Hosszú távú megvonás után is fennáll az erős alkoholfogyasztás hatása a vérnyomásra és a vese szerkezetére

Biomedicina Tanszék, Orvostudományi Kar, Porto Egyetem.

Alameda professzor, Hernâni Monteiro; 4200-319 Porto (Portugália)

Tel. +351 225513616, Fax +351 225513617, E-mail [email protected]

Kapcsolódó cikkek a következőhöz: "

Facebook
Twitter
LinkedIn
Email

Absztrakt

Bevezetés

A vesék szerves szerepet játszanak a vérnyomás (BP) szabályozásában, és a vesefunkció legkisebb károsodása is hozzájárulhat a magas vérnyomás kialakulásához [1, 2], amely továbbra is a morbiditás és a halálozás vezető oka világszerte [3]. A magas vérnyomás kialakulásának módosítható kockázati tényezői között a nehéz etanolfogyasztást tartják az egyik legrelevánsabb egészségtelen életmód-mintának [3, 4], és epidemiológiai, klinikai és kísérleti vizsgálatok adatai kényszerítő kapcsolatot nyújtottak e két feltétel között [ 4-10]. Bár széles körben ismert, hogy a nagy mennyiségű etanolfogyasztás hipertóniás hatású [4-13], és számos szerv károsodását idézheti elő [6, 10-16], a vese szerkezetére és működésére gyakorolt hatása még tisztázatlan [16-18]. Ezenkívül nagyon kevés klinikai és kísérleti tanulmány értékelte az alkoholelvonás hátterében álló BP-változásokat, különösen az akut megvonás után [19, 20], de nincsenek további vizsgálatok alkoholfogyasztás hiányában, különösen annak következményei a BP-re és a vese szerkezetére.

A krónikus etanolfogyasztás különböző mechanizmusok révén emeli a BP-t [5, 8, 11, 12], beleértve a renin-angiotenzin rendszer (RAS) aktiválódását [11, 21, 22], oxidatív stresszt [11, 12, 18, 21-23 ] és a szimpatikus idegaktivitás fokozása [5]. Az angiotenzin II (Ang II) által kiváltott hatások nagy részét az Ang II 1. típusú receptor (AT1R) közvetíti [21, 22, 24, 25], például a szisztémás BP emelkedése, vazokonstrikció, a vese szimpatikus idegaktivitásának gátlása, baroreceptor kontroll, glomeruláris hipertónia, valamint a nátrium és a testnedvek visszatartása [22, 24-26]. Ezenkívül bizonyítékok vannak arra, hogy az intrarenalis RAS kóros aktiválása fokozza az oxidatív stresszt [2, 27, 28], és elősegíti a vesekárosodást, nevezetesen a glomerulusok, a tubulusok és az érrendszer [22, 24, 28]. Az etanolfogyasztásnak a vese szerkezetére és működésére gyakorolt hatásaival kapcsolatos adatok eltérőek, valószínűleg a több tanulmányban elfogyasztott etanol mennyiségének különbségei miatt [6, 15-17, 29]. Lehetséges, hogy a szisztémás hipertóniás hatások mellett a nagy mennyiségű etanolfogyasztás is ronthatja a vesék szerkezetét és működését, ezáltal hozzájárulva a magas vérnyomás fenntartásához.

Ez a munka a hosszú távú nehéz etanolfogyasztás hatását vizsgálta a BP-re, a vesemorfológiára és az AT1R expresszióra. Ezenkívül megvizsgáltuk, hogy a visszavonás képes-e visszavonni ezeket a hatásokat. Tudomásunk szerint ez az első prospektív vizsgálat állatokon, amely azt vizsgálta, hogy a krónikus alkoholfogyasztás miatti vesefiziológiai és szerkezeti változások 2 hónapos megvonás után is fennmaradnak-e. Ez az utólagos értékelés jelentős lehetőséget kínálhat a hosszú távú erős etanol-fogyasztással kapcsolatos kardiovaszkuláris komorbiditás kilátásaival kapcsolatos ismereteink javítására.

Anyagok és metódusok

Kísérleti állatok

1. ábra.

A kísérleti terv ütemtervének sematikus rajza. A vizsgálat két patkánycsoporttal indult: kontroll-8m, fehér oszlop és etanol, fekete oszlop, és 6 hónapig tartott. Abban a pillanatban (S1) az egyes csoportok állatainak fele áldozat volt. A fennmaradó állatok folytatták a vizsgálatot, az összes ivóvizet (kontroll-10 m csoport, fehér oszlop és kivonási csoport, négyzet alakú oszlop), és két hónappal később felöltettük (S2). Mivel a kontroll-8m és a kontroll-10m adatai nem különböztek egymástól, mindkét kontrollcsoportot együtt ábrázoltuk. Szaggatott vonalak jelzik a vér etanol-koncentrációjának meghatározásának momentumait. Az árnyékolt oszlopok a BP meghatározásának három hetét jelzik (1 hét az előkészítéshez és két hét a rögzítéshez).

Valamennyi eljárást az Európai Közösségek Tanácsának állatkísérleti irányelveinek (2010/63/EU) és a portugál 113/13. Törvénynek megfelelően hajtották végre, és a Portói Egyetem Orvostudományi Karának állatjóléti etikai felülvizsgálati bizottsága (ORBEA) hagyta jóvá.

Vérnyomásmérés és vérbiokémia

A diasztolés, szisztolés és átlagos artériás vérnyomást a CODA farok-mandzsetta vérnyomásrendszerrel mértük (Kent Scientific Corporation, Connecticut, USA). Az állatokat a mérés előtt egy hét alatt adaptációs periódusnak vetettük alá. A BP-méréseket az etanol és az elvonás utolsó két hetében rögzítették [14].

Vérmintákat (500 μl) havonta egyszer gyűjtöttünk 2 óra fényeltolás és fénybeesés után, közvetlenül Eppendorf-csövekbe a vér etanol-koncentrációjának mérésére. A kísérleti periódus végén a vért közvetlenül a bal kamrából vettük fel heparinizált tűkkel, kétszer centrifugáltuk 2000 fordulat/perc sebességgel 10 percig, a szérumot összegyűjtöttük és –80 ° C-on tároltuk. A véralkohol-koncentrációt kereskedelmi készlet segítségével mértük (K620-100; BioVision, Mountain View, CA, USA). A vér etanolkoncentráció-értékeit az összes havi meghatározás átlagaként mutatjuk be. A szérum kreatinin, húgysav, karbamid és albumin szintjét PRESTIGE 24i® automatizált kémiai analizátorral számszerűsítettük. A szérum kreatinin, húgysav és karbamid szint eredményeit mg/dl-ben, a szérum albumin szintjét g/dl-ben fejezzük ki.

Hisztomorfológia és immunhisztokémia

A kísérleti időszak végén patkányok (n = Csoportonként 6 = nátrium-pentobarbitál oldattal (80 mg/ttkg; i.p. injekció, Abbott; North Chicago, IL) altattuk és transzkardiálisan 4% paraformaldehiddel foszfátpufferben perfundáltuk. A veséket eltávolítottuk, lemértük és ugyanabban a fixáló oldatban tároltuk.

A vese glomerulusok hisztomorfológiáját PAS-vel festett metszetekben elemeztük. A glomerulusok által elfoglalt vese kéreg frakcióját (Vv) pontszámláló rendszer [37] alkalmazásával, 400-szoros nagyítással, monitor szinten határoztuk meg. Mindegyik szakaszban a látómezőket szisztematikusan, 2000 µm-es időközönként mintázták az x és az y tengely mentén; a számláló keret területe 511 mm 2 volt. A vese glomerulusok arealisűrűségét (NA) ugyanazon látómezőben becsültük meg, amelyet a Vv becsléséhez használtunk. A glomeruláris profilcsomó és a vesetest területét pontszámlálással [37] mértük, 800x-os nagyítással a monitor szintjén. Vesénként ötven glomerulust mértek.

Western blot módszer

Biokémiai elemzésekhez patkányok (n = 4 csoportonként) a kísérleti eljárás végén pentobarbitális adagolással eutanizáltuk. A veséket összegyűjtöttük és –80 ° C-on tároltuk későbbi feldolgozás céljából.

A fehérje extrakciót és a fehérje koncentráció meghatározását a korábban leírtak szerint végeztük [14], teljes vesehomogenátumok felhasználásával. Az immunblotot ugyanazon nyúl anti-AT1R antitesttel hajtottuk végre 1: 500 hígítással, és egér anti-α-tubulint (T6199, RRID: AB_477583; Sigma-Aldrich, Madrid, Spanyolország) 1: 1000 hígítással, majd inkubáltuk anti torma-peroxidázhoz konjugált nyúl (Sigma-Aldrich, Madrid, Spanyolország) és egérellenes (Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornia) 1: 1000 hígítás mellett. A jeleket a Chemi-lumi szubsztráttal (Chemidoc MP, Bio-Rad Laboratories) tettük láthatóvá. A sávok optikai sűrűségét Image Lab szoftverrel (Bio-Rad Laboratories) mértük, és denzitometriával számszerűsítettük, a normalizáláshoz α-tubulin expressziót használva endogén kontrollként.

Statisztikai analízis

A csoportok összehasonlítását egyirányú ANOVA-val végeztük, független változóként a kezeléssel. Valahányszor jelentős eredményeket találtak, páronkénti összehasonlításokat végeztek a post hoc Tukey tesztjével a GraphPad PRISM 6.0 verzió (San Diego, CA, USA) segítségével. A szérumszinteket és a vérnyomásméréseket átlag ± SEM-ként mutatjuk be. A fennmaradó eredményeket átlag ± SD-ként mutatjuk be. A különbségeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük, ha o * p ** p # p ## az etanol beadásának első napja (5% vízben). A hónap = 1 mérések tartalmazzák az etanol alkalmazkodási időszakát. A 7. havi mérések az etanol fokozatos kivonási idejét tartalmazzák. A folyadékbevitel meghatározása az ET csoportban a 2. és a 6. hónap között megfelel az etanol (20%) bevitelének. A 6. hónapban a C és ET patkányok felét leöltük (n = 10 az ET csoportban és n = 5 a C csoportban). A vizsgálat végén a többi patkányt leöltük (n = 10 a W csoportban és n = 5 a C csoportban).

Az etanollal kezelt patkányok által elfogyasztott táplálék és folyadék mennyisége az etanollal végzett kezelés első hónapjában a kontrollok által fogyasztott táplálék 45% -át, illetve 35% -át csökkentette, majd viszonylag stabil maradt (2B. És C ábra ). A megvonás után az elfogyasztott élelmiszer és folyadék mennyisége megközelítőleg visszaállt a kontroll patkányok által fogyasztott mennyiségre.

A kezelés jelentős hatással volt az abszolút és a relatív vese súlyra (o * p ** p # p ## p * p ** p # p ## p * p ** p *** p * p # p