A Rosa gallica szirom kivonatok extrakciós feltételei bőröregedésgátló hatással

Eun Ju Shin

1 Hagyományos Élelmiszer-kutató Központ, Koreai Élelmiszer-kutató Intézet, Wanju-gun, Jeollabuk-do 55365 Koreai Köztársaság

Ah-ram Han

1 Hagyományos Élelmiszer-kutató Központ, Koreai Élelmiszer-kutató Intézet, Wanju-gun, Jeollabuk-do 55365 Koreai Köztársaság

Myung-hee Lee

1 Hagyományos Élelmiszer-kutató Központ, Koreai Élelmiszer-kutató Intézet, Wanju-gun, Jeollabuk-do 55365 Koreai Köztársaság

Young-Ran Song

1 Hagyományos Élelmiszer-kutató Központ, Koreai Élelmiszer-kutató Intézet, Wanju-gun, Jeollabuk-do 55365 Koreai Köztársaság

Kwang Min Lee

1 Hagyományos Élelmiszer-kutató Központ, Koreai Élelmiszer-kutató Intézet, Wanju-gun, Jeollabuk-do 55365 Koreai Köztársaság

Tae-Gyu Nam

1 Hagyományos Élelmiszer-kutató Központ, Koreai Élelmiszer-kutató Intézet, Wanju-gun, Jeollabuk-do 55365 Koreai Köztársaság

Pomjoo Lee

2 RAFIQ Cosmetics Co., Ltd., 14, Toegye-ro 48-gil, Jung-gu, Szöul, Koreai Köztársaság

Sung-Young Lee

3 Mezőgazdasági Biotechnológiai Tanszék, Szöuli Nemzeti Egyetem, Szöul, 08826 Koreai Köztársaság

Tae-Gyu Lim

1 Hagyományos Élelmiszer-kutató Központ, Koreai Élelmiszer-kutató Intézet, Wanju-gun, Jeollabuk-do 55365 Koreai Köztársaság

Absztrakt

A rózsaszirom-kivonatok bőrgyulladásgátló hatását korábbi tanulmányunkban írták le. Mivel a bőrgyulladás szorosan kapcsolódik a bőr öregedéséhez, tanulmányunk a Rosa gallica szirmok hatásait vizsgálták a bőr öregedésével kapcsolatos tevékenységekre, például a bőrfehérítésre és a ránctalanító tulajdonságokra. Mindegyik mintát külön etanolarányú extrakcióval állítottuk elő, az optimális extrakciós körülmények értékelése céljából. Az R. gallica szirom vizes 50% -os (v/v) etanol-kivonata jelentősen elnyomta a tirozináz aktivitást, a melanintermelést és a napfény által UV-indukálta mátrix metalloproteináz-1-et, amely a ráncképződés hall-jele. Ezenkívül a vizes 50% (v/v) EtOH kivonat mutatta a legmagasabb antioxidáns hatást, és a legmagasabb flavonoid tartalommal rendelkezett, összhangban a bejelentett öregedésgátló hatásokkal. Összességében megállapításaink azt sugallják, hogy az R. gallica szirmai kivonatok öregedésgátló hatást mutatnak. Ezenkívül különösen az 50% EtOH extrakció volt optimális a legmagasabb öregedésgátló és antioxidáns hatásokhoz, valamint a legmagasabb flavonoidtartalom eléréséhez.

Bevezetés

A bőr alapvető szerepet játszik az öröklődéssel és a genetikával, a környezeti problémákkal, a hormonális változásokkal és az anyagcsere folyamataival kapcsolatos káros tényezők elleni védőgátként (Mukherjee et al., 2006). Ezek közül a környezeti tényezők, mint például a nap ultraibolya (UV) sugárzás, kulcsfontosságú közvetítőként működnek, amelyek hozzájárulnak az idő előtti öregedéshez (Laga és Murphy, 2009). A fotóöregedés következtében fellépő bőröregedés fő tünetei közé tartoztak a mély ráncok, a rendellenes pigmentáció és a rugalmasság (Farage et al., 2013; Wlaschek et al., 2001).

A pigmentáció az öregedés tünete, amelyet a melanin rendellenes termelődése okoz, és különféle bőrbetegségeket eredményez, beleértve a szeplőket, a melasma-t, az öregségi foltokat és más hiperpigmentációs szindrómákat (D'Mello et al., 2016; Seo et al., 2003). A melanogenezis útjában a tirozináz fontos, mint sebességkorlátozó enzim, amely átalakítja az l-tirozint l-DOPA -vá, és oxidálja az l-DOPA-t, hogy DOPA-kinont alkotjon (Akhtar et al., 2015). Ezért a tirozináz gátlása szorosan összefügg a melanin szintézissel. Ezenkívül a ráncképződés, amelyet a kollagénszálak és az elasztáz elvesztése okoz, a fotózás másik jellemzője. Az emberi bőr fibroblasztja által kiválasztott mátrix metalloproteináz-1 (MMP-1) főként a kollagén lebontásáért felelős a fotóöregedési folyamat során (Pandel et al., 2013). Az MMP-1 expresszió csökkentése, amely gátolja a kollagén lebomlását, fokozhatja a ránctalanító funkciókat.

A fent említett okok miatt a tirozináz inhibitorok vagy az MMP inhibitorok alkalmazása ígéretes stratégiának tekinthető a bőr fotóöregedésének enyhítésére. Korábbi tanulmányok azt mutatták, hogy a retinol, a fokhagymakivonat (koffeinsav és az S-ally-cisztein) és a fitoceramid, a kojinsav, az arbutin és a C-vitamin a bőr öregedésének gátlásaként működhet (Couteau és Coiffard, 2016; Kim és mtsai, 2013). . Ezeknek az anyagoknak azonban bizonyos korlátai vannak, például különféle mellékhatások, beleértve a citotoxicitást, a szagot és a színeződést (Yamakoshi et al., 2003). Ezért a jelenlegi tanulmányok a biztonságosabb, természetes eredetű komponensek fejlesztésére összpontosítanak, amelyek hatékony bőrvédelmet nyújtanak a bőrön.

A világszerte termesztett rosa fajokat az étrend-kiegészítők jó forrásaként tartják számon. A rózsaszirom-kivonatról (RPE), amely olyan elemeket tartalmaz, mint fenolsav, flavonolok és antocianinok, számoltak be, hogy más biológiai szerepek mellett számos jótékony hatást mutatnak, például bőrgyulladás elleni aktivitást (Bitis et al., 2017; Lee és mtsai, 2018; Masek és mtsai, 2017; Navarro-Gonzalez és mtsai, 2015). Mivel az RPE ezen tulajdonságai köztudottan összefüggenek a bőr öregedésével, a bőrvédelem potenciális jelöltjeként javasolták. Az RPE bőröregedésre gyakorolt hatásáról azonban keveset tudni. Ezenkívül a vizet és az etanolt tartják a legjobb extrakciós oldószereknek a polaritási különbségek és a használat biztonsága miatt (Abarca-Vargas et al., 2016). Így különböző víz- és etanolarányú mintákat (0, 10, 30, 50, 70, 90 és 100% etanol RPE) készítettünk extrakcióval.

Ennek a tanulmánynak az volt a célja, hogy megvizsgálja az RPE hatását a bőr fehérítésére és a ráncok javítására. Különböző extrakciós oldószerarányú RPE-kivonatokat (0, 10, 30, 50, 70, 90 és 100% etanol/víz oldószerek) teszteltünk az extrakcióhoz szükséges optimális oldószerarány meghatározásához.

Anyagok és metódusok

Reagens

A Rosa gallica szirmait Törökországból a GN Bio (Gyeonggi, Korea) útján importálták. A Dulbecco által módosított Eagle táptalajt (DMEM), a szarvasmarha magzatának szérumát (FBS), a Penicillin – sztreptomicin – neomicint és a 0,5% tripszin – EDTA-t a GIBCO ® Invitrogen-től (Auckland, NZ, USA) vásároltuk. A tirozináz és a p-aktin elleni specifikus antitesteket a Santa Cruz Biotech-től (Santa Cruz, Kalifornia, USA) szereztük be. Az MMP-1 primer antitestét az R&D systems ™ -ből nyertük. Minden egyéb vegyszert, beleértve az alfa-melanocita stimuláló hormont (α-MSH), a gomba tirozinázt és az l-DOPA-t (l-3,4-dihidroxi-fenil-alanint) a Sigma-Aldrich Co., LLC-től (St. Louis, MO, USA) vásároltuk. ).

A minta előkészítése

A rózsaszirmokat összekevertük 100 ml 0, 10, 30, 50, 70, 90 és 100% (v/v) etanollal (abszolút etanol). Az oldható komponenseket ezután visszafolyató hűtő alkalmazásával 80 ° C-os vízben extraháltuk. Az extraktumot 2-es szűrőpapíron (Whatman, Maidstone, Anglia) átszűrjük, vákuumban bepároljuk, majd desztillált vízben feloldjuk és fagyasztva szárítjuk, hogy mintákat használjunk a funkcionális analízis tesztjéhez.

Sejtkultúra

A B16F10 melanoma sejteket a Koreai Cell Line Banktól (Szöul, Korea) szereztük be. Az emberi dermális fibroblaszt (HDF) sejteket Dr. Jin Ho Chung-tól (Orvosi Főiskola, Szöuli Nemzeti Egyetem, Szöul, Korea) szereztük be. Mindkét sejtet 10% magzati szarvasmarha-szérummal (v/v) és 1% (v/v) penicillinnel kiegészített DMEM-ben tenyésztettük 37 ° C és 5% CO2-körülmények között.

Sejt életképesség

A sejtek életképességét MTS [3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) -5- (3-karboxi-metoxi-fenil) -2- (4-szulfofenil) -2H-tetrazolium] vizsgálattal mértük. A sejteket 96 lyukú lemezekre oltottuk és összefolyásig növeltük. Ezután a sejteket egy éjszakán át szérummentes DMEM-lel éheztettük, és a mintákkal 24 órán keresztül a megadott koncentrációban kezeltük. A mintáknak való kitettség után 20 μL MTS oldatot hagytunk 1 órán át reagálni a sejtekkel. Az abszorbanciát mikrolemez-olvasóval (Sunrise-Basic Tecan, Tecan Austria GmbH Grödig, Ausztria) mértük 570 nm-en.

In vitro gomba tirozináz aktivitás

Az in vitro tirozináz vizsgálatot a korábban leírt módszerekkel hajtottuk végre (Kim és mtsai., 2015). Röviden, mindegyik mintából 40 µl-t adtunk a vizsgálati pufferhez (20 µl 0,1 M kálium-foszfát), majd 30 percig inkubáltuk 20 µl gomba-tirozinázzal (0,02 mg/ml). Ezután mindegyik keverékhez 40 ul szubsztrátot (1 -DOPA) adunk. A reakciót 15 percig szobahőmérsékleten hagytuk folytatni, majd a dopakróm képződését analizáltuk abszorbancia mérésével 475 nm-en mikrotányér-leolvasóval (Infinite® 2000 PRO, Tecan, Svájc).

A melanin termelésének értékelése

A melanintermelési vizsgálatot a korábban leírt protokoll szerint hajtottuk végre (Friedmann és Gilchrest, 1987; Gordon és mtsai, 1989). A B16F10 sejteket (8x103 sejt) 6 lyukú lemezekre oltottuk 2 ml táptalajjal. 24 óra elteltével a mintákat 1 órán át előkezeltük a sejtekkel, majd ezt követően az a-MSH-t (100 nM) tettük ki a sejteknek. A sejteket 72 óra elteltével összegyűjtöttük, és a melanin termelést mikrotányér-leolvasóval (Infinite® 2000 PRO, Tecan, Svájc) mértük 495 nm-en.

Western blot

Proteinmintákat sejtekből nyertünk, 1x sejtlízis puffer (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) alkalmazásával. A fehérjekoncentrációt Pierce ™ BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, San José, CA, USA) segítségével becsültük meg. A fehérjemintákat 10% -os SDS – poliakrilamid gélre (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Kalifornia, USA) töltöttük fel elektroforézis céljából, majd egy Immobilon P membránra (Millipore, Billerica, MA, USA) vittük át. A PVDF membránt 5% zsírmentes tejjel blokkoltuk 1 órán át, és a membránt egy éjszakán át specifikus primer antitesttel kezeltük 4 ° C-on. A fehérjeszalagokat kemilumineszcencia detektáló készlettel (GE Healthcare, NJ, USA) detektáltuk HRP-konjugált másodlagos antitesttel végzett hibridizáció után (Cell Signaling).

DPPH gyökfogó vizsgálat

A DPPH gyökfogó aktivitást az alábbiak szerint mértük; 0,2 ml kivonatot adunk 3 ml etanolhoz, amelyhez 0,8 ml etanolban oldott 400 μM DPPH-t adunk. Ezt az elegyet 10 másodpercig vortexeltük, és 10 percig szobahőmérsékleten tartottuk, és az abszorbanciát 517 nm-en mértük (Wang et al., 1999). A DPPH gyökfogó aktivitást annak a csoportnak az abszorbanciájának százalékában fejeztük ki, amelyhez DPPH-t nem adtunk. Minden kísérletet legalább háromszor megismételtünk.

Összes flavonoid tartalom

Az extraktumok teljes flavonoid tartalmát alumínium-klorid módszerrel (Jia és mtsai, 1999) mértük, amelyet katechin alkalmazásával módosítottunk. Az extraktum 100 μl-jéhez 500 μl desztillált vizet és 30 μl NaNO2-t adunk, majd 6 perc múlva 60 μL AlCl3-at adunk hozzá. 5 perc múlva 200 μl 1 M NaOH-ot adunk hozzá, és desztillált vízzel 1 ml-re töltjük. Az oldatot alaposan összekevertük és 15,928 g-nál 4 ° C-on 5 percig centrifugáltuk. Centrifugálás után 200 μl felülúszót kapunk, és az abszorbanciát mikrolemez-olvasóval (Infinite® 2000 PRO; Tecan, Svájc) mértük 510 nm-en.

Statisztikai analízis

A kísérleteket három példányban hajtottuk végre, és az adatokat átlag ± szórásként (SD) fejezzük ki. A Student t tesztjeit egyetlen statisztikai összehasonlításhoz használtuk. A statisztikai szignifikanciát (#) = p 1 A) értékre állítottuk be. Érdekes módon az egyes kivonatok színe a vizuális megfigyelés alapján változott (1. ábra B). Az EtOH-kivonatok 90% vagy annál magasabb színe tiszta volt, míg az 50% (v/v) EtOH-kivonat a leginkább vörösesnek tűnt. A koloriméter eredménye a * vörösség értékét mutatta ki 50% EtOH-ra, amely a kivonatok közül a legmagasabb szintet mutatta (1. ábra C).

A Rosa gallica szirmainak kivonása. A Rosa gallica szirmokból származó EtOH-kivonatok minta-előkészítése (A). A Rosa gallica szirmai különféle EtOH-kivonatainak képei (B). A színkülönbségmérő a * értékének mérése (C). Az adatok 3 független kísérletet jelentenek, amelyek hasonló eredményeket adtak. A (**) előjel szignifikáns értéket jelöl (p 2 A). Ezenkívül a 30% és 50% EtOH kivonatok erősebb gátló hatást mutattak, mint az aszkorbinsav. Az aszkorbinsavat bőrfehérítő szerként írták le a korábbi szakirodalomban (Chang, 2009). Az extraktumok bőrfehérítő aktivitásának sejtmodellben történő értékeléséhez az egyes kivonatokkal történő kezelést követően a melanintermelést B16F10 melanoma sejtekben értékeltük. Az a-MSH 100 nM-os része növelte a melanintermelést, és a rózsaszirom minden kivonata gátolta a melanintermelést (2. B ábra). Ezen túlmenően a 30% -os és az 50% -os EtOH-kivonatok mutatták a legerősebb gátló hatást a tirozináz aktivitásra és a melanin termelésére in vitro. Hasonló körülmények között megvizsgáltuk az egyes kivonatok tirozináz expresszióra gyakorolt hatását. Az α-MSH emelte a tirozináz expressziót, és mindegyik kivonat 100 μg/ml gyengítette a tirozináz expressziót (2. C ábra). A 100 μg/ml-es kivonatokkal végzett kezelés nem okozott sejtcitotoxicitást a B16F10 melanoma sejtekben (2. ábra D). Így a melanin RPE általi gátlása a tirozináz aktivitás kettős fukciójának és a citotoxicitás hiányának az expressziójának tulajdonítható.

A rózsaszirom 50% -os EtOH-oldószerének sötétvörös színét feltételezzük, hogy rokon az antocianinnal, egy flavonoiddal (1. ábra). Ez az eredmény igazolja egy korábbi tanulmány megállapításait (Oancea és mtsai, 2012). Az előző vizsgálat szerint az áfonyában (Vaccinium orymbosum L.) lévő antocianinokat 50% EtOH oldószerben extrahálták a legjobban, mint bármely más oldószerben, beleértve 60%, 70% és 80% EtOH-t (Oancea et al., 2012). Természetesen az antocianinok glikozidként fordulnak elő. Így feltételeztük, hogy az antocianinok polaritását az 50% -os EtOH oldószer biztosíthatja. Az antocianinok erős antioxidáns aktivitása jól kimutatható különböző modellrendszerekben (Kalt et al., 2003; Rice-Evans et al., 1995). Mivel az 50% EtOH rózsaszirom kivonatban volt a legmagasabb az antocianin tartalom, az 50% EtOH kivonat antioxidáns aktivitása volt a legerősebb az 50 μg/ml kivonatok között.

Összefoglalva, tanulmányunk kimutatta az RPE mint a bőr öregedése elleni összetevő potenciálját. Az ipari alkalmazás szempontjából a kitermelési feltételek optimalizálása elengedhetetlen a termelési költségek csökkentése érdekében. A mostani tanulmány a rózsaszirom kivonására legalkalmasabb oldószereket vizsgálta, a bőr öregedésgátló hatására hivatkozva. A rózsasziromban található flavonoidokat a legjobban 50% -os EtOH oldószerrel extraháltuk. Ez a kivonat mutatta a legerősebb antioxidáns aktivitást, valamint a bőr öregedését gátló aktivitást, például a bőr fehérítését és a ránctalanítást. Klinikai vizsgálatokra és stabilitási elemzésekre lehet szükség az ipari alkalmazásra való alkalmasság teszteléséhez.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a kutatást a Koreai Kutatási Élelmiszer Intézet (KFRI) kutatási főprogramja (E0183112-02) támogatta, amelyet a Tudomány, az IKT és a jövőtervezés minisztériuma finanszírozott, valamint a Koreai Élelmiszeripari, Mezőgazdasági, Erdészeti és Erdészeti Technológiai Tervezési és Értékelési Intézet. Halászat (IPET) a magas hozzáadott értéket képviselő élelmiszer-technológiai fejlesztési program révén, amelyet a Mezőgazdasági, Élelmezési és Vidékügyi Minisztérium (MAFRA) finanszíroz (118060-03-2-HD020).

Az etikai normák betartása

A szerzők között nincs összeférhetetlenség.

Lábjegyzetek

Kiadói megjegyzés

A Springer Nature semleges marad a közzétett térképeken és az intézményi kapcsolatokban szereplő joghatósági igények tekintetében.