A prenatális alacsony fehérjetartalmú és karbenoxolon-expozíció nemspecifikus hatásai a vese angiotenzin-receptor expressziójára patkányokban

Absztrakt

A környezeti és életmódbeli tényezők sokasága kölcsönhatásba lép az uralkodó genotípussal, hogy meghatározza az egyén hipertónia kialakulásának kockázatát. 1 Az elmúlt évtizedben azonban nyilvánvalóvá vált, hogy a korai fejlesztés során tapasztalt környezet is jelentős hatást gyakorol. Emberi epidemiológiai vizsgálatok összefüggést mutattak a magzati növekedés paraméterei és a magas vérnyomás, 2, 3 vesebetegség, 4, 5 és a szívkoszorúér-betegség kialakulásának kockázata között. 6, 7 Ezeket a megfigyelési vizsgálatokat számos olyan kísérleti modell alátámasztja, amelyekben a kardiovaszkuláris és a vese rendszer rendkívül érzékenynek bizonyult az anyai táplálkozás viszonylag enyhe elmozdulására. 8 Ezek a kísérleti modellek most hasznos eszközt nyújtanak a pontos mechanizmusok vizsgálatához.

A renin-angiotenzin rendszer (RAS) megzavarása szerepet játszik a vérnyomás táplálkozási programozásában. Az RAS a vérnyomás elsődleges szabályozója, az érrendszeri tónusra és a folyadék homeosztázisára gyakorolt hatása révén, 9 és kritikus a normális vesefejlődés szempontjából is. Ennek a rendszernek a zavara tehát a felnőttek vérnyomás-szabályozását közvetlenül, a RAS aktivitásának hosszú távú megváltoztatásával, és közvetett módon, a vesefejlődés és az azt követő funkciók zavarásával is modulálhatja. Anyák alacsony fehérjetartalmú étrendjének (MLP) táplálása patkányoknál a terhesség alatt elnyomja a magzati intrarenalis RAS 12 aktivitását, és összefüggésben van a csökkent 13 nefron-komplementtel és az utódok gyorsított előrehaladásával a glomerulosclerosis 14 felé. Ezzel szemben a RAS-t a posztnatális életben az MLP utódaiban szabályozzák, 15 beleértve az 1-es típusú angiotenzin-receptor (AT1R) mind a szabályozását, amely közvetíti az Ang II, 16, 17-re adott klasszikus nyomóválaszokat, valamint a 2-es típusú ellenszabályozó receptor alacsony szintű szabályozását ( AT2R). 18 - 20 Ezeknek a változásoknak megfelelően fokozott angiotenzin II (Ang II) érzékenységet figyeltek meg MLP utódoknál 4 és 7 hetes korban. 18, 19

Mód

Állatok

Az összes állati eljárást az 1986-os Animals (Scientific Procedures) törvénynek megfelelően hajtottuk végre. Harminchárom szűz nőstény Wistar patkányt (Harlan Ltd, Leicestershire, Egyesült Királyság) pároztunk 250 és 300 g közötti tömegben. A párzást megerősítve a patkányokat a három kezelési csoport egyikébe osztottuk: kontroll (n = 11), alacsony fehérjetartalmú (MLP, n = 10) és karbenoxolon (CBX, n = 12). A kontroll patkányokat 18% fehérjét (180 g kazein/kg) tartalmazó étrenddel etették, az MLP patkányokat pedig 9% fehérjét (90 g kazein/kg) tartalmazó étrendet etették. A diéták teljes összetételét máshol teszik közzé. 28 CBX patkányt is tápláltunk a kontroll étrenddel, de az SC-be CBX-t (12,5 mg/kg) injektáltunk a terhesség utolsó 7 napján. A CBX gátolja a 11β-HSD-t, növelve a glükokortikoidok átjutását a placentán. A CBX-et olyan dózisban adták be, amelyről kiderült, hogy nincs káros hatása a reproduktív eredményre. 29 Kontroll és MLP patkányoknak ugyanabban az időszakban injekciós hordozót (sóoldatot) injektáltunk.

Születéskor (~ 22 nap) az összes állatot standard laboratóriumi étrendbe helyezték (B&K Universal Ltd), és az almokat legfeljebb 8 kölyökre selejtezték a szoptató táplálék variációinak minimalizálása érdekében. 2 és 4 hetes kor között a 3 kezelési csoportot további részekre osztották fel, az egyes prenatális kezelések aljainak felét az ivóvízen keresztül L158-809-nek adták, amely egy specifikus AT1R-gátló (amelyet Merck Sharpe és Dohme adományozott). Az L158-809-et alacsonyabb dózisban (25 mg/ml) adták be, mint az elődjével, a lozartánnal (100 mg/l 30) korábban használták, a farmakológiai vizsgálatok magasabb bizonyítékai miatt. 31 Az összes almot 3 hetes korban választották el. Négy hetes korukban minden alom felét (2 hím és 2 nő, ahol lehetséges) CO2-asfixia, majd méhnyak-diszlokáció ölte meg, és veséiket kivágták. A jobb vesét az RT-PCR előtt –80 ° C-on történő tárolás előtt folyékony N2-ben lefagyasztottuk, a bal vesét pufferelt formalinban rögzítettük a nephronszámlálás előtt. Az állatok maradékát egynemű csoportokban helyeztük el, és 20 hetesen, ugyanazokkal az eljárásokkal leöltük őket.

Nephron-szám

A nefronszámot macerációs módszerrel határoztuk meg, az előzőekben leírtak szerint. Minden vesénél 32 háromszoros alikvot részeket számláltunk. A variációs együttható 2,6%.

Angiotenzin-receptor mRNS-expresszió

A teljes RNS-t izolált fagyasztott vesékből izoláltuk TRIzol eljárással (Invitrogen). Az RNS-t DNázzal (Promega) kezeltük, majd fenol-kloroform extrakciónak és etanolos kicsapásnak vetettük alá. Az összes RNS-t (0,5 μg) reverz átírással írtuk le Moloney egér leukémia vírus reverz transzkriptáz (Promega) alkalmazásával. A valós idejű PCR-t egy ABI prism 7700 szekvencia detektáló rendszer (Applied Biosystems) alkalmazásával hajtottuk végre. Az AT1AR-ra, az AT1BR-re, az AT2R-re és a háztartási gén-β-aktinra specifikus sablon-specifikus primerpárt és egy oligonukleotid-szondát (σ-Genosys) terveztünk a Primer Express 1.5-ös verziójával (Applied Biosystems). A láncindítók és a próbák teljes szekvenciáit máshol publikálják. 20 Minden PCR-futtatáshoz negatív templátkontrollt, relatív standard görbét (összesített minta DNS-ből készítettünk) és minőségellenőrzést adtunk. Az összes mintát β-aktin expresszióra normalizáltuk.

Statisztikai analízis

ASZTAL 1

Az anya súlya párzáskor, az anya súlygyarapodása terhesség alatt, az alom száma, valamint a teljes és az átlagos születési súly a kontroll, az MLP és a CBX kezelési csoportokban

ParameterControl (n = 11) MLP (n = 10) CBX (n = 12)

Anya súlya párzáskor (g)	261,8 ± 8,76	273,7 ± 7,5	267,4 ± 9,5
Anya súlygyarapodása (g)	168,6 ± 6,5	154,0 ± 10,4	158,0 ± 5,1
Teljes születési súly (g)	79,7 ± 4,7	73,6 ± 5,1	78,6 ± 2,7
Átlagos születési súly (g)	5,85 ± 0,20	5,77 ± 0,16	5,43 ± 0,13
Sz. Alom.	13,7 ± 1,3	12,9 ± 1,0	14,5 ± 0,5

Az anya párzási súlya és a terhesség alatti súlygyarapodás nem különbözött a prenatális kezelési csoportok között. Az alom méretét, a teljes alom súlyát és az átlagos születési súlyt szintén nem befolyásolta a prenatális kezelés.

Test és vese súlya (2. táblázat)

2. TÁBLÁZAT

Testtömeg és vese súlya 4 és 20 hetes patkányokban a kontroll, MLP vagy CBX csoportokból L158-809 kezeléssel vagy anélkül a korai posztnatális életben

MLP CBX P érték ellenőrzése ParameterSexWaterL158-809WaterL158-809WaterL158-809PrenatalPostnatalSexPre * bejegyzés

4 hét	n = 48	n = 46	n = 47	n = 47	n = 40	n = 47
Testtömeg (g)	M	103,5 ± 2,3	100,4 ± 4,4	95,4 ± 2,7	90,7 ± 2,4	108,6 ± 3,1	81,9 ± 2,3	0,000	0,000	0,000	0,000
F	94,5 ± 1,4	92,9 ± 3,3	91,0 ± 5,2	90,7 ± 2,4	97,6 ± 2,8	74,1 ± 1,7
Vese súlya (g)	M	0,60 ± 0,02	0,56 ± 0,03	0,57 ± 0,03	0,49 ± 0,02	0,68 ± 0,02	0,48 ± 0,03	NS	0,000	NS	NS
F	0,56 ± 0,02	0,52 ± 0,02	0,52 ± 0,02	0,48 ± 0,02	0,60 ± 0,03	0,43 ± 0,03
20 hét	n = 23	n = 23	n = 23	n = 23	n = 20	n = 22
Testtömeg (g)	M	587,9 ± 20,4	527,5 ± 28,4	542,3 ± 12,8	540,3 ± 18,0	561,3 ± 14,8	527,5 ± 17,4	NS	0,006	0,000	NS
F	310,5 ± 6,4	295,3 ± 5,9	289,6 ± 3,8	299,0 ± 7,0	320,8 ± 11,2	284,6 ± 7,9
Vese súlya (g)	M	2,07 ± 0,10	2,06 ± 0,06	1,91 ± 0,03	1,97 ± 0,09	2,02 ± 0,05	2,10 ± 0,09	NS	0,020	0,000	NS
F	1,16 ± 0,03	1,126 ± 0,02	1,07 ± 0,02	1,16 ± 0,03	1,18 ± 0,05	1,10 ± 0,04

Korábban nem mutattunk változást az AT1AR vagy az AT1BR mRNS expressziójában 4 hetes MLP utódokban annak ellenére, hogy mások a fehérje expressziójának upregulációját mutatták, 17, 19 kezdetben csak a transzkripció utáni szinten sugallja az interferenciát. Azonban a vese-minták előzetes fehérje-elemzése az MLP-modellünkből azt mutatja, hogy a fehérje expresszió sem növekszik (N. Ashton, S. McMullen és S. C. Langley-Evans, publikálatlan megfigyelések, 2004). A jelenlegi tanulmány az alacsony fehérjetartalmú étrend általános csökkentő hatását mutatja az AT1AR mRNS expressziójára a 2 időpontban. Ez a tanulmány az előzőnknél nagyobb számú állatot használt fel az eredmények 2 postnatalis időpontban történő értékelésére, és ezért nagyobb erővel volt képes meghatározni azokat a fő hatásokat, amelyek nem voltak kölcsönhatásban az életkorral. Ez valószínűleg megmagyarázza, miért nem bizonyult szignifikánsnak az AT1AR mRNS expressziójának kicsi csökkenése a 4 hetes utódokra korlátozódó vizsgálatokban. Ennek és az eddigi 18, 20 vizsgálatainknak az AT1AR utregulációjának hiánya az MLP utódaiban hosszú távon nem támasztja alá ezt a mechanizmust, mint hipertóniájuk kiváltó okát.

Perspektívák

Köszönetnyilvánítás

Ezt a tanulmányt a British Heart Foundation és az Európai Unió EARNEST projektje finanszírozta. A szerzők elismerik Richard Plant technikai segítségét.