A Prdx1 elősegíti az elsődleges csillók elvesztését a nyelőcső laphámsejtes karcinómájában

Absztrakt

Háttér

Az elsődleges csillók elvesztését gyakran megfigyelik a daganatos sejtekben, ami arra utal, hogy ennek az organellának a hiánya elősegítheti a tumorgenezist aberrált jelátvitel, a sejtos ciklusból való kilépés képtelensége és a tumorsejtek inváziójának elősegítése révén. Az elsődleges csillóvesztés a nyelőcső laphámsejtes karcinóma (ESCC) sejtekben is előfordul, de a molekuláris mechanizmusok, amelyek megmagyarázzák, hogy az ESCC-sejtek hogyan veszítik el az elsődleges csillókat, továbbra sem ismeretesek.

Mód

A Prdx1 expressziójának gátlása az ESCC sejtekben a cilium regenerációval kapcsolatos, felfelé szabályozott gének és a gén chip által a cilium szétszereléséhez kapcsolódó, lefelé szabályozott gének kimutatására. Egereket és sejtkísérleteket végeztek a HEF1-Aurora A-HDAC6 jelátviteli tengely ESCC-ben betöltött szerepének megerősítésére.

Eredmények

Ebben a tanulmányban azt tapasztaltuk, hogy a Peroxiredoxin 1 (Prdx1) elnémítása helyreállítja az elsődleges csillóképződést, a Prdx1 túlzott expresszálása pedig elsődleges csillóvesztést idéz elő az ESCC sejtekben. Megmutattuk azt is, hogy a Prdx1 expressziója szabályozza a HEF1-Aurora A-HDAC6 jelátviteli tengely működését az elsődleges csillók szétszerelésének elősegítése érdekében, és a Prdx1 szuppressziója csökkent daganatképződést és tumor növekedést eredményez in vivo.

Következtetések

Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a Prdx1 az ESCC sejtekben a primer csillóképződés új szabályozója.

Háttér

Az elsődleges cilium egy antennaszerű organella, amely a legtöbb emlős típusának felszínén található, extracelluláris jelátviteli funkcióval, amely szabályozza a sejtek növekedését és fejlődését. A cilium szétszerelése szorosan összefügg a sejtciklus progressziójával és a külső jelátvitellel [1,2,3]. A cilium szétszerelése akkor következik be, amikor a sejtek szaporodnak, majd a helyreállítás a mitózis befejezése után következik be [4]. A strukturális vagy funkcionális csilló anomáliák sok genetikai betegséghez kapcsolódnak, amelyeket együttesen ciliopátiának nevezünk [5, 6]. A legújabb vizsgálatok kimutatták, hogy a csillók szorosan összefüggenek a tumorgenezissel [7,8,9], és az elsődleges csillók szétszerelhetők vagy elvesznek sok daganatos szövetben, beleértve a nyelőcső pikkelyes karcinómáját (ESCC) [3, 10], a vastagbélrákot [11], emlőrák [12], májrák [13], kolangiokarcinóma [14] és pajzsmirigyrák [15]. Ez arra utal, hogy a csillócsonkok szétszerelésének vagy elvesztésének gátlása a tumorsejtekben vagy a ciliaris regeneráció elősegítése gátolhatja a tumorsejtek szaporodását és invázióját.

Az ESCC a nyelőcső carcinoma fő szövettani altípusa. A legújabb vizsgálatok kimutatták, hogy évente 456 000 embert érint a nyelőcső carcinoma, amelynek a nyelőcső pikkelyes karcinóma körülbelül 90% -át teszi ki [16, 17]. Az ESCC az egyik legagresszívebb daganat világszerte, ötéves túlélési aránya kevesebb, mint 20% [18, 19]. A Prdx1 egy antioxidáns fehérje, amely széles körben expresszálódik az eukarióta sejtekben, védi a sejteket az ROS károsodásaitól [20], és szabályozza a sejtek szignál transzdukcióját a sejtproliferáció és a H2O2 aktivitás szabályozásával. A Prdx1 kóros expressziójáról sokféle daganat esetében számoltak be [21, 22]. Számos tanulmány kimutatta, hogy a Prdx1 magasan expresszálódik az ESCC-ben, és a Prdx1 szorosan összefügg az elsődleges csillók szétszerelésével daganatokban [23]. Így a Prdx1 és az elsődleges csillók fontos szerepet játszhatnak az ESCC kialakulásában, így a Prdx1 izgalmas potenciális célpont lehet a tumor kezelésében. Azonban az a részletes molekuláris mechanizmus, amellyel a Prdx1 szabályozza a csillók szétszerelését az ESCC-ben, továbbra sem világos.

Korábbi kutatásaink kimutatták, hogy az evolúciósan konzervált Prdx1 részt vesz a cilium szétszerelésének szabályozásában, és csökkenti az Aurora A, a cilium diszgregáció marker fehérjének aktivitását [3, 10]. Ebben a tanulmányban kibővítettük ezt a munkát, és megállapítottuk, hogy a Prdx1 expressziójának gátlása az ESCC sejtekben jelentősen felfelé szabályozott géneket jelent a cilium regenerációval kapcsolatban, és lefelé szabályozott géneket a cilium szétszerelésével kapcsolatban. Sejt- és állatkísérleteket hajtottak végre, és bebizonyították, hogy a Prdx1 szabályozó szerepet játszik a cilium szétszerelésének fő jeltengelyében, az NEDD9 (HEF1) -Aurora A-HDAC6-ban, és befolyásolja az ESCC sejtek tumorigenitását és invazivitását. Összességében az eredményeink azt mutatják, hogy a Prdx1 hozzájárul az elsődleges csillók szétszereléséhez azáltal, hogy az ESCC-ben szabályozza a NEDD9-Aurora A-HDAC6 jel tengelyét.

Mód

Sejt törzsek és állatok

Az emberi nyelőcső pikkelyes karcinóma sejtvonalat, az EC9706-ot a Kínai Orvostudományi Akadémia Állami Molekuláris Onkológiai Laboratóriumától kaptuk. A kísérleti sejteket hét csoportra osztottuk, normál EC9706 sejtekre, shPrdx1 lentivírussal (shPrdx1) transzfektált EC9706 sejtekre, negatív kontroll lentivírussal (shControl) transzfektált EC9706 sejtekre, OE-Prdx1 lentivírussal (OE-Prdx1), EC9706 sejtekkel transzfektált EC9706 sejtekre. megfelelő negatív kontroll lentivírussal (OE-Control), Tripolin A-val kezelt EC9706 sejtekkel (EC9706 + Tripolin A) és OE-Prdx1 lentivírussal transzfektált és Tripolin A (OE-Prdx1 + Tripolin A) sejtekkel transzfektáltuk. Egészséges hím BALB/c meztelen egerek (4 hét, n = 20, 10 minden csoportban) a Kínai Tudományos Akadémia Állatközpontja (Sanghaj, Kína) biztosította. Valamennyi állatot az Országos Egészségügyi Intézet laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó útmutatójának (NIH 8023. sz. Kiadvány, 1978. évi átdolgozás) által kidolgozott irányelvek szerint nevelték és kezelték. Az egereket szigorúan ellenőrzött SPF környezeti körülmények között helyeztük el, és az egereket CO2 inhalációval felöltettük.

Lentivírus megszerzése

A Prdx1 interferáló és negatív kontroll lentivírus plazmidot úgy állítottuk elő, hogy a célszekvenciát (shPrdx1: TGTCTGACTACAAAGGAAA, shControl: TTCTCCGAACGTGTCACGT) beillesztettük a GV112-Lentivirus vektor Age I/EcoR I restrikciós enzim vágóhelyeibe a korábbi eredmények szerint [3]. A túl expressz Prdx1-et (hozzáférési szám: NM_001202431) és a kontroll plazmidot úgy állítottuk elő, hogy a célszekvenciát a GV287-Lentivirus vektor Age I/BamHI restrikciós enzim vágóhelyeibe illesztettük. A plazmid vektorokat a Genechem Co. Ltd.-től (Sanghaj, Kína) szereztük be. A célgén szekvencia szintézisét, a plazmid hordozó létrehozását és a lentivírus csomagolását a korábban leírtak szerint hajtottuk végre [3].

Sejtkultúra és lentivírus transzfekció

Az EC9706 sejteket 10% magzati szarvasmarha-szérumot (FBS, Gibco) tartalmazó RPMI-1640 táptalajon (Gibco) tenyésztettük, 5% CO2-ot tartalmazó párás atmoszférában, 37 ° C-on. Az EC9706 sejteket (MOI = 100) shPrdx1 lentivírussal (1x109 TU/ml) vagy a túlzottan expresszált Prdx1 lentivírussal (1x108 TU/ml) fertőztük meg a Prdx1 szintjének csökkentése vagy növelése érdekében. A megfelelő negatív kontroll lentivírust hasonlóan transzfektáltuk a sejtekbe. Az eljárás a következő volt. Az EC9706 sejteket 6 lyukú mikrolemezbe oltottuk be 1 × 105/üreg sűrűségben. Ezután 1 ml antibiotikum nélküli táptalajt adunk minden lyukba, amikor a sejtek 30% -os összefolyásra nőnek. Ezután 5 mg/ml polibrént és a lentivírust adunk hozzá, és 12 órán át 37 ° C-on tenyésztjük, majd 2 ml friss táptalajt adunk hozzá. A GFP fluoreszcens fehérje expresszióját invertált fluoreszcens mikroszkóppal mértük a lentivírus transzfekció hatékonyságának indikátoraként. A sejteket 72 órán belül gyűjtöttük a további kísérletekhez.

Gén chip detektálás

Gén chip detektálást alkalmaztunk az ESCC sejtekben a Prdx1 interferenciát követő gén és szignál útvonalak változásainak detektálására. A kontroll EC9706 sejtek teljes RNS-ét és azokat a sejteket, amelyekben a Prdx1 gátolt volt, Trizol reagenssel izoláltuk. A kivont összes RNS-mintát minőségi tesztnek vetettük alá NanoDrop 2000-vel és Agilent Bioanalyzer 2100-mal. A minősített mintákat ezután egy Affymetrix által kifejlesztett humán génexpressziós profil chipre (chiptípus: GeneChip primeview human, szám: 901838) vittük fel. A hibridizációt, a gén chip lemosását, beolvasását és adatelemzését a Genechem Co. Ltd. (Sanghaj, Kína) fejezte be.

Daganatképződés meztelen egerekben

Negatív kontroll EC9706 sejteket logaritmikus növekedési fázisban és gátolt Prdx1 szinttel rendelkező EC9706 sejteket készítettünk sejtszuszpenzióként, és szubkután injekciózva a meztelen egerek jobb hónaljába injektáltuk (2 × 107/ml, mindegyikhez 200 μl). Minden meztelen egér testtömegét és tumor térfogatát hetente kétszer mértük. Mindegyik meztelen egeret 23 nap múlva altatásban feláldoztuk, és az egereket élő képalkotó eszközbe (IVIS® Lumina III) helyeztük a luciferáz lumineszcencia detektálására, majd a daganatot eltávolítottuk, lemértük, lefényképeztük és konzerváltuk az egér feláldozása után.

Sejt csillók immunfluoreszcenciás kimutatása

A sejt csillóképződésének előidézése érdekében a sejteket 24 lyukú lemezre oltottuk. Amikor a sejtsűrűség 80% volt, a táptalajt friss szérummentes táptalajjal helyettesítettük 4-6 napig. Az immunfluoreszcencia mérése érdekében a sejteket tartalmazó tárgylemezeket 4% poliformaldehiddel rögzítettük 30 percig, glicinnel (2 mg/ml) inkubáltuk 5 percig, majd 5% BSA-val 20 percig blokkoltuk. Ezután a nyúl antiacetil-a-tubulin (1: 500, Abcam) antitestet adtuk hozzá, és egy éjszakán át inkubáltuk 4 ° C-on. Háromszor PBST-vel végzett mosás után a sejteket inkubáltuk juh nyúlellenes antitesttel (1: 200, Santa Cruz), IgG/TR-vel jelöltük 1 órán át 37 ° C-on, majd háromszor mostuk PBST-vel. A magfestést DAPI reagenssel végeztük 7 percig, majd a fedőlapot lezártuk. Pozitív fluoreszcencia mikroszkóppal (ECLIPSE NI, Nikon, Japán) alkalmaztuk a sejtek megfigyelését és fényképezését.

Kvantitatív valós idejű PCR

A cDNS-t szintetizáltuk a teljes RNS-ből (1 μg), amelyet TRIzol-reagenssel tisztítottunk, majd kvantitatív valós idejű reverz transzkripciós PCR-t (qRT-PCR) hajtottunk végre Rotor-Gene 6000 termocikluson (Corbett Research, Sydney, Ausztrália) KAPA SYBR alkalmazásával. FAST Universal 2X qRT-PCR Master Mix (Kapa Biosystems, Woburn, MA, USA). Az FGFR1, IGF1R, ABI2 és NEDD9, Aurora A, HDAC6 alapozóit Sangon Biotech (Sanghaj, Kína) tervezte. A PCR reakció paraméterei a következők voltak: 1 ciklus 95 ° C-on 3 percig, majd 40 ciklus, amelyek mindegyike három lépést tartalmaz: 95 ° C 3 másodpercig, 55 ° C 15 másodpercig és 72 ° C 30 másodpercig. Valamennyi PCR mintát három példányban készítettük el, és a relatív mRNS expressziós szinteket GAPDH-ra normalizáltuk, és a 2 -ΔΔCt módszerrel határoztuk meg.

Transwell inváziós kísérlet

Transwell inváziós kamrákat (cikkszám: 354480, Corning) használtunk a sejtinváziós kapacitás kimutatására. A szérummentes táptalajt 37 ° C-ra előmelegítettük, hozzáadtuk a felső kamrához, és 2 órán át 37 ° C-os inkubátorban inkubáltuk. A táptalaj eldobása után 500 μl 10% FBS-t tartalmazó friss táptalajt adunk az alsó kamrához, és a felső kamrához 300 μl sejt-szuszpenziót (2 × 105 sejt/ml) adunk. 24 órás inkubálás után a kamrát eltávolítottuk, kétszer PBS-sel mostuk, majd 5% glutáraldehiddel rögzítettük 30 percig 4 ° C-on. A sejteket 1% kristálylila festőoldattal 20 percig festettük, majd háromszor PBS-sel mostuk. A felső felületen lévő sejteket pamutgolyókkal tisztítottuk meg, és a kamra alján lévő sejteket lefordítottuk egy invertált mikroszkóp segítségével (Nikon, Japán). Az átlagértéket kilenc látómezőben megszámlált sejtek átlagolásával határoztuk meg.

Western-blot kísérlet

Western-blot-t alkalmaztunk a sejtekben és a tumorszövetekben található fehérjeszintek kimutatására és elemzésére. Az összes fehérjét sejtekből vagy szövetekből extraháltuk, a BCA reagens módszerrel számszerűsítettük, majd 8% vagy 10% (w/v) SDS-PAGE-vel elválasztottuk. A fehérjét PVDF membránra (Bio-Rad, Hercules) vittük át, 1,5 órán át blokkoltuk 5% (w/v) sovány tejjel TBST-ben szobahőmérsékleten, és egy éjszakán át inkubáltuk 4 ° C-on Prdx1 antitesttel (1: 10000, Abcam), NEDD9 antitest (1: 1000, sejtjelző technológia), p-Aurora A antitest (1: 1000, Gentex), Aurora A antitest (1: 10000, Abcam), HDAC6 antitest (1: 10000, Abcam) vagy a GAPDH antitest (1: 10000, Abcam). A membránokat háromszor mossuk TBST-vel, majd torma-peroxidáz-konjugált (HRP) szekunder antitesttel inkubáljuk 1 órán át szobahőmérsékleten. A fehérje jelet fehérjegél képalkotó rendszerrel detektáltuk (ChemiDocXRS + Imaging System; Bio-Rad).

Statisztikai analízis

Az összes adatot átlag ± SEM-ben fejeztük ki. A variancia egyirányú elemzését és a t tesztet végeztük a különböző minták közötti különbségek összehasonlítására. Az összes adatot a GraphPad Prism 5.0 szoftver segítségével elemeztük. A különbség statisztikailag szignifikáns volt, ha P

Eredmények

A prdx1 gátlása helyreállította az elsődleges csillókat és elnyomta a tumor invázióját

Annak érdekében, hogy tanulmányozzuk a Prdx1 gátlásának csillókra és sejtfunkciókra gyakorolt hatását, gén chip detektálást, majd sejtekben végzett kísérleteket használtunk az eredmények igazolására. A Prdx1 expressziójának gátlásához lentivírust (shPrdx1) transzfektáltunk EC9706 sejtekbe. Az shPrdx1 lentivírussal és az shControl lentivírussal (negatív kontroll) transzfektált EC9706 sejteket gén chip elemzésnek vetettük alá, hogy tanulmányozzuk a sejtek génexpressziójában és szignálpályáiban bekövetkező lehetséges változásokat a Prdx1 gátlása után. .

A Prdx1 szabályozta a NEDD9-Aurora A-HDAC6 cilium szétszerelési jel tengelyének expresszióját ESCC-ben

A Tripolin a megfordította a túl expresszált Prdx1 hatását a cilium szétszerelésére és a tumor inváziójára

A Prdx1 gátlása csökkentette a tumorgenezist, csökkentette a tumor térfogatát és súlyát, és elősegítette a cilium regenerációját

A csökkent Prdx1 a NEDD9-Aurora A-HDAC6 cilium diszgregációs jel tengelyét szabályozta a tumorszövetben

Tovább elemeztük az állatdaganatok intracelluláris fehérjéit meztelen egerekben. A Prdx1 expressziója csökkent az shPrdx1 csoportban, összehasonlítva a negatív kontroll csoport szintjével. Ezenkívül az intracelluláris NEDD9, p-Aurora A és HDAC6 expressziós szintje szintén szignifikánsan csökkent az shPrdx1 csoportban (7. ábra). Ez összhangban volt a fenti sejtvizsgálati eredményekkel, és azt is jelezte, hogy a Prdx1 a nyelőcső pikkelyes sejtjeiben a carcinoma cilium diszgregációját és a tumor invázióját elősegítő hatást a NEDD9-Aurora A-HDAC6 szignál tengelyének modulálásával érte el.

Vita

A Prdx1 a peroxid-oxidáció-redukciós enzimcsalád tagja, rendellenes expressziója szorosan összefügg a daganatok több típusával [37,38,39]. A legújabb vizsgálatok azt mutatták, hogy a Prdx1 magas expressziója elősegítheti a nyelőcső carcinoma előfordulását és progresszióját, és hogy a Prdx1 expresszió gátlása elősegítheti a sugárzást és a kemoterápiás érzékenységet a nyelőcső carcinoma kezelésében [40, 41]. Korábban azt tapasztaltuk, hogy a Prdx1 elősegítheti a csillók diszgregációját az ESCC-ben és erősítheti a tumorsejtek inváziós képességét. Ezenkívül a Prdx1 expresszió gátlása elősegítheti a cilium regenerálódását és lefelé szabályozhatja a cilium diszgregációs marker fehérje, Aurora A aktivitását [3, 10]. Itt a Prdx1 expressziójának gátlása az ESCC sejtekben jelentősen felfelé szabályozta a cilium regenerációjával kapcsolatos géneket és lefelé szabályozott géneket a cilium diszgregációjával kapcsolatban. Sejt- és állatkísérletek kimutatták, hogy a Prdx1 szerepet játszik a cilium diszgregáció kritikus NEDD9-Aurora A-HDAC6 szignál tengelyének szabályozásában, és befolyásolja az ESCC sejtek tumorképződését és inváziós képességét. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a Prdx1 a cilium diszgregáció kritikus szabályozója volt az ESCC-ben, ezért a kezelés fontos célpontjává vált.

A Prdx1 expresszió gátlása az shPrdx1 lentivírussal elősegítette a csillóképződést az EC9706 sejtekben, és gátolta a tumorsejtek inváziós képességét. Meztelen egerekben a Prdx1 gátlása után a daganatképző képesség, a tumor térfogata és a tumor súlya jelentősen csökkent. Így a Prdx1 elősegítheti az ESCC előfordulását és progresszióját a csilló diszgregáció előidézésével. Eredményeink összhangban vannak más megállapításokkal, amelyek szerint a Prdx1 gátlása gátolhatja a daganatok előfordulását, invázióját és metasztázisát [42, 43]. Számos mechanizmust javasoltak azonban a Prdx1 csilló depolimerizációra gyakorolt hatásainak magyarázatára. Chae Soomin és mtsai. [44] megállapította, hogy a Prdx1 leütés az embriogenezis során jelentősen gátolta a proximális tubulus képződést a pronephrosban, jelentősen megnövelte a reaktív oxigénfajok (ROS) sejtek szintjét, és károsította az elsődleges csillók képződését. Az aktivitások közötti különbség tükrözheti a Prdx1 különböző szerepét a csillóképződésben a különböző sejtkomponensek és a különböző betegségállapotok szempontjából. További kísérletek indokolttá teszik ezeket a kísérleteket a Prdx1 csillókra gyakorolt hatásának jellemzésére.

Számos tanulmány kimutatta, hogy a Prdx1 elsősorban a ROS, TGF-β1, mTOR/p70S6K és ROS/ERK/cyclin D1 szintjének beállításával segíti elő a tumor előfordulását [47,48,49]. Azonban a Prdx1 hatása és mechanizmusa a nyelőcső laphámsejtes karcinómájára még tovább kell vizsgálni. Itt megmutattuk, hogy a NEDD9-Aurora A-HDAC6 jelút fontos szerepet játszik a cilium diszgregációjában és a tumor inváziójában. Az állat- és sejttenyésztési kísérletek eredményei azt mutatták, hogy a szignál tengely közvetíti a Prdx1 szerepét a cilium diszgregáció és az ESCC előfordulásának és progressziójának elősegítésében. További molekuláris mechanizmusok lehetnek, amelyek révén a Prdx1 befolyásolhatja az ESCC előfordulását és progresszióját. Ezenkívül a Prdx1 NEDD9-Aurora A-HDAC6 szignál tengelyére gyakorolt megfigyelt hatásainak alkalmazhatósága más daganatok vonatkozásában jövőbeli tanulmányokat igényel.

Következtetés

Eredményeink arra utalnak, hogy a Prdx1 egy új szabályozó az elsődleges csillóképződésre az ESCC sejtekben.

Az adatok és anyagok rendelkezésre állása

A tanulmány során előállított vagy elemzett összes adatot tartalmazza ez a publikált cikk [és kiegészítő információs fájljai].