A perifériás leptinre adott válasz akut változásai az étrend összetételének megváltozásával

Pennington Biomedical Research Center, Louisiana State University, Baton Rouge 70808;

Georgia Egyetem, Athén, Georgia 30602

Pennington Biomedical Research Center, Louisiana State University, Baton Rouge 70808;

Élettani Tanszék, Louisiana Állami Egyetem Orvostudományi Kar, New Orleans, Louisiana 70112; és

Absztrakt

az elhízott fehérje, a főként a zsírszövet által termelt és a vérbe engedett fehérje fontos hormon az étkezés és a testtömeg homeosztázisának szabályozásában (5, 6, 16, 29). Úgy tűnik, hogy ennek a hormonnak az in vitro szintézise reagál mind az inzulinra, mind a glükokortikoidokra (4, 23, 24). A leptint telített rendszeren (3) keresztül szállítják az agyba, ahol működését modulálják a receptor hosszú formáján (OB-Rb) és egy JAK-STAT jelátviteli út aktiválásán keresztül (15). A leptin útvonalának károsodása elhízás kialakulásához vezet. A leptin csökkenti a táplálékfelvételt és növeli az energiafogyasztást mindkettőbenob/ob és nem boma egerek (5, 17).

Állatok és étrend.

Ötven hím Osborne-Mendel patkányt használtunk a Pennington Biomedical Center tenyésztelepéből, kezdő tömegük 250 ± 2 g volt. A patkányokat függesztett rozsdamentes acélból készült ketrecekben helyezték el egy szabályozott hőmérsékletű helyiségben (22–23 ° C) 12: 12 órás világos-sötét ciklussal (a lámpa 0700-kor világít), és szabad hozzáférést biztosítottak az automatikus öntözőrendszerhez. Magas zsírtartalmú étrendhez (zsírból származó energia 56% -a, 4,78 kcal/g) vagy alacsony zsírtartalmú (10% zsírtartalmú energia, 3,66 kcal/g) étrendhez igazodtak ad libitum, legalább 2 hétig. Mindkét étrend fehérjetartalma azonos volt a teljes energia 24% -ánál. Ezen étrendek összetételét korábban leírták (19). Az ételek csészéit rozsdamentes acél rugókkal rögzítették a ketrecekben, és naponta friss étrendet biztosítottak. A kísérleti eljárásokat és protokollokat az Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottság hagyta jóvá.

Peptid.

A rekombináns egérleptin a Novartis (Bázel, Svájc) ajándéka volt, máshol leírva (22). A leptint fiziológiás sóoldatban oldjuk (0,9 tömeg/térfogat%), és bolus injekció formájában adjuk minden tesztnapra, intraperitoneálisan 0,5 mg/testtömeg-kg dózisban.

Etetési tanulmány.

Szérumvizsgálatok.

A szérum leptin és inzulin (Linco, St. Charles, MO) és a kortikoszteron (ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA) vizsgálatához kereskedelmi radioimmun vizsgálatokat alkalmaztak.

A teljes RNS izolálása.

Az összes RNS-t a hipotalamusz szövetéből extraháltuk módosított guanidinium-izotiocianát módszerrel (8), TRIzol Reagent (GIBCO) alkalmazásával, a gyártó utasításainak megfelelően.

cDNS-próbák és Northern-blotok.

A 377 bázispár méretű NPY plazmid DNS-t Dr. Y. J. Zhou (Pennington Center) ajándékozta, az 5-HT2C receptor plazmid DNS-t pedig Dr. D. J. Julius (18) nyújtotta. A β-aktin DecaProbe-t Ambion-tól (Austin, TX) szereztük be. Húsz mikrogramm teljes hipotalamusz RNS-t denaturáltunk 65 ° C-on 15 percig, elektroforézist végeztünk 10 g/l agaróz/formaldeid géleken, és nejlonmembránokra helyeztük (Zeta-Probe, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Az NPY és az 5-HT2C receptor szondákat DECA prime II kit (Ambion) alkalmazásával jelöltük [32P] dCTP, 3 Ci/mol (111 GBq/mol) (NEN, Boston, MA) alkalmazásával. A blotokat 500 g/l formamiddal, 0,12 mol/l Na2HPO4 2-vel (pH 7,2), 0,25 mol/l NaCl és 70 g/l SDS-sel 1 órán át 42 ° C-on hibridizáltuk. A hibridizációt 18 órán át 42 ° C-on végeztük ugyanabban a pufferben, amely 1x109 számot tartalmazott · min –1 · μg –1 32 P-vel jelölt próbát. Ezután a membránokat szobahőmérsékleten mossuk 2x nátrium-klorid-nátrium-citrát (SSC)/9 g/l SDS-vel 15 percig, 0,5x SSC/(g × SDS) 20 percig és 0,1x SSC/(gx 1 SDS) 15 percig 65 ° C-on. A membránokat egy éjszakán át PhosphorImager-szűrőn tesszük ki, majd csíkozzuk és p-aktin cDNS-próbával rehibridizáljuk a gél betöltésének és átadásának kontrolljaként. A jel intenzitását egy PhosphoImage (Molecular Dynamics) módszerrel vizsgáltuk.

Adatelemzés.

Valamennyi eredmény átlag ± SE értékként jelenik meg. Az adatokat ANOVA-val elemeztük, és post-hoc teszteket készítettünk Duncan több tartományú tesztjével.

A bevizsgált diéták megegyeznek az adaptált étrendekkel.

A perifériás leptin injekció hatását a magas zsírtartalmú vagy alacsony zsírtartalmú étrendhez igazított és szokásos étrendjükön tesztelt patkányok táplálékfogyasztására az 1. ábra mutatja. A leptin (0,5 mg/kg ip) kezelés csökkentette a táplálékfelvételt alacsony zsírtartalmú étrendet fogyasztó patkányok (kezelés: F1,8 = 13,07,P

1. ábra.A perifériás leptin adagolásának hatása az alacsony zsírtartalmú (LF; A) vagy magas zsírtartalmú étrend (HF;B). A patkányokat ugyanazon étrenden tesztelték, amelyhez alkalmazkodtak. A leptin dózisa 0,5 mg/testtömeg-kg volt ip. Az adatokat az egyes diéták kumulatív bevitelének (kcal) átlagának ± SE-ként adjuk meg. Az egyes csoportok állatainak száma zárójelben látható. *P

Nagy zsírtartalmú étrendhez igazított patkányok alacsony zsírtartalmú étrenddel tesztelve.

Amikor korábban a magas zsírtartalmú étrendhez alkalmazkodott patkányoknak naiv módon alacsony zsírtartalmú étrendet biztosítottak közvetlenül a leptin beadása után (2. ábraA), a leptin jelentősen csökkentette az alacsony zsírtartalmú étrend bevitelét (F1,13 = 4,69, P

2. ábra.A leptin hatása a HF-étrendhez igazított patkányokban, de tesztelték, majd fenntartották LF-étrenden. Tovább 1. nap, patkányok naivak voltak az LF étrenddel kapcsolatban. Az adatokat a kumulatív bevitel átlagának ± SE-ként adjuk meg (kcal). Az egyes csoportok állatainak száma zárójelben látható. *P

Alacsony zsírtartalmú étrendhez igazított patkányok magas zsírtartalmú étrenddel tesztelve.

Amikor az alacsony zsírtartalmú étrendhez alkalmazkodott patkányoknak naiv módon bemutatták a magas zsírtartalmú étrendet (3. ábra), a leptin 2-24 óra alatt jelentősen elnyomta a táplálékfelvételt minden időpontban (leptin kezelés: F1,9 = 23,46,P

3. ábra.A leptin hatása patkányokban az LF étrendhez igazodva, de tesztelve, majd fenntartva a HF étrenden. Tovább 1. nap, patkányok naivak voltak a HF étrenddel kapcsolatban. Az adatokat a kumulatív bevitel átlagának ± SE-ként adjuk meg (kcal). Az egyes csoportok állatainak száma zárójelben látható. *P

A szérum hormonkoncentrációi.

A leptin és az étrend hatását a leptin, a kortikoszteron és az inzulin keringő szintjére 20 napig fenntartott ad libitum táplált patkányokban a magas vagy alacsony zsírtartalmú étrenden a 4. ábra mutatja. A magas zsírtartalmú étrenden tartott patkányok testtömege szignifikánsan magasabb volt (magas zsírtartalom: 483 ± 13,1 g szemben az alacsony zsírtartalommal: 437 ± 6,3 g) és a szérum leptin szintje (4. ábra)A) a vizsgálat végén. A leptininjekció után a szérum leptin a tápláléktól függetlenül mindkét patkánycsoportban azonos szintre emelkedett (leptin/magas zsírtartalom: 30,7 ± 3,3 ng/ml; leptin/alacsony zsírtartalom: 31,9 ± 10,2 ng/ml). A statisztikai elemzés azt is kimutatta, hogy az étrend jelentős hatással van az inzulinra (étrend: F1,26 = 9,26, P

4. ábra.A patkányok szérumhormon-koncentrációi 20 napig HF vagy LF étrendre váltottak, és akutan leptinnel vagy sóoldattal voltak ellátva. Az értékek (ng/ml) a csoport ± 6–8 patkány átlagának ± SE értékét jelentik. a, b, és c szignifikáns különbséget mutatP

Hipotalamusz NPY mRNS és 5-HT2C receptor expresszió.

Amint az 5. ábrán látható, az alacsony zsírtartalmú étrendet tápláló patkányok hipotalamuszának NPY mRNS-szintje magasabb volt, mint a magas zsírtartalmú étrendet tápláló patkányoknak (étrend: F1,25 = 13,19,P

5. ábra.A leptin hatása a HF vagy LF táplálékkal táplált patkányok hipotalamusz neuropeptid Y (NPY) mRNS expressziójára. A: NPY mRNS és β-aktin mRNS Northern blot minden egyes állatból. B: az NPY és a β-aktin mRNS aránya. Az értékek a csoport ± 6–8 patkány átlagának ± SE értékét jelentik. a, b, és c szignifikáns különbséget jelez P

6. ábra.A leptin hatása a HF vagy LF táplálékkal etetett patkányok hipotalamusz 5-hidroxi-triptamin (5-HT2C) receptor mRNS expressziójára. A: 5-HT2C receptor mRNS és β-aktin mRNS Northern blot-je minden egyes állatból. B: az 5-HT2C receptor mRNS és a β-aktin mRNS aránya. Az értékek a csoport ± 6–8 patkány átlagának ± SE értékét jelentik. a és b szignifikáns különbséget jelez P

A tanulmány fő megállapítása az, hogy a perifériás leptin táplálkozási reakcióját az étrend összetétele befolyásolja, amikor a patkányok alacsony zsírtartalmú étrendet fogyasztanak, de nem a magas zsírtartalmú étrendet fogyasztó patkányoknál. Amikor az alacsony zsírtartalmú patkányokat magas zsírtartalmú étrenden tesztelték, a leptin magas zsírtartalmú étrendre gyakorolt hipofág hatása1. nap, de az eltűnt 5. nap és15. Ezzel szemben, amikor a magas zsírtartalmú patkányokat alacsony zsírtartalmú étrenddel tesztelték, az etetés csökkenése nyilvánvaló volt 1. napés 15. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a magas zsírtartalmú étrend bevitele megszünteti a perifériás leptinre adott választ, és hogy az étkezési zsír rövid időn belül „leptin-rezisztenciát” válthat ki. Ezenkívül a leptin csökkentette a hipotalamusz NPY mRNS-ét alacsony zsírtartalmú patkányokban, de nem a magas zsírtartalmú étrendben tartott patkányokban.

A magas zsírtartalmú étrend bevezetése után számos tényező járulhat hozzá a leptinrezisztencia kialakulásához. Ide tartozik a keringő antagonista vagy a kötő fehérje jelenléte, a clearance megváltozása, az agyba történő transzport megváltozása, a leptin-receptor downregulációja, a JAK-STAT útvonal gátlása, vagy a SOCS3 vagy más citokin szignál inhibitorok aktiválása (15). Lehetségesnek tűnik, hogy a magas zsírtartalmú étrend fokozta a leptin clearance-ét, mivel az intraperitoneális leptininjekció után elért keringő leptinszint növekedése kisebb volt a magas zsírtartalmú táplálékkal rendelkező patkányokban, mint az alacsony zsírtartalmú étrendben. Az agyba történő leptin transzport telített (3), és az étkezési zsír befolyásolhatja, amint azt Banks és mtsai. (2) Az is lehetséges, hogy a receptor downregulációja vagy a receptor deszenzitizálása befolyásolja a jelátviteli utat. Nemrégiben kimutattuk, hogy az adrenalectomia után a leptin érzékenységének fokozása mind a JAK-STAT út konstitutív aktiválásából, mind a gátló SOCS3 gén expressziójának gátlásából következik (28).

Perspektívák

A magas zsírtartalmú étrend népszerű étrend lett, amely révén az elhízás rágcsáló modellekben kiváltható. Az elhízás más formáihoz hasonlóan ez is a leptin szekréciójának növekedésével jár. Feltételezzük, hogy a leptinrezisztencia látszólagos kialakulása a testfelesleg gyors lerakódásával és a kialakuló elhízással volt összefüggésben. A jelenlegi kísérletek arra utalnak, hogy maga a magas zsírtartalmú étrend rezisztencia állapotot indukál a perifériás leptinnel szemben. Hasonló változásokat figyeltek meg más orexigén és anorektikus szerekre, például CCK-ra és enterosztatinra való reagálásban az étrend összetételének változásával is. Az enterosztatin alkalmazásával ismét az étrendre adott válasz változásai nagyon gyorsan jelentkeztek vagy eltűntek. Az ilyen vizsgálatok azt sugallják, hogy a zsír bevitelével társított jel modulálja a peptidekre és a metabolikus jelekre adott választ, amely befolyásolja a lenyelés viselkedését. A „zsírjel” azonossága nem világos. Vagy lehet közvetlen válasz az étrend egyik összetevőjére; szagló, ízlelő, szenzoros vagy emésztőrendszeri idegi válasz; vagy lehet endokrin jellegű. Ennek a jelnek az azonosítása jelentős betekintést nyújt a testtömeg-szabályozás megértésébe.

Ezt a munkát az Országos Cukorbetegség és Emésztési és Vesebetegségek Intézete támogatta. 45278 és az Országos Gyermekegészségügyi és Humán Fejlesztési Intézet támogatása 28997.

LÁBJEGYZETEK

Az újranyomtatási kérelmek és egyéb levelezések címe: L. Lin, Pennington Biomedical Research Center, 6400 Perkins Road, Baton Rouge, LA 70808 (e-mail: [email protected] edu).