A rezisztin 5 ′ oldalsó változatai társulnak az elhízással

Absztrakt

Régóta ismert, hogy a cukorbetegség és az elhízás összefügg. A közelmúltban jellemzett adipocita hormon rezisztint (más néven FIZZ3/ADSF) molekuláris kapcsolattartásnak tekintik a csökkent glükóz tolerancia (IGT) és az egerek elhízása között. A szekvenciaváltozatok keresése a humán rezisztin lokuszon kilenc egy nukleotid polimorfizmust (SNP) azonosított, de nem kódoló variánsokat. Ezen SNP-k cukorbetegséggel és elhízással való összefüggésének vizsgálata két, a BMI-vel összefüggő, erős kötés-egyensúlyhiányban lévő 5 ′ -es mellékváltozatot (g.-537 és g.-420) tárt fel. A nem cukorbeteg egyéneknél, akik Quebec városából és Quebec Saguenay-Lac-St-Jean régiójából származnak, a g.-537 mutáció (allélfrekvencia = 0,04) szignifikánsan társult a BMI növekedésével (P = 0,03 és P = 0,01, illetőleg). Amikor e két populáció adatait összevontuk, és életkoruk és nemük szerint kiigazítottuk, mind a g.-537 (esélyhányados [OR] 2.72, 95% CI 1.28–5.81), mind a g.-420 variáns (1.58, 1.06–2.35) ) ≥30 kg/m 2 BMI megnövekedett kockázatával jártak. Ezzel szemben Skandináviából származó eset/kontroll és családalapú vizsgálati populációkban e promóterváltozatok egyikével sem láttunk hatást a BMI-re. A cukorbetegséggel összefüggést egyetlen populációs mintában sem tapasztaltak.

A 2-es típusú cukorbetegek körülbelül 80% -a túlsúlyos vagy elhízott. Úgy gondolják, hogy az elhízás növekvő aránya (1,2) közvetlenül befolyásolja a 2-es típusú cukorbetegség növekvő előfordulását Észak-Amerikában (3). A közelmúltban feltételezték, hogy a rezisztin hormon (belépési szám: NM_020415) szerepet játszik e két komplex tulajdonság kapcsolatában (4). A rezisztin a szekretált peptidek családjába tartozik (5,6), amelyeknek közös a ciszteinben gazdag COOH-vége, és diszulfidhoz kapcsolt homodimerek képződnek (7). A rezisztint az egérben differenciált adipociták szűrésével azonosítottuk a rosiglitazon, a tiazolidindionok (TZD) néven ismert, inzulin-szenzibilizáló gyógyszerek csoportjába tartozó antidiabetikus gyógyszer által elnyomott gének ellen, amelyekről azt gondolják, hogy a peroxiszóma-proliferátor-aktivált receptorokat (PPAR) célozzák meg - γ (rev. 8-ban). Az egér rezisztinje kizárólag adipocitákban expresszálódik (4,9), és gátolja azok differenciálódását a tenyészetben (9). A magas szénhidráttartalmú étkezés után (9), valamint a genetikailag és az étrend által kiváltott elhízásban (4) a keringő ellenállás szintje megnő. A magas zsírtartalmú étrendet fogyasztó egerekben az anti-rezisztin antitestek javítják a vércukorszintet és az inzulin hatást (4). Az emberi rezin csak alacsony szinten expresszálódik a zsírszövetben (10, 11), és hozzájárulása ezekhez a betegségekhez nem világos.

Mivel nem találtunk kódoló variánsokat, és a promóter variánsok valószínűleg fontos szerepet játszanak a komplex tulajdonságokban, úgy döntöttünk, hogy először tanulmányozzuk a promóter SNP-ket a cukorbetegséggel vagy a BMI-vel való esetleges kapcsolatról. Társulási vizsgálatot indítottak a két gyakoribb 5 ′ -es SNP (g.-537A> C és g.-420C> G) megvizsgálására egy 2-es típusú diabéteszes esetben/kontrollmintában a Saguenay-Lac-St-Jean-tól (SLSJ ) Quebec régiója és a Quebec City (QC) területéről származó férfiak populációs mintája. E két változat genotípus-eloszlása sem a QC, sem az SLSJ eset/kontroll mintában nem különbözött szignifikánsan a Hardy-Weinberg egyensúlytól. Ezen túlmenően az allélfrekvenciák ebben a két vizsgálati mintában nem különböztek szignifikánsan. A g.-537A> C és g.-420C> G polimorfizmusok 2-es típusú cukorbetegséggel való összefüggésének értékeléséhez összehasonlítottuk e változatok allélfrekvenciáit az SLSJ területéről toborzott diabéteszes és nem cukorbeteg alanyok eset/kontroll vizsgálati mintájában. Amint az 1. táblázat mutatja, az allélfrekvenciákban nem figyeltek meg különbséget a 2-es típusú diabéteszes és nem diabéteszes szubsztektumok között. Az életkort és a nemet magában foglaló logisztikai regressziós modellben sem a g-537A> C polimorfizmus, sem a g-420C> G polimorfizmus nem járultak hozzá jelentősen a cukorbetegséghez (az adatokat nem közöltük).

A QC mintában a BMI növekedése (30,4 vs. 29,2 kg/m 2, P = 0,03) a g.-420 G allél jelenlétével társult a C/C genotípussal összehasonlítva (2A. Ábra). Hasonlóképpen összefüggést találtunk a g.-537 C allél jelenlétével a BMI A/A genotípusához képest (31,8 vs. 29,7 kg/m 2), amely szintén szignifikáns volt (P = 0,03) (2B ábra ), ennek az allélnek az alacsony gyakorisága (3,9%) ellenére. Ezenkívül számos elhízási mutató társult szignifikánsan a G-allélhez g.-420-nál: súly (92,8 vs. 87,9 kg, P = 0,006), testzsír-tömeg (27,8 vs. 25,4 kg, P = 0,03) és derék kerülete (102,9 vs. 100,0 cm, P = 0,04) (2. táblázat). Mindezeket a paramétereket befolyásolta a C-allél a g.-537. Pozícióban. Minden különbség statisztikailag szignifikáns maradt az életkor szerinti kiigazítás után (az adatokat nem mutatjuk be).

Logisztikai regressziós elemzések segítségével kiszámítottuk az esélyhányadokat (OR) a> 30 kg/m 2 BMI-re. Szoros egyetértés volt az OR között a QC és az SLSJ vizsgálati minták között, amikor csak nem cukorbeteg egyedeket vizsgáltak. Mindkét csoportban az OR> 1,5 volt a g.-420G variánsnál és> 2,7 a g.-537C variánsnál (3. táblázat). Végül minden nem cukorbeteg alany együttvéve a G-allél OR-jai g.-420C> G-n és a C-allél g.-537A> C-on 1,58 (CI 1,06–2,35, P = 0,025) és 2,72 (1,28–5,81, P = 0,01), amikor az életkor és a nem szerepel a modellben (3. táblázat).

A g.-420 G és a g.-537 C allélek szignifikáns LD-ben vannak egymással. Az eddig vizsgált 590 quebeci egyénnél a g.-537. Pozícióban lévő C allél csak azokban az egyénekben van jelen, akik a g.-420. Pozícióban hordozzák a G allélt. Megfigyeltük, hogy azoknak a nem cukorbetegeknek az átlagos BMI-je, akik a g.-537 pozícióban rendelkeznek C alléllel (és így mindkét variánssal rendelkeznek) magasabbak voltak, mint azok, akiknek csak a G allél volt a g.-420 pozícióban (P = 0,006).

Lehetséges, hogy ezen 5 ′ polimorfizmusok bármelyike megváltoztathatja a rezisztin mRNS szintjét befolyásoló transzkripciós faktor kötőhelyet. A g-420 és g.-537 pozíciókban a potenciális kötőhelyek keresése a MatInspector V2.2 (18) segítségével számos transzkripciós faktor motívumot tárt fel, amelyeket ezek a variáns allélek megváltoztattak (pl. Egy AP1 helyet elpusztított g.-537A> C ). Bár a rezisztin transzkripcióját szabályozó pontos mechanizmusok még tisztázatlanok maradnak, az egyik jelentés a p-adrenerg receptorokat és a protein-kináz A-t csökkent rezisztin expresszióban vonta maga után (19).

Megpróbáltuk megismételni a megállapításokat a skandináv vizsgálati populációkban. Nem volt szignifikáns összefüggés a két rezisztin-promóter variáns és az elhízás között ezekben a korábban leírt (12) vizsgálati populációkban, amelyek magukban foglalták a cukorbetegség esetét/kontrollmintát (1. táblázat), a diabéteszes triókat és a normál glükóztoleráns triókat (QTDT, az adatok nem láthatók ). A g.-537 esetében ennek oka lehet, hogy a ritka allél gyakorisága 0,02 volt a skandináv eset/kontrollmintában, lényegesen alacsonyabb, mint a Quebec-ben megfigyelt 0,04 (P = 0,005, Fisher pontos tesztje) (1. táblázat) . Három másik alternatíva magyarázhatja a promoter variánsok replikációjának hiányát: 1) a kölcsönhatásban lévő lokuszok vagy környezeti feltételek különböznek e két populáció között, és befolyásolják a variánsok fenotípusos expresszióját; 2) a quebeci rezisztin polimorfizmusok LD-ben vannak, és ennek vagy egy másik génnek egy másik funkcionális változata van, míg a skandináv minta kapcsolódási egyensúlyban lehet ezzel a másik mutációval; vagy 3) a quebeci populációkban talált eredmények hamisak.

Jelenleg nagyon keveset tudunk az emberekben alkalmazott rezisztin funkcióiról, és az emberi zsírszövetben az expresszió szintje továbbra is ellentmondásos (10,11,20,21). Savage és mtsai. (11) gyakrabban mutatott rezisztint a kóros elhízottak zsírjában, mint normál kontroll alanyoknál, és McTernan és mtsai. (20) a hasi zsírban a rezisztin növekedését állapította meg a combhoz képest. Eredményeink azt mutatják, hogy a quebeci francia kanadaiak körében megnő a magasabb BMI kockázata a két rezisztin promoter polimorfizmus hordozóinak esetében. Érdekes módon a megfigyelt hatás nem cukorbetegeknél tűnik a legerősebbnek. Nem cukorbetegeknél az rezisztin szintjének változása hozzájárulhat az elhízáshoz, valószínűleg a szabályozatlan transzkripció eredményeként, amelynek más fiziológiai következményei vannak a cukorbetegeknél. Alternatív megoldásként a cukorbetegeknél az ellenállás bazális vagy aktivált transzkripciója eltérő lehet. Az ilyen változatokkal rendelkező egyének rezisztinszintjének mérése hozzájárulhat az rezisztin promoter jellemzéséhez. Az ezekben a populációkban előforduló rezisztinvariánsok által okozott fokozott elhízási kockázat további vizsgálatokat indokol nagyobb populációmintákban.

KUTATÁSI TERVEZÉS ÉS MÓDSZEREK

Népességminták.

A cukorbetegség esetét/kontrollmintáját (n = 359, átlagéletkor 52,0 év) máshol írják le (15). Röviden: a vizsgálati populáció újonnan diagnosztizált, 2-es típusú cukorbetegekből (az Egészségügyi Világszervezet 1998-as kritériumai) (22) állt az SLSJ-ből, valamint az életkorhoz és nemhez illeszkedő kontroll alanyokból (normál glükóz toleráns). Néhány személyt beiktattak egy családon alapuló vizsgálatba is, amelyen 79 család vett részt (424 egyén). Korábban leírták a Q1 mintát, amely 231 férfiból állt (átlagéletkor 42,4 év) és az adipozitás széles skálájára lett kiválasztva (16). Röviden: ezek az alanyok mozgásszegények, nem dohányzóak voltak, és mentesek a kezelést igénylő anyagcserezavaroktól, mint például a cukorbetegség vagy a magas vérnyomás. A skandináv eset/kontroll minta (n = 968, átlagéletkor 60,5 év) és a családalapú vizsgálati populációk máshol vannak leírva (12). Röviden: az esetek alanyai cukorbetegségben vagy súlyos IGT-ben szenvedtek, és a kontroll alanyokat nem, életkor és földrajzi elhelyezkedés szerint hasonlították össze. A skandináv családalapú vizsgálati populációk olyan triókon alapultak, amelyekben az utódoknak vagy 2-es típusú cukorbetegségük volt (n = 126), IGT (n = 108), csökkent éhomi glükózszint (n = 99) vagy normál glükóztolerancia (n = 379). . A betegek megalapozott beleegyezést adtak, és a kutatási protokollokat a helyi intézményi felülvizsgálati testületek követték nyomon.

Szekvenálás.

Az alapozó hőkezelési hőmérséklete 56–60 ° C volt. A PCR körülmények 50 ng genomiális DNS, 1,25 egység Qiagen HotStart Taq (Qiagen, Mississauga, Ontario, Kanada) (1,5 mmol/l MgCl2,), 0,2 mmol/l dNTP és 0,4 μmol/l primerek voltak 50 μl reakcióban. A PCR termékeket megtisztítottuk (Mulitiscreen; Millipore, Bedford, MA), és a szekvenálást BigDye Terminator (2.0 verzió) alkalmazásával hajtottuk végre, és ABI 3700 szekvenszeren (Applied BioSystems, Foster City, CA) elemeztük. Az adatokat a Sequencing Analysis szoftverrel (3.6 verzió) dolgoztuk fel, majd összehangoltuk az Autoassembler 2.1-vel (Applied BioSystems). Az összes exont, az exon-intron splicing határait és az rezisztin promóterét átvilágítottuk (lásd az alábbiakban a primereket) két Center d'Etude du Polymorphisme Humain (CEPH) és 45 SLSJ és QC egyének elhízásból és nem obeszából álló szekvenálásával betegek (nem cukorbeteg vagy 2-es típusú cukorbetegek). A PCR-termékek a kívánt hosszúságot mutatták, összhangban a deléciók, duplikációk vagy átrendeződések hiányával.

Rezisztinszekvenáló primerek.

A primerek a következők voltak: F promoter: tgtcattctcacccagagaca; R promoter: tgggctcagctaaccaaatc; 1–2F exon: gggacttattagccaagcca; exon 1–2R: tgggttggagtcaggtctgt. 2F intron: gagaggatccaggaggtcg; 2R intron: aggtgacgctctggcact. Exon 3F: acagggctaggggaggatg; 3R exon: agtagaggctggacacggg. Exon 4F: cctcagcctcccagctca; 4R exon: agacgctagatcagtccctcc.

statisztikai módszerek.

Az allél gyakoriság és a genotípus eloszlás összehasonlítását Raymond és Rousset algoritmusaival értékeltük (23). Hardy-Weinberg elemzéseket Weir algoritmusa (24) alapján hajtottunk végre, a P.O. Genetic Data Analysis (GDA) 1.0-s verzióját (d12) felhasználva. Lewis és D. Zaykin, elérhető a http://lewis.eeb.uconn.edu/lewishome/gda.html címen.

Az elemzések előtt a BMI, a súly, a testzsírtömeg, a derék kerület és a hasi zsírszövet (számítógépes tomográfiából származó) eloszlásait ferdeségre és kurtosisra teszteltük, és az összes változó egy, illetve négy alatt volt. Az átlagos antropometriai értékeket összehasonlítottuk a genotípus osztályok között Student's t teszt segítségével. Az ANCOVA-t használták az antropometriai változók életkor szerinti kiigazítására. A logisztikus regressziós elemzéseket a függő változón, az elhízáson végeztük, elhízás esetén a BMI ≥ 30 kg/m 2, míg a nem elhízott személyeknél a BMI 2. Az OR-kat korhoz és nemhez igazították. A statisztikai elemzéseket a SAS statisztikai csomaggal (SAS Institute, Cary, NC) végeztük. Az összes bemutatott P érték nominális, mivel a többszörös teszteléshez nem történt korrekció. A QTDT-kat a QTDT szoftver 2.2.1 verziójával (elérhető a http://www.well.ox.ac.uk/asthma/QTDT címen) ortogonális asszociációs modell alkalmazásával (25) végeztük.

SNP-k rezisztinben. Az emberi rezisztin (FIZZ3) gén lokuszának és az exon szerkezetének sematikus ábrázolása és nyolc SNP elhelyezkedése. Az összes vizsgált Quebec-mintából származtatott kisebb allélfrekvenciák zárójelben vannak (az összes SNP-nél> 300 minta alapján, kivéve az IVS3 + 30-at, amely 45 mintán alapul). Az SNP számozása a GenBank sz. AF205952.

Átlagos BMI genotípus szerint g.-420 (A) és g.-537 (B) esetében. V: •, CC genotípus; ○, CG és GG genotípusok együtt. B: •, AA genotípus; ○, AC és CC genotípusok együtt. Hibasávok = az átlag SE-je. A Student t tesztjének P-értékei az egyes összehasonlítások felett láthatók. DBT, cukorbeteg; az összes nem DBT, az összes nem cukorbeteg SLSJ alany a QC mintákkal kombinálva.

Az 5 ′ -es SNN-ek genotípus-frekvenciái az ellenállás lokuszán

Az alanyok jellemzői genotípus szerint a nem cukorbeteg férfiak QC mintájában

Logisztikus regresszió-analízis a BMI-nél> 30 kg/m 2 az 5'-es SNP-knél az ellenállás lokuszánál

Köszönetnyilvánítás

Ezt a tanulmányt részben a Bristol-Myers Squibb, a Millennium Pharmaceuticals és az Affymetrix kutatási szerződése finanszírozta. A skandináv tanulmányt a Sigrid Jueslius Alapítvány támogatásával támogatták. J.C.E. a Nemzeti Egészségügyi Intézetek (NIH) posztdoktori ösztöndíját kapja. M.-C.V. a Fonds pour la Formation des Chercheurs et l’Aide à la Recherche kutató tudósa. S.M.W. fizetési támogatást kapott az NIH-tól. JC.L.-O. támogatta a Montreali Általános Kórház Kutatóintézet/Informatikai és komplex rendszerek matematikája (Kiválósági Központok Hálózata) posztdoktori kutatási ösztöndíj. J.N.H. a Howard Hughes Orvostudományi Orvosok Posztdoktori Ösztöndíjának és a Burroughs Wellcome Karrier Díjnak az Orvosbiológiai Tudományokban részesült. J.P.D. az emberi táplálkozás, lipidológia és a szív- és érrendszeri betegségek megelőzésének professzora, a Provigo és a Pfizer Canada támogatásával. D.G. a prevenciós genetika és a közösségi genomika kutatócsoportjának elnöke. T.J.H. egy kanadai Egészségügyi Kutatóintézet klinikus tudós díjazottja.

Köszönetet mondunk azoknak a személyeknek, akik önként jelentkeztek a vizsgálatokba Quebecben és Skandináviában, valamint a Montreali Genomközpont, a QC Lipid Kutatóközpont és a Chicoutimi Kórház lipidkutató csoportjának munkatársainak. Köszönetet mondunk L. Coderre, R. Sladek, T. Pastinen, C. Greenwood, M. Fujiwara, N. Roslin, K. Morgan, E. Lander és L. Pérusse számára is a hasznos beszélgetésekért.

Lábjegyzetek

Címzett levelezés és újranyomtatási kérelem Dr. Thomas J. Hudsonhoz vagy Dr. James C. Engerthez, Montreali Genomközpont, MGHRI/MUHC, Montréal, Québec, Kanada H3G 1A4. E-mail: tom.hudsonmcgill.ca vagy jamie.engertstaff.mcgill.ca .

2001. november 12-én kapták közzétételre és 2002. január 22-én módosított formában elfogadták.

D.A. tagja a cukorbetegség kezelésére használt gyógyszereket forgalmazó Merck Research Labs klinikai genomikai tanácsadó testületének. Tagja a cukorbetegség kutatását végző Genomics Collaborative tudományos tanácsadó testületének is. Egyik vállalat sem vett részt a tanulmányban leírt kutatásban. T.J.H. támogatási/kutatási támogatást kapott a Bristol-Myers Squibb-től, a Millennium Pharmaceuticals-tól és az Affymetrix-től. A támogatási támogatás egy részét a kutatás finanszírozására fordították.

* J.C.E., M.-C.V. és S.M.W. hozzájárult ehhez a tanulmányhoz.

J.C.E., M.-C.V. és S.M.W. hozzájárult ehhez a tanulmányhoz.

IGT, csökkent glükóz tolerancia; LD, a kötés egyensúlyhiánya; VAGY, esélyhányados; PPAR, peroxiszóma-proliferátor-aktivált receptor; QC, Quebec City; QTDT, kvantitatív transzmissziós egyensúlyhiányteszt; SLSJ, Saguenay-Lac-St-Jean; SNP, egy nukleotid polimorfizmus; TZD, tiazolidindion.