A nagy mobilitású Group 1 fehérje-semlegesítés csökkenti a diéta által kiváltott ateroszklerózis kialakulását az apolipoprotein E-hiányos egerekben

A BakerIDI Szív és Diabétesz Intézetből, Melbourne, Victoria, Ausztrália (P.K., A.A., T.S.K., C.K., I.A., K.P., A.B.); Farmakológiai és Patológiai Tanszék, Okayama University Graduate School of Medicine, Okayama University, Okayama, Japán (S.M., H.K.T., K.L., M.N.).

Ön a cikk legfrissebb verzióját nézi. Előző verziók:

Absztrakt

Célkitűzés-

A nagy mobilitású csoporthoz tartozó fehérje 1 (HMGB1) egy DNS-kötő fehérje és citokin, amely erősen expresszálódik atheroscleroticus elváltozásokban, de az atherosclerosisban fennálló patofiziológiai szerepe nem ismert. Megvizsgáltuk annak szerepét az érelmeszesedés kialakulásában ApoE -/- egerekben.

Módszerek és eredmények—

A magas zsírtartalmú étrenddel táplált Apolipoprotein E-hiányos (ApoE -/-) egereknek monoklonális anti-HMGB1 semlegesítő antitestet adtak, és az elváltozás méretére, az immunsejt-felhalmozódásra és az előgyulladásos mediátorokra gyakorolt hatásokat Oil Red O, immunohistochemistry, és valós idejű polimeráz láncreakció. Az emberi érelmeszesedéses elváltozásokhoz hasonlóan az ApoE -/- egerekben előforduló elváltozások HMGB1-et expresszáltak. A semlegesítő antitesttel végzett kezelés 55% -kal gyengítette az érelmeszesedést. A makrofágok felhalmozódása 43% -kal csökkent, az érrendszeri sejt-adhéziós molekula-1 és a monocita kemoattraktáns protein-1 expressziója 48, illetve 72% -kal gyengült. A CD11c + dendritikus sejtek 65% -kal, az érett (CD83 +) populáció 60% -kal csökkentek. A kezelés a CD4 + sejteket is közel 50% -kal csökkentette. A tumor nekrózis faktor-a-t és az interleukin-1β-t kódoló elváltozásokban az mRNS-ek általában csökkentek. Mechanikusan a HMGB1 stimulálta a makrofág migrációt in vitro és in vivo; in vivo jelentősen megnövelte az F4/80 + Gr-1 (Ly-6C) + makrofágok felhalmozódását, és emelte az F4/80 + CD11b + makrofágok számát is.

Következtetés-

A HMGB1 proaterogén hatásokat fejt ki az elváltozások fejlődésében azáltal, hogy stimulálja a makrofágok migrációját, modulálja a gyulladásos mediátorokat, és ösztönzi az immun- és simaizomsejtek felhalmozódását.

Szerkezetileg a HMGB1 háromoldalú tartományi szervezettel rendelkezik. 2 hasonló DNS-kötő domént tartalmaz, a HMG Box A és B boxot, valamint egy egyedülálló C-terminális domént, amely 30 aminosavból álló savas farokból áll, amelyek mindegyike rövid aminosavszekvenciákkal van összekapcsolva. A HMGB1 proinflammatorikus aktivitása lokalizálódott a B dobozba, és a B doboz ellen termelt antitestek megakadályozzák a HMGB1 akciókat 17,18; a fejlett glikációs végtermékek (RAGE) megkötő doménje receptor a B doboz C-terminális komponensében és a savas farokhoz kapcsolódó szegmensben helyezkedik el. 19 Ezzel szemben az A doboz gyengíti a proinflammatorikus citokinek HMGB1 által kiváltott felszabadulását. 20,21 Úgy gondolják, hogy a savas farok strukturálatlan, és mindkét dobozban kölcsönhatásba lép specifikus bázikus maradványokkal, esetleg szabályozva azok konformációját. 22.

A HMGB1 gyulladáscsökkentő hatásait számos receptor típusával való kölcsönhatásának tulajdonítják, amely a HMGB1-hez kötött tényezőktől függ. Úgy tűnik, hogy a RAGE, a toll-szerű receptor (TLR) 2 és a TLR4 közvetíti a proinflammatorikus hatásokat a HMGB1-stimulált makrofágokban. Úgy tűnik, hogy a DNS immunkomplexekben és a nukleoszómakomplexekben lévő 23,24 HMGB1 proinflammatorikus hatást fejt ki TLR9 és TLR2 útján. 12,25 Újabban kimutatták, hogy a HMGB1 kölcsönhatásba lép a CD24-gyel és a Siglec-10-gyel, hogy csillapítsa a szövetkárosodás által kiváltott immunválaszokat 26; ezek és a HMGB1 káros hatásai közötti egyensúlyt javasolták káros hatásainak teljes mértékének meghatározásához. 26.

A HMGB1 számos immunvezérelt betegségben szerepet játszik, beleértve a szisztémás lupus erythematosust, az autoimmun cukorbetegséget és az ízületi gyulladást. 9,27,28 Ízületi gyulladásban a makrofágok aktiválásával és az IL-1 kiváltásával gyulladást vált ki. 28 Mivel a HMGB1 3–5 érelmeszesedéses elváltozásokban túlexpresszálódik, és aktiválja az érelmeszesedést fokozó immunfolyamatokat, 4,11,13–15 megvizsgáltuk annak szerepét az ateroszklerózis kialakulásában apolipoprotein E-hiányos egerekben (ApoE -/- egerek). Anti-HMGB1 semlegesítő monoklonális antitestet használtunk, amely specifikusan kölcsönhatásba lép a savas farokban lévő HMGB1 C-terminális szekvenciájával, hogy meghatározzuk szerepét az érelmeszesedésben. Ez az antitest a HMGB1-gyel reagál, és nem a HMGB2-vel, és kimutatták, hogy gátolja a HMGB1 válaszokat a makrofágokban, és enyhíti a tranziens ischaemia által kiváltott agyi infarktust. 29.

Anyagok és metódusok

A hathetes ApoE -/- egereknek 8 héten keresztül magas zsírtartalmú étrendet adtak, és vagy anti-HMGB1 monoklonális antitestet, vagy IgG2a kontrollt adtak nekik (400 μg IV hetente kétszer). A vizsgálat végén az egereket pentobarbiton túladagolásával leöltük, és szövettani és molekuláris vizsgálatokhoz vért, aorta sinust és ívet, lépet és nyirokcsomókat gyűjtöttünk össze. A monocita proliferációt in vivo értékeltük bróm-oxi-uridin (1 mg IP) beadása után 3 napig, mielőtt az egereket leöltük. A HMGB1 monociták kemotaktikus hatásait egerekben értékeltük 5 órával a HMGB1 (20 μg) peritonealis üregbe történő beadása után.

A Kiegészítő módszerek részletes szakasz online elérhető .

Eredmények

HMGB1 expresszió ateroszklerotikus elváltozásokban

A HMGB1 nagymértékben expresszálódik az emberi érelmeszesedéses elváltozásokban, főleg olyan makrofágok által, amelyekben a sejtek közel 50% -a HMGB1-et tartalmazott citoplazmájában. 3 Ezért megvizsgáltuk, hogy az ApoE -/- egerek ateroszklerotikus elváltozásai expresszálják-e a HMGB1-et is. A HMGB1 az ApoE -/- egerek aorta sinusában expresszálódott, és az ateroszklerotikus intima sejtjeire korlátozódott (1. ábra). Úgy tűnik, hogy a HMGB1 sejtekkel társult, gyakran a citoplazmán belül, és diffúzan eloszlott a léziókban is; utóbbi valószínűleg a szekretált HMGB1-t tükrözi (1. ábra).

1.ábra. A HMGB1 expresszió immunohisztokémiai azonosítása aorta sinus ateroszklerotikus elváltozásokban ApoE -/- egerekben. Balra a HMGB1 (vörös festés) az intim sejtekben lokalizálódott (felső betét), és diffúzan eloszlott az elváltozásokon belül is (alsó betét). A médián belüli sejtek nem expresszálták a HMGB1-et. Jobb, az A-hez hasonló régió az inkubált nem specifikus nyúl IgG-vel az elsődleges nyúl HMGB1 IgG helyett. A metszetet hematoxilinnel ellenfestettük. A méretarány 100 μm-t jelent.

A HMGB1 semlegesítés hatása az ateroszklerotikus elváltozás méretére

14 hetes korban (8 hetes antitest kezelés) az összes plazma koleszterin, alacsony sűrűségű lipoprotein koleszterin, nagy sűrűségű lipoprotein koleszterin és triglicerid szint nem különbözött a kontroll vagy anti-HMGB1 semlegesítő antitesttel kezelt egerek között (I. kiegészítő táblázat) . Az Oil Red O-festett aorta sinus metszetek elemzése azonban szignifikáns különbségeket tárt fel a lipidlerakódásban és az érelmeszesedéses plakkok méretében (2. ábra). A morfometrikus elemzés azt mutatta, hogy az anti-HMGB1 semlegesítő antitest csökkentette az elváltozás nagyságát a kontroll antitesttel végzett kezeléshez képest, 89 253 ± 13 098 μm 2 szemben 183 903 ± 11 784 μm (P 2 anti-HMGB1 semlegesítő antitesttel kezelt egerekben, összehasonlítva 141 364 ± 12 608 μm 2 kontroll antitesttel (2. ábra). Annak eldöntésére, hogy a HMGB1 antitest hatásai a keringő HMGB1 semlegesítő hatásának köszönhetők-e, a HMGB1 ellenanyaggal kezelt egerekben specifikus HMGB1 ELISA segítségével mértük a plazma HMGB1 szintjét. A plazma HMGB1 szintje nem volt kimutatható (30 arra utal, hogy a semlegesítő antitest hatásai lokálisak voltak a kialakuló elváltozások helyén.

2. ábra. A magas zsírtartalmú étrendet tápláló, kontroll antitesttel (Ab; balra) és anti-HMGB1 semlegesítő antitesttel (jobbra) kezelt ApoE -/- egerekből származó aorta sinus ateroszklerotikus elváltozásainak mikroszkópos fényképei. A felső szakaszok az olajvörös O-val festett szakaszokat és a festés átlagos területeit mutatják (oszlopdiagram) a két egércsoportban. Alsó részek, immunhisztokémiai festés anti-CD68 (makrofág) antitest alkalmazásával és a festés átlagos területei (oszlopdiagramok) a két egércsoportban. A piros a kontroll antitestet jelzi; kék, anti-HMGB1 semlegesítő antitest. *P

A semlegesítő HMGB1 hatása az ateroszklerotikus elváltozások összetételére

Az érelmeszesedéses elváltozások összetételének elemzése a két csoport közötti különbségeket is feltárta a sejtösszetétel tekintetében. Mivel a HMGB1 stimulálhatja a dendritikus sejtek migrációját, 14,15 megvizsgáltuk, hogy a HMGB1 aktivitás semlegesítése gyengítette-e halmozódásukat a kialakuló elváltozásokban. Az immunhisztokémiai vizsgálatok és a kvantitatív elemzés a dendritikus sejtek felhalmozódásának jelentős csökkenését mutatták, a CD11c festés átlagosan az elváltozás területének 8 ± 1% -a volt az anti-HMGB1 semlegesítő antitesttel kezelt egerek aorta sinusában, míg a kontroll antitest 24 ± 3% -ában (P Megvizsgáltuk, hogy befolyásolja-e a dendritikus sejtek érésének markere, a CD83 expressziója. A léziókban a CD83 expresszió a dendritikus sejtpopulációnak csak egy kis részét képviselte, ami azt jelzi, hogy a dendritikus sejtpopuláció nagyrészt éretlen (3. ábra). Az anti-HMGB1 antitesttel végzett kezelés közel 60% -kal csökkentette a CD83 sejtpopulációt (P 31 Következésképpen megvizsgáltuk, hogy az anti-HMGB1 semlegesítő antitesttel kezelt egerekben volt-e hatással a CD4 + T-sejtek felhalmozódása. Az anti-HMGB1 semlegesítő antitestekkel végzett kezelés ~ 50% -kal csökkentette a CD4 + T-sejtek felhalmozódását az elváltozásokban (P 0,05; 4. ábra) 32; A Tim-1, a Th2 limfociták markere nem volt kimutatható (4. ábra). 33

3. ábra. A kontroll antitest (Ab; bal oldali) és az anti-HMGB1 antitest (jobb oldali) kezelt ApoE -/- egerek zsírtartalmú étrenddel táplált aorta sinus atheroscleroticus elváltozásainak immunhisztokémiája. A keresztmetszeteket anti-CD11c antitesttel festettük a dendritikus sejtek (felül) és az anti-CD83, az érett dendritikus sejtek markerének (alul) kimutatására. Az oszlopdiagramok az immunfestés mértékét mutatják be a 2 csoportban. A piros a kontroll antitestet jelzi; kék, anti-HMGB1 semlegesítő antitest. *P

4. ábra. A CD4 + T-sejtek eloszlása aorta sinus ateroszklerotikus elváltozásokban és polarizációjuk az ApoE -/- egerek kontroll antitesttel vagy anti-HMGB1 semlegesítő antitesttel történő kezelését követően. A felső, keresztmetszeteket anti-CD4 antitestekkel festettük a CD4 + limfociták kimutatására a kontroll (bal) és anti-HMGB1 antitest (jobb) kezelt egerekben. Alul balra, oszlopdiagram, amely a CD4 + limfocita sűrűségét mutatja az elváltozásokban. Alul jobbra, oszlopdiagram, amely a Tim3 és Tim1 kódoló mRNS-ek relatív bőségét mutatja az elváltozásokban. A piros az irányítást jelzi; kék, anti-HMGB1 kezelés. *P

HMGB1 semlegesítő és gyulladásos mediátorok elváltozásokban

A HMGB1 növelheti számos gyulladásgátló mediátor expresszióját, beleértve az MCP-1-t, az érrendszeri sejt-adhéziós molekulát-1 (VCAM-1) és számos citokint, köztük az IL-1β, IL-6 és a tumor nekrózis-α (TNF-α) expresszióját. ). 12,36,37 Megvizsgáltuk, hogy az anti-HMGB1 semlegesítő antitestekkel történő kezelés befolyásolhatja-e az ilyen gyulladásos mediátorok expresszióját fejlődő elváltozásokban. Az anti-HMGB1 semlegesítő antitestekkel végzett kezelés 50% -kal csökkentette a VCAM-1 expresszióját az elváltozásokban és az MCP-1 expressziót közel 70% -kal (mindkettő P 13 A HMGB1 egér makrofágokon történő kemoattraktáns hatásainak megerősítéséhez először felmértük annak képességét, hogy stimulálja az egér RAW264.7 makrofág migrációt 24 üreges kemotaxis kamrák segítségével. A HMGB1 stimulálta migrációjukat, több mint kétszeresére növelve a migrált makrofágok számát (P

5. ábra. HMGB1-stimulált makrofág kemotaxis in vitro és intraperitoneális makrofág-toborzás in vivo. A, Egér RAW264.7 makrofágok vándorlása in vitro, vivőanyagra vagy HMGB1-re adott válaszként (4 μg/ml). B, az F4/80 + Gr-1 (Ly-6C) + makrofágok száma, amelyeket a peritonealis (per.) Üregbe toboroztak 5 órával a vivőanyag vagy a HMGB1 (20 μg/ml) IP-injektálása után. C, a peritonealis öblítőfolyadék áramlási citometriás elemzése, amely F4/80 és Gr-1 populációkat mutat be 5 órával a vivőanyag vagy a HMGB1 injekciója után. A dobozos területeken az F4/80 + Gr-1 (Ly-6C) + populáció látható. D, A peritonealis üregbe toborzott F4/80 + CD11b + makrofágok száma 5 órával a vivőanyag vagy a HMGB1 IP-injektálása után. *P

Vita

Korábban beszámoltunk arról, hogy a HMGB1-et makrofágok expresszálják emberi aorta zsírsávokban és fibrofattyú elváltozásokban. 3 Előrehaladott érelmeszesedéses plakkokban a HMGB1-et vaszkuláris simaizomsejtek is expresszálják. 5 A szérum HMGB1 szintjét összefüggésbe hozzák a koszorúér betegségével is. 38,39 Ebben a tanulmányban bebizonyítottuk, hogy az ApoE -/- egerek aorta sinusán belüli érelmeszesedéses elváltozások a HMGB1-et is expresszálják, ami hozzájárul az elváltozás fejlődéséhez. A HMGB1 semlegesítése a savas farokban lévő aminosavakat megcélzó monoklonális antitest alkalmazásával, 29 az ateroszklerózis gyengült kialakulása. Vizsgálatunk azt sugallja, hogy a HMGB1 az elváltozásokban, nem pedig a keringő HMGB1, hozzájárul az érelmeszesedéshez, serkenti a makrofág-migrációt és növeli más immunsejt-típusok, valamint gyulladásgátló mediátorok felhalmozódását.

A HMGB1 in vitro sokféle hatást fejt ki a monocita/makrofágokra. Serkenti a makrofágok vándorlását, 13 monocita tapadást és terjedést, monocita-mátrix kölcsönhatásokat, 40 és dendritikus sejtek vándorlását. Megfigyeléseink kiterjesztik ezeket az eredményeket, és azt jelzik, hogy a HMGB1 kemoattraktív in vivo a makrofágok esetében is; A HMGB1 stimulálta az F4/80 + Gr-1 (Ly-6C) + makrofágok migrációját, amely altípus az atherosclerotikus elváltozásokban halmozódik fel. Úgy tűnik, hogy ez nem befolyásolja a monoblast/promonocita proliferációt, a monocita számot a vérben vagy a dendritikus sejtek elváltozásokból történő kiáramlását.

Amellett, hogy befolyásolja az immunsejteket, a HMGB1 hatással lehet a vaszkuláris simaizomsejtekre, stimulálva azok migrációját 11 és a proliferációt. 4 Anti-HMGB1 semlegesítő antitestekkel végzett kezelés csökkentette a simaizom sejtek felhalmozódását és a fejlődő elváltozásokon belül a proliferáló sejtek számát. Az intimát tekintik annak a „talajnak”, amelyben az érelmeszesedés kialakul, 44 és fejlődésének/növekedésének csillapítása a HMGB1 aktivitás semlegesítésével és az intim simaizom populáció csökkentésével hozzájárulhat az elváltozás méretének csökkenéséhez. Bár kimutatták, hogy a HMGB1 stimulálja az endothel sejtek proliferációját és az angiogenezist, úgy tűnik, hogy az anti-HMGB1 semlegesítő antitesttel végzett kezelés nem befolyásolja az endothel sejteket.

Bár vizsgálataink azt mutatják, hogy a HMGB1 hozzájárul a lézió kialakulásához a makrofág-migráció serkentésével és a dendritikus sejtek aktiválásával, a receptorok, amelyeken keresztül ezek a hatások közvetítésre kerülnek, még nem azonosíthatók. Érdekes megjegyezni, hogy a makrofágokra, a dendritikus sejtekre és a T-sejtekre, valamint a vaszkuláris simaizomsejtekre megfigyelt hatásokat nagyrészt a RAGE-val való kölcsönhatásoknak tulajdonították. A RAGE gátlása gyengíti a lézió fejlődését, és a makrofág és a simaizomsejtek felhalmozódásának csökkenésével, valamint a VCAM-1 expresszió csökkenésével jár együtt, 45 olyan hatással, amelyet a HMGB1 semlegesítése után észleltünk. Nem zárhatjuk ki azonban annak lehetőségét, hogy a HMGB1 más receptorokkal is kölcsönhatásba lépjen az érelmeszesedés kialakulása során, beleértve a TLR2-t, TLR4-et vagy a CD24/Siglec-10 rendszert. Eredményeink biztató alapot nyújtanak az ateroszklerózis új terápiás megközelítésének kidolgozásához, esetleg a rekombináns antitestek újabb formátumainak felhasználásával.

Összefoglalva, adataink kiterjesztik a HMGB1 expresszióját a humán érelmeszesedéses elváltozásokban, és bizonyítják, hogy lokálisan az 1 expresszált HMGB hozzájárul a lézió kialakulásához azáltal, hogy stimulálja a makrofág migrációt és modulálja az olyan gyulladásos mediátorokat, mint az MCP-1 és a VCAM-1. A HMGB1 közvetett módon hozzájárul a dendritikus sejtek és a CD4 + T-sejtek felhalmozódásához is. Az eredmények meghatározzák az érelmeszesedés új potenciális terápiás célpontját.