálást a Trimmomatic-szal (Bolger et al., 2014). A NAM-DB esetében az mPies közvetlenül megjósolta a vágott szekvenálásból származó géneket a FragGeneScan segítségével (Rho et al., 2010). Az AM-DB esetében az mPies először összeállította a levágott szekvenálást a metaSPAdes (Nurk et al., 2017) felhasználásával folytonosokká olvassa, majd Prodigal segítségével géneknek nevezte (Hyatt et al., 2010). A TAX-DB számára az mPies pszeudo-metagenómát hozott létre a SingleM segítségével (Woodcroft, 2018), hogy megjósolja a működési taxonómiai egységeket a vágott szekvenciaolvasások alapján, és az összes taxonazonosítót genus szinten lekérje. Az egyes taxon-azonosítók összes rendelkezésre álló proteómját ezt követően letöltötték az UniProtKB/TrEMBL-ből. A duplikált fehérje szekvenciákat CD-HIT-vel (Fu et al., 2012) távolítottuk el minden egyes DB-ből.

Asztal 1. Kétfordulós keresési teljesítményt kapott az egyes módszertanokhoz.

A gélalapú és gélmentes MS/MS spektrumokat egyenként kétszer kerestük a DB-kkel szemben. Az első körös keresésben teljes méretű NAM-DB, AM-DB és TAX-DB-t használtunk (1. táblázat). A második körös keresésben minden egyes DB az első körös keresés során azonosított fehérjeszekvenciákra korlátozódott. Mind a gélmentes, mind a gél alapú megközelítéseknél a második kör NAM-DB, AM-DB és TAX-DB egyesítésével a redundáns fehérjeszekvenciákat eltávolítottuk, ami két kombinált DB-hez (Comb-DB) vezetett, majd utána kerestük a gélt alapú és gélmentes MS/MS spektrumok. Következésképpen négy DB-ből nyert N-DB, AM-DB, TAX-DB és Comb-DB összesen nyolc metaproteómát elemeztek ebben a cikkben. Az egyes fehérjekeresésekhez 1% FDR-küszöböt alkalmaztunk, fehérjeszinten számítva. Az egyetlen peptiddel azonosított fehérjéket az MS/MS spektrum manuális vizsgálatával validáltuk, biztosítva, hogy legalább öt egymást követő szekvencia-specifikus b- és y-típusú sorozat figyelhető meg.

Fehérje jelölés

Az azonosított fehérjéket annotáltuk mPies alkalmazásával. A taxonómiai és funkcionális annotációhoz az mPies Diamond (Buchfink és mtsai, 2015) segítségével minden egyes azonosított fehérjeszekvenciát összehangolt a nem redundáns NCBI DB-vel és az UniProt DB-vel (Swiss-Prot), és legfeljebb 20 legjobb találatot kapott. az igazítási pontszámról (> 80). A taxonómiai megjegyzéshez az mPies a legjobb találatok között az LCA-t adta vissza a MEGAN-on keresztül (bit score> 80) (Huson et al., 2016). A funkcionális annotációhoz az mPies adta vissza a leggyakoribb fehérje nevet, konszenzus tolerancia küszöbérték> 80% -os hasonlósággal a 20 legjobb blaszt találat között. A küszöbérték alatti pontszámmal ellátott fehérjéket manuálisan validálták. A kézi validálás egyszerű volt, mivel az alacsony annotációs pontszámhoz vezető fő okokat gyakran a fehérje izoformák vagy ugyanazon fehérje különböző alegységeinek jellemzésével magyarázták. Annak érdekében, hogy megkönnyítsük ennek az annotációs lépésnek a megértését, példákat adtunk a 2. kiegészítő bemutatóban. A feljegyzett fehérjefájlok az 1. kiegészítő adatlapon érhetők el.

Eredmények és vita

Az adatbázis megválasztása befolyásolja a fehérjeazonosítás teljes számát

A legújabb metaproteomikai vizsgálatokban általánosan alkalmazott kétfordulós keresési stratégia (Russo et al., 2016; Serrano-Villar et al., 2016; Deusch et al., 2017; Gallois et al., 2018) jelentősen csökkentette a fehérje keresés méretét A DB-k, amelyek viszont mind az AM-DB, mind a NAM-DB mellett azonosított fehérjék számát növelték (1. táblázat). Összességében megállapították, hogy az azonosított fehérjék teljes száma összhangban van a tengeri oligotróf vizekben végzett más metaproteomikai vizsgálatokkal (Morris et al., 2002; Sowell et al., 2009; Williams et al., 2012, 2013; Dong et al., 2014). A NAM-DB nagyobb fehérje-azonosításhoz vezetett (gél alapú: 714, gél mentes: 1131), mint az AM-DB (gél alapú: 277 és gél mentes: 549) és a TAX-DB (gél alapú: 434 és gél) -mentesen: 464) mindkét proteomikai megközelítéshez. A Comb-DB mindkét megközelítésben összehasonlítható eredményeket adott, mint a NAM-DB (gél alapú: 700 és gél mentes: 1048). Az AM-DB megközelítésben az összeállítási folyamat olyan olvasmányok eltávolítását vonta maga után, amelyeket nem lehet hosszabb kontigumokká összeilleszteni, ami génfragmentumok elvesztéséhez és ennek következtében kevesebb azonosított fehérjéhez vezet (Cantarel et al., 2011). Mivel a prokarióta genomok nagy hányada fehérjét kódoló, a génfragmensek közvetlenül megjósolhatók a nem összeállított szekvenálási eredményekből (Koonin, 2009). A TAX-DB az első körös keresés nagy mérete miatt a fehérje detektálási érzékenység csökkenésétől szenvedett, ami negatívan befolyásolta az FDR statisztikákat és a fehérje azonosítási hozamot (Jagtap et al., 2013).

A Protein Search DB befolyásolja a taxonómiai struktúrát

A fehérjék aránya, amelyekre vonatkozóan LCA-t találtak, a taxonómiai hierarchia (Domain> Phylum> Osztály> Rend> Family> Genus) csökkenésével csökkent, a módszertantól függetlenül (1. ábra). Az annotált fehérjék aránya a domén, a törzs és az osztály szintjén állandó maradt, átlagosan 97,3 ± 1,0, 92,0 ± 1,1, illetve 80,3 ± 0,8% átlaggal (1. ábra és 1. kiegészítő táblázat). Rendelési szinten és az alatt a TAX-DB teljesített a legjobban az LCA kijelölésében, mind gélmentes, mind gél alapú megközelítésben. Ezek az eredmények azzal magyarázhatók, hogy a fehérjéket szekvencia alapú összehangolási módszerrel annotálták (Werner et al., 2019). A TAX-DB az UniProtKB teljes fehérjeszekvenciáját tartalmazta, amely pontos annotációkat tett lehetővé. Ez az eredmény megerősítette, hogy a fehérje szinten végrehajtott LCA megközelítést a DB befolyásolja, amint azt korábban peptid szinten is bizonyították (May és mtsai, 2016).

1.ábra. Rendszertani és funkcionális fehérje annotáció. A fehérjék azon részének összehasonlítása, amelyekre vonatkozóan konszenzusos annotációt találtak. A sávok az annotált fehérjék százalékos arányát mutatják az összes azonosított fehérjéhez viszonyítva, módszertan függvényében.

Menekültügyi szinten az azonosított fehérjék nagy részét hozzárendelték Proteobaktériumok és a legkevésbé bőségeseket főként azokhoz rendelték Bacteroidetes és Cianobaktériumok (2. táblázat). Habár Proteobaktériumok hasonló arányt mutatott az összes metaproteómában (90,9 ± 0,97%), a reprezentativitás Bacteroidetes és Cianobaktériumok kiderült, hogy a különböző DB-k között változóbb. A hasonló eloszlás azzal magyarázható, hogy az ebben a vizsgálatban használt három DB ugyanazon metagenómából származott. Valóban, különálló adatforrások (metagenómák és különböző nyilvános adattárak) felhasználásával kontrasztos eloszlások várhatók, amint azt nemrégiben bebizonyították (Timmins-Schiffman et al., 2017). Tanulmányunkban, Alphaproteobacteriumok találták a legjobban képviselt osztályt (72,9 ± 1,9%), majd ezt követték Gammaproteobaktériumok (18,2 ± 2,0%), Flavobaktériumok (4,1 ± 0,5%), és osztályozatlan Cianobaktériumok (3,0 ± 0,7%) (2. táblázat). A dominancia Alfa- és Gammaproteobaktériumok gyakran beszámoltak más tengeri metaproteomikai vizsgálatokban (Morris és mtsai, 2010; Williams és mtsai, 2012; Georges és mtsai, 2014), mivel a legtöbb tengeri mintavételi helyen nagy volt a megoszlásuk. A tengerfelszín mintájára összpontosító egyéb tanulmányok is alátámasztották Cianobaktériumok (Sowell és mtsai, 2009) és Flavobaktériumok (Williams és mtsai, 2013).

2. táblázat. A menedékjog és az osztály szintjén kiosztott fehérjék megoszlásának összehasonlítása az egyes módszertanok esetében.

2. ábra. (A) Relatív taxonómiai összetétel rendelési szinten az egyes módszertanokhoz. Az értékek az azonos taxonómiájú fehérjék arányát mutatják az összes azonosított fehérjéhez TAX-DB, NAM-DB, AM-DB vagy Comb-DB alkalmazásával, mind gélmentes, mind gél alapú megközelítésben. Kvantitatív értékként az egyes fehérjékhez kimutatott peptidek számát használtuk. Az AM-DB arányú taxonok (gél alapú: 61%, gél mentes: 54%)> NAM-DB (gél alapú: 50%, gél mentesek: 54%) (1. ábra és 1. kiegészítő táblázat). A Comb-DB-k alkalmazásával a funkcionális annotáció 59, illetve 67% -át figyelték meg gélalapú és gélmentes megközelítésben. Az összehangoláson alapuló funkcionális annotáció (Werner és mtsai, 2019) nem biztos, hogy optimális, ha a fehérje architektúrája eltér. Ebben az esetben a tartomány előrejelzése az InterProScan (Jones és mtsai, 2014) segítségével kiegészítő megközelítést jelentene, amely megerősítené az igazításon alapuló funkcionális konszenzust.

Az összes metaproteómában a 60 kDa kaparonint találták a leggyakoribb fehérjének (3A. Ábra). A chaperonin fehérjék prevalenciáját korábban más tengeri metaproteomikai vizsgálatokban figyelték meg (Sowell és mtsai, 2009, 2011; Williams és mtsai, 2012). A 60 kDa méretű kaperonin egy esszenciális fehérje, amely részt vesz a fehérje sokféle hajtogatásában, és potenciálisan szignálmolekulaként működhet (Maguire et al., 2002). Sőt, ez a fehérje szinte az összes baktériumban megtalálható. Néhány taxon, mint pl Alphaproteobacteriumok vagy Cianobaktériumok, gyakran tartalmaz több 60 kDa kaperonin homológot (Lund, 2009). A 60 kDa-os chaperonin bősége és létfontosságú szerepe mellett a környezeti stressz-expozícióra adott válaszként is értelmezhető (Sowell és mtsai, 2009, 2011; Williams és mtsai, 2012).

3. ábra. (A) Relatív funkcionális összetétel az egyes módszertanokhoz. Az értékek az azonos funkcionális névvel rendelkező fehérjék arányát mutatják az összes azonosított fehérjéhez TAX-DB, NAM-DB, AM-DB vagy Comb-DB alkalmazásával, mind gélmentes, mind gél alapú megközelítésben. Kvantitatív értékként az egyes fehérjékhez kimutatott peptidek számát használtuk. A fehérje izoformákat és/vagy alegységeket ugyanazon funkció alá csoportosítottuk. Arányt megjelenítő függvények Kulcsszavak: metaproteomika, metagenomika, bioinformatika, tömegspektrometria, mikrobiális ökológia

Idézet: Géron A, Werner J, Wattiez R, Lebaron P és Matallana-Surget S (2019) A mikrobaközösségek működésének megfejtése: a metaproteomika kritikus lépéseinek megvilágítása. Elülső. Microbiol. 10: 2395. doi: 10.3389/fmicb.2019.02395

Beérkezett: 2019. július 15 .; Elfogadva: 2019. október 03 .;
Publikálva: 2019. október 24.

Ramiro Logares, a tudományos vizsgálatok legfelsőbb tanácsa, Spanyolország

Nico Jehmlich, Helmholtz Környezetkutató Központ (UFZ), Németország
Magnus Øverlie Arntzen, Norvég Élettudományi Egyetem, Norvégia