Az miR-130 elnyomja az adipogenezist azáltal, hogy gátolja a peroxiszóma proliferátorral aktivált receptor γ expresszióját

ABSZTRAKT

A zsírszövet fejlődését szorosan szabályozza a génexpresszió megváltoztatása. A mikroRNS-ek az emlősök differenciálódásának erős poszttranszkripciós szabályozói. Feltételeztük, hogy a mikroRNS-ek specifikus adipogén tényezők megcélzásával befolyásolhatják az emberi adipogenezist. Olyan mikroRNS-eket azonosítottunk, amelyek változó bőséget mutattak az emberi preadipociták adipocitákká történő differenciálódása során. Közülük a miR-130 erősen befolyásolta az adipocita differenciálódást, mivel a miR-130 túlzott expressziója károsította az adipogenezist és csökkentette a miR-130 fokozott adipogenezisét. A miR-130 hatásainak egyik legfontosabb effektora a fehérje peroxiszóma proliferátor által aktivált receptor γ (PPARγ) volt, amely az adipogenezis egyik fő szabályozója. Érdekes módon a miR-130 hatékonyan elnyomta a PPARγ expressziót, mind a PPARγ mRNS kódoló, mind a 3'-nem transzlált régiókat megcélozva. Az elhízott nők zsírszövetében lényegesen alacsonyabb volt a miR-130 és magasabb a PPARγ mRNS szint, mint a nem elhízott nőknél. Eredményeink azt mutatják, hogy a miR-130 csökkenti az adipogenezist azáltal, hogy elnyomja a PPARγ bioszintézist, és arra utalnak, hogy ebben a szabályozásban fellépő zavarok összefüggenek az emberi elhízással.

Az adipogenezist moduláló transzkripciós faktorok mellett egyre inkább felismerhető a poszttranszkripciós szabályozó tényezők, például az RNS-kötő fehérjék (RBP) és a mikroRNS-ek (miRNS-ek), amelyek modulálják az adipogén faktorokat kódoló mRNS-ek stabilitását és transzlációját. Például az adipogenezis kezdetén az RBP HuR szelektíven elősegíti a C/EBPβ-t kódoló cél-mRNS expresszióját (13); A C/EBPβ pedig hozzájárul más adipogén faktorok, például a PPARy és a C/EBPα expressziójának fokozásához (39, 40). Kimutatták, hogy az RBP CUGBP1 modulálja az adipogenezist a C/EBPβ mRNS megkötésével és a C/EBPβ májdúsított gátló fehérje (LIP) izoformájának transzlációjának fokozásával (17).

A mikroRNS-ek kicsi, nem kódoló RNS-ek, amelyek asszociálódnak az RNS-indukált csendesítő komplexummal (RISC), és részleges komplementaritással kötik meg a megcélzott mRNS-eket. A mikroRNS-ek általában elnyomják a cél mRNS expresszióját azáltal, hogy csökkentik annak stabilitását és/vagy transzlációját (3). A cél mRNS-ekre gyakorolt hatásuk révén a mikroRNS-ek számos fiziológiai és kóros folyamatban vesznek részt, mint például a szövetek fejlődésében, a sejtek szaporodásában, az apoptózisban, az energia-anyagcserében, az immunválaszban és a tumorgenezisben (2, 21, 32). Néhány mikroRNS-t azonosítottak differenciálisan expresszálódva az adipogenezis során, köztük számos mikroRNS-t, amelyek megváltoztatják a sejtproliferációt (pl. MiR-24, miR-31 és a miR-17-92 klaszter), elnyomják a Wnt jelátvitelt (miR-8) vagy célzott PPARγ expresszió (miR-27) (16, 18-20, 25, 33, 38).

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

RNS elemzés. A teljes RNS-t közvetlenül a sejtekből vagy szövetekből állítottuk elő Trizol (Invitrogen) vagy Qiagen oszlopokkal, a gyártók protokolljainak megfelelően. Véletlenszerű hexamereket és SSII reverz transzkriptázt (Invitrogen) használó RT után az átiratok rengetegségét RT-qPCR-rel vizsgáltuk SYBR green PCR master mix (Applied Biosystems) és génspecifikus primer készletek (alább) felhasználásával. Az RT-qPCR-eket Applied Biosystems 7300 és 7900 típusú készülékeken végeztük.

Az alkalmazott előre- és reverz primerek a következők voltak (szekvencia, 5 '→ 3'): adiponektin, GGCATGACCAGGAAACCAC és TTCACCGATGTCTCCCTTAGG; egér adiponektin, TGTTCCTCTTAATCCTGCCCA és CCAACCTGCACAAGTTCCCTT; leptin, GAACCCTGTGCGGATTCTTGT és TCCATCTTGGATAAGGTCAGGAT; GAPDH, TGCACCACCAACTGCTTAGC és GGCATGGACTGTGGTCATGAG; egér GAPDH, AGGTCGGTGTGAACGGATTTG és TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA; PPARy, GCTGTGCAGGAGATCACAGA és GGGCTCCATAAAGTCACCAA; egér PPARy, TCGCTGATGCACTGCCTATG és GAGAGGTCCACAGAGCTGATT; FABP4, AACCTTAGATGGGGGGTGTCCTG és TCGTGGAAGTGACGCCTTTC; LPL, CTGGACGGTAACAGGAATGTATGAG és CATCAGGAGAAAGACGACTCGG; adipszin, CAAGCAACAAAGTCCCGAGC és CCTGCGTTCAAGTCATCCTC; egér adipszin, CATGCTCGGCCCTACATGG és CACAGAGTCGTCATCCGTCAC; GLUT4, TCAACAATGTCCTGGCGGTG és TTCTGGATGATGTAGAGGTAGCGG; PPARy, ATCGCTCGAGGAAAGCCTTTTGG és CGCCGGATCCGAATAATGACAGC; PPARy-UTR, ATTCCTCGAGACTAGCAGAGAGTCCTG és GAGCGGATCCCATATTCTAAAACCTTT; egér aP2, GGGGCCAGGCTTCTATTCC és GGAGCTGGGTTAGGTATGGG.

mikroRNS qPCR tömb (miRNome elemzés) és mikroRNS detektálás. A mikroRNS qPCR tömb elemzését a hsa-miRNome mikroRNS profilkészlettel (System Biosciences) végeztük, hogy megvizsgáljuk a miRNS expresszióját két különböző donor preadipocitáiban és adipocitáiban. Két mikrogramm RNS-t fordítottunk át a QuantiMir RT kit (System Biosciences) segítségével, és a miRNS-profilozást qPCR-rel végeztük mikroRNS-specifikus primerek és SYBR green PCR master mix (Applied Biosystems) alkalmazásával. A mintákban az expresszió szintjét U6 expresszióra normalizáltuk. A hajtásváltozás jelzi az adipocitákból származó mikroRNS-ek expressziós szintjét a preadipocytákhoz viszonyítva.

Az egyes mikroRNS-eket tovább kvantifikáltuk TaqMan mikroRNS kimutatási vizsgálattal (Applied Biosystems) vagy a QuantiMir cDNS kit (System Biosciences) alkalmazásával. A TaqMan mikroRNS kimutatási vizsgálathoz a gyártó által szállított miRNS-specifikus primer készleteket használtunk RT-qPCR-ekben. A QuantiMir cDNS elemzéséhez a forward primereket úgy terveztük, hogy azok a miRNS-ek pontos szekvenciái legyenek a miRBase adatbázisban, és univerzális reverz primert használtunk a készletből.

EGFP riporterek, amelyek PPARγ mRNS szekvenciákat tartalmaznak. Az EGFP riportereket klónoztuk a PPARγ 3′-UTR és a CR specifikus fragmenseinek a pEGFP-C1 (BD Bioscience) 3′-UTR és CR részébe történő beépítésével, a korábban leírtak szerint (1). A miR-130 kötőhelyek magrégióit a PPARγ mRNS-en hely-irányított mutagenezissel mutattuk (Stratagene).

Western blot elemzés. A teljes sejt-lizátumokat radioimmunprecipitation assay (RIPA) puffer alkalmazásával állítottuk elő, SDS-tartalmú poliakrilamid-gélekben végzett elektroforézissel elválasztottuk és polivinilidén-difluorid (PVDF) membránokra (Millipore) vittük át. A PPARγ vagy GFP (Santa Cruz Biotech), vagy a glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH) vagy a β-aktin (Abcam) kimutatására szolgáló primer antitestekkel történő inkubálást inkubálás követte, megfelelő torma-peroxidázzal (HRP) konjugált megfelelő másodlagos antitestekkel és fokozott lumineszcencia alkalmazásával történő detektálás (GE Healthcare).

EREDMÉNYEK

Differenciálisan expresszált miRNS-ek az emberi adipogenezis során. (A) A miRNome-elemzés sematikus áramlása (lásd: Anyagok és módszerek), hogy összehasonlítsuk a mikroRNS-expressziós profilokat két egyedi alany preadipocytáiban és teljesen differenciált adipocitáiban. (B) A differenciált adipocitákban lebontott mikroRNS-ek (a mikroRNS-ek teljes listája beszerezhető a szerzőktől). A Boldface mikroRNS-eket tovább tanulmányoztuk. (C) a miR-130 expressziós szinteket 5 egyedi donor RT-qPCR analízisével vizsgáltuk miR-130-specifikus primer készletek alkalmazásával; *, P Humán adipogenezis modell. Annak megvizsgálására, hogy a miR-130a és miR-130b befolyásolja-e az emberi adipocita differenciálódást, megvizsgáltuk az adipogenezis folyamatát az egyes emberi donoroktól kapott preadipociták felhasználásával. A preadipocitákat (a sejtek előkészítésének> 90% -a, ahogy azt az anyagok és módszerek leírják) standard differenciálási protokollnak vetettük alá, amelynek eredményeként 10 napig érett adipocitákká differenciálódtak (2A ábra). E folyamat során fokozatosan lipidcseppeket halmoztak fel, amelyeket olajvörös O felhasználásával vizualizáltak (2B. Ábra), növekvő mennyiségű trigliceridet termeltek (2C. Ábra), és növekvő koncentrációban fejezték ki FABP4 és GLUT4 mRNS-eket, amelyek az érett adipociták két klasszikus markere ( 2D. Ábra).

Humán adipocita differenciálódási modell. (A) A preadipocita transzfekció és érett adipocitákba történő differenciálódás vázlata. A preadipocytákat az 1. napon differenciálódásra stimuláltuk, és a differenciálódást ∼ 10. napig befejeztük. (B) A lipidcseppek képződését fénymikroszkóppal és olajvörös O-val történő festéssel figyeltük meg. (C) A triglicerid (TG) koncentrációt az anyagok leírása szerint mértük. és módszerek. (D) A FABP4 és GLUT4 mRNS-ek mennyiségét a GAPDH mRNS szintjére normalizáltuk. A C és D panelen az adatok három egyedi donor átlagát + SD-t jelentik, mindegyiket három példányban vizsgálva.

Ebben a rendszerben mértük az időfüggő csökkenést a miR-130a és miR-130b szintekben (3A. Ábra). A humán adipogenezis során fokozott expressziót mutató mRNS-ek közül (3B. Ábra) a PPARy mRNS-t jósolták a miR-130a és miR-130b célpontjának. Az egér adipogenezisének jól bevált modelljében (3T3-L1 preadipocyták differenciálódva adipocitákká) hasonló csökkenést tapasztaltak a konzervált egér miR-130a és miR-130b és egyidejűleg növekedtek az adipocita-specifikus fehérjéket kódoló mRNS-ek (3C. Ábra és D). A humán és egér mRNS-ek és a miR-130 párhuzamos változásai az adipogenezis során tovább alátámasztják a humán adipogenezis modell alkalmasságát.

Humán és egér adipogenezis modellek összehasonlítása. (A és B) A miR-130a és miR-130b (A) szintjét, valamint a PPARγ mRNS-t és számos adipogén marker transzkriptumot (B) humán preadipocitákban mértünk, differenciálási protokollnak vetettük alá, amint azt a 3. ábra jelmagyarázata leírja. 2. (C és D) A miR-130a és miR-130b (C) szintjét, valamint a PPARy mRNS-t és számos adipogén marker transzkriptumot (D) mértük a 3T3-L1 egér preadipocyták differenciálása során. Az adatok három független kísérlet átlagát ± SD-t jelentik.

A miR-130 szintjének megváltoztatása modulálja az adipocita differenciálódást. Annak megállapítása érdekében, hogy a miR-130a és miR-130b szintjének csökkenése befolyásolja-e az adipocita differenciálódást, a miR-130a és miR-130b utánzókat külön-külön transzfektáltuk olyan preadipocitákba, amelyeket ezután a differenciálási protokollnak vetettek alá (2A. Ábra). Ez a beavatkozás a differenciálódás jelentős romlását eredményezte, amelyet morfológiai változások és olajvörös O-festés (4A. Ábra és az adatok nem mutatnak be) határoztak meg, és csökkent a TG-termelés (4B. Ábra). Ezzel szemben a miR-130a vagy miR-130b csökkenése az antiszensz (AS) oligonukleotidok transzfekciójával, amelyek komplementerek a miR-130a-val és miR-130b-vel ("antagomirok"), fokozta a differenciálódási fenotípust (4A. Ábra) és növelte a TG-tartalmat (4B. Ábra). . A transzfekciót követő miR-130 bőségét a 4C. Ábra mutatja. A transzfekció után 24 órával (1. nap) a miR-130a túlexpressziója ~ 150-szer nagyobb volt, a miR-130b-értéke pedig ~ 400-szorosa volt; az antagomirok transzfekcióját követően 24 órával a miR-130a szintje ~ 60% -kal, a miR-130b szintje pedig 50% -kal alacsonyabb volt (4C. ábra). Meg kell jegyezni, hogy az antagomirok képesek semlegesíteni a mikroRNS-eket anélkül, hogy aktívan csökkentenék egyensúlyi állapotukat, így a funkcionális miR-130 koncentrációja (AS) miR-130a/b transzfekció után valószínűleg alacsonyabb, mint az RT-qPCR-vel.

A miR-130 differenciális expressziója sovány és elhízott nőknél. (A) Táblázat, amely információkat szolgáltat azokról az egyes női donorokról, amelyekből hasi zsírt használtak az mRNS előállításához. A donorok vagy soványak voltak (BMI 25). (B) A PPARy mRNS (bal oldalon, GAPDH mRNS-re normalizált), miR-130a és miR-130b (jobbra, U6-ra normalizált) szintjét RT-qPCR analízissel mértük; A sovány és elhízott nőstények közötti különbségek jelentősek voltak (*, P 2010. augusztus 2.

2010. szeptember 1-jén visszaküldve módosításra.

Elfogadva 2010. november 18.

Elfogadott kézirat, amelyet 2010. december 6-án tettek közzé az interneten.