A Siah2 fehérje közvetíti a korai eseményeket egy adipogén út elérése mellett *

Gail Kilroy

A Penningtoni Orvostudományi Kutatóközpontból, Louisiana State University System, Baton Rouge, Louisiana 70808

David H. Burk

A Penningtoni Orvostudományi Kutatóközpontból, Louisiana State University System, Baton Rouge, Louisiana 70808

Z. Elizabeth Floyd

A Penningtoni Orvostudományi Kutatóközpontból, Louisiana State University System, Baton Rouge, Louisiana 70808

Absztrakt

Bevezetés

A túlzott kalóriabevitelre adott válaszként a zsírszövet-expanzió központi szerepet játszik a felesleges energia semleges lipidként történő tárolásában. A zsírszövet feleslege azonban kockázati tényező az inzulinrezisztencia és a 2-es típusú cukorbetegség kialakulásában, mivel a zsírszövet lipidtárolókapacitása meghaladja (1). A lipidek raktározásának képessége kétféleképpen növelhető: a meglévő adipociták méretének növelésével (hipertrófia) és sztrómasejtek toborzásával új adipociták képződésére (hiperplázia). Következetesen megfigyelték, hogy az adipocita hipertrófiája társul az inzulinrezisztenciával (2, 3), és szorosan kapcsolódik a zsírszövet gyulladásához, mivel a hipertrófia révén elérik az adipocita expanzió határát (4, 5). A nekrotikus, hipertrofált adipociták makrofágok által közvetített eltávolításának előrehaladtával új adipociták képződnek, hogy fenntartsák a lipidtárolókapacitást az átalakított zsírszövetben (5, –7). Az adipocita hiperplázia fontossága a zsírszövet működésének fenntartásában felkeltette az érdeklődést a rezidens zsírszövet stromális sejtek (8) vagy a csontvelő eredetű progenitor sejtek (9) adipogenezisen keresztül történő toborzását szabályozó tényezők megértése iránt.

Az ubiquitin-proteaszóma rendszert jól leírják, hogy szabályozza az idegi, hematopoietikus és mesenchymális eredetű ős/progenitor sejtek proliferációját és differenciálódását meghatározó kulcsfontosságú szabályozó fehérjék proteolízisét és aktivitását (10, –12). Az ubiquitin-proteaszóma rendszer magas rendezettségű enzimek halmazaként működik, amelyek aktiválják, majd az ubiquitint egy célfehérjébe viszik át, ami a célfehérje proteasoma által közvetített lebontásához vagy a célfehérje aktivitásának nem proteolitikus szabályozásához vezet (13). A mezenkimális progenitor sejtek osteogenezishez való elköteleződéséhez szükséges szabályozó fehérjék proteázomális lebomlását a Wnt/β-catenin (14) és a csont morfogenetikus fehérjék (15) esetében írták le. Ezek az utak szabályozzák az adipogén származás iránti elkötelezettséget is.

A Wnt10b, Wnt10a és Wnt6 gátolja az adipogenezist és elősegíti az osteogenezist a β-catenin mechanizmusok (16) révén, amelyeket a β-catenin proteazomális lebontása zár le (17). Ezzel szemben a Wnt5a elősegíti az adipogenezist (18) és a β-katenin lebomlását (19). A csont morfogenetikus fehérje 4 (BMP-4) 2 a növekedési faktorok TGFβ szupercsaládjának tagja, amelyeket eredetileg a csontképződés szabályozásaként azonosítottak (20). A későbbi adatok meghatározták a BMP-k szerepét számos szövet, köztük a zsírszövet (21) kialakulásában, ahol a BMP-4 elősegíti a mesenchymális őssejtek elköteleződését a fehér zsírszövet adipocita vonalához (22, –24). Az ubiquitin-proteasome rendszer szerepe azonban a mesenchymális őssejtek toborzásában adipocita progenitor sejtek kialakításában nincs pontosan meghatározva.

Az adipogenezis 3T3-L1 modelljében végzett vizsgálataink azt mutatják, hogy a Siah2 ubiquitin ligáz elősegíti az adipogenezist (25). Sőt, a Siah2 -/- (Siah2KO) egerek adipocitái általában nagyobbak, mint a vad típusú adipociták (26), ami arra utal, hogy a Siah2 elvesztése befolyásolja az új adipociták in vivo képződésének képességét. Így azt vizsgáltuk, hogy a Siah2 befolyásolja-e az adipogenezist Wnt vagy BMP-4 útvonalakon keresztül, vad típusú és Siah2KO egerekből nyert primer zsírszövet-stromális sejtek felhasználásával. Itt arról számolunk be, hogy a Siah2 a BMP-4 irányában működik, hogy szabályozza a zsírszövet stromális sejtek elkötelezettségét az adipogén út felé.

Eredmények

A Siah2 expresszió elősegíti az adipogenezist

A Siah2 a BMP-4 irányában működik az adipogenezis elősegítése érdekében. Az A és B, Bmp-4, Wisp2 és Zfp423 génexpressziót vad típusú és Siah2KO inguinalis zsírszövetben (A) vagy vad típusú és Siah2KO primer inguinalis tapadó stromális sejtekben (−MDI) adipogenezis indukálása előtt vizsgáltuk. az indukció utáni 4. napon (+ MDI) (B). A C-adipogenezis markereit (Pparg, Fabp4 és Lpl), Wnt10b, Wisp2 és Zfp423 génexpressziót az adipogenezis során 40 ng/ml BMP-4 hiányában vagy jelenlétében vizsgáltuk. D, Oil Red O festés semleges lipid felhalmozódásban a 4. napon az adipogenezis utáni indukciója után vad típusú és Siah2KO sztróma sejtekben. A Siah2KO sztrómasejteket inkubáltuk (Siah2KO/-BMP-4) vagy 40 ng/ml BMP-4 (Siah2KO/+ BMP-4) jelenlétében. A Siah2KO statisztikai szignifikanciáját összehasonlítottuk a vad típusú (A), a vad típusú −MDI (B) vagy a megfelelő 0 (C) nappal. #, p Az 5. ábra egy A ábra azt mutatja, hogy a Zfp521 fehérje szintje emelkedik az indukció előtt (0. nap az indukció után) Siah2 hiányában a vad típushoz képest, és hogy a Zfp521 szint emelkedik az adipogenezis indukálása során a Siah2KO sejtekben anélkül, hogy BMP-4. Amikor a BMP-4-et (40 ng/ml) adunk hozzá egy nappal a Siah2KO sejtekben történő indukció előtt, a Zfp521 szintje lényegesen csökken az indukció utáni 2. napon, és összehasonlítható a vad típusával az indukció utáni 4. napon. In vitro kísérletek (5. ábra B) azt mutatják, hogy a HA-jelöléssel ellátott ZFP521 szintek FLAG-Siah2 jelenlétében lényegesen csökkennek, de önmagukban vagy a FLAG-Siah2 jelenlétében a proteaszóma gátlásával (epoxomicin) növekednek, jelezve, hogy a Siah2 növekszik a Zfp521 proteazomális lebomlása. Az 5.B ábrán bemutatott Western blot-nak megfelelő nitrocellulóz membrán MemCode festése (5. ábra C) megerősíti, hogy az egyes sávokban a fehérje egyenlően töltődik be. Eredményeink együttvéve azt mutatják, hogy a Siah2 a Zfp521 fehérje szintjének BMP-4-függő módon történő szabályozásával szabályozza az adipogenezis iránti elkötelezettség korai lépéseit, hogy elősegítse a Zfp423 mRNS expresszióját (5. ábra D).

A Siah2 szabályozza a Zfp521 fehérje szintjét. Az A, Zfp521 fehérjeszinteket az adipogenezis indukálása során vizsgáltuk vad típusú és Siah2KO inguinalis zsírszövetből izolált sztrómasejtekben. A kontroll Zfp521 jelöletlen egér Zfp521 átmenetileg expresszálódik HEK293 sejtekben. Ahol jelezték, BMP-4-et (40 ng/ml) adtak hozzá 2 nappal az adipogenezis kiváltása előtt. A B, HEK293 sejteket átmenetileg transzfektáltuk HA-Zfp521 és pcDNA3.1 vagy HA-Zfp521 és FLAG-Siah2 sejtekkel, és proteaszóma inhibitor epoxomicinnel (1 μm) kezeltük a jelzett módon. A felső panel rövid film expozíció, az alsó panel pedig egy hosszú film expozíció a HA-Zfp521 detektálására. A fehérje szinteket (A és B) Western-blot analízissel vizsgáltuk. C, a B. D-ben jelen lévő teljes fehérje MemCode festése, sematikusan ábrázolja a Siah2 által közvetített elkötelezettséget az adipogenezishez egy olyan út szabályozása révén, amely magában foglalja a BMP-4, Zfp521 és Zfp423 expresszióját a zsírszövet stromális vaszkuláris sejtjeiben.

Vita

Az adipocita stromális sejtek érett adipocitákká történő átalakításában részt vevő tényezők azonosítása alapvetően fontos a zsírszövet elhízásban történő terjeszkedésének megértése szempontjából. A sovány vagy elhízott Siah2KO egerek zsigeri és szubkután zsírraktáraiban lévő adipociták hipertrófiásak, összhangban vannak az in vivo károsodott adipogenezissel, amely összefüggésben áll a Siah2 veszteségével (26). Bár az adipogenezis károsodott, mind a sovány, mind az elhízott Siah2KO egerek inzulinérzékenyebbek voltak a vad típushoz képest. Más tanulmányokkal együtt, amelyek azt mutatják, hogy a megnagyobbodott adipociták összefüggésbe hozhatók az anyagcsere-egészséggel (38), ezek az eredmények azt mutatják, hogy elegendő lipidtárolókapacitás fordulhat elő a zsírszövetben, függetlenül az energia kihívásokra adott robusztus adipogén választól.

Bár az ubiquitin-proteasome rendszer enzimeit jól leírják az ős- és progenitor sejtek szaporodásának és differenciálódásának szabályozásaként, a hangsúly nagyrészt arra irányult, hogy megértsük az ubiquitin-proteasome rendszer enzimjeinek szerepét a pluripotencia szabályozásában és az embrionális őssejtek újraprogramozásában (10, 40 ). Bizonyítékok azonban felhalmozódnak arról, hogy az ubiquitin rendszer enzimjei szabályozzák a terminális adipogenezist szabályozó számos fehérje stabilitását és aktivitását (41, –43). Tekintettel az adipocita és az oszteoblaszt képződésének kölcsönös jellegére, annak bizonyítékai, hogy az ubiquitin-proteasome rendszer a bmp-2 expresszió szabályozásán keresztül befolyásolja a csontképződést (15), támogatja az ubiquitin rendszer enzimjeinek szerepét annak meghatározásában, hogy a mezenhimális progenitor sejteket toborozzák-e adipogenezishez. A Siah2-re specifikusabb kapcsolat található olyan tanulmányokban, amelyek azt mutatják, hogy a c-Cbl, egy citoplazmatikus ubiquitin-ligáz, amely szabályozza az oszteoblasztok proliferációját és differenciálódását (44), szintén együttműködik a Siah2-vel a sejtproliferációban és a differenciálódásban jelentkező jelátviteli események ellenőrzésében (45, 46).

Ez a tanulmány a Siah2-t a zfp423 gén expressziójának upstream szabályozásává teszi, és jelzi, hogy a Siah2 a Bmp-4 expresszió és a Zfp521 fehérje stabilitásának szabályozásán keresztül befolyásolja a Zfp423 gén expresszióját. Eredményeink általában azt mutatják, hogy a Zfp423 és a BMP-4 által közvetített adipogenezis szabályozását összekötő mechanizmusok kiterjednek a Zfp423 és a Bmp-4 génexpresszió szabályozására is. Eredményeink egyértelműen a Siah2 ubiquitin-ligázt helyezik olyan tényezőként, amely közvetíti a Bmp-4 és Zfp423 expresszió közötti kapcsolatot a zsírsztróma sejtek adipogén származás iránti elkötelezettségének meghatározásában.

Kísérleti eljárások

Állatkísérletek

A vad típusú és globális Siah2 -/- (Siah2KO) C57BL/6J hím egereket 12 órás világos-sötét ciklusban, 24 ° C-on tartottuk. Minden állatkísérletet a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó útmutatónak megfelelően hajtottak végre, amelyet a Pennington Biomedical Research Center állatgondozási és felhasználási bizottsága hagyott jóvá (876. protokoll). 4–8 hetes korban az egereket 8–11 óra között eutanizálták, majd az inguinalis és epididymális zsírszövetet összegyűjtötték az egész szöveti elemzéshez vagy az SVF-sejtek és az érett adipociták izolálásához.

Sejtkultúra

Az egér 3T3-L1 preadipocitákat szélesztettük és 2 nappal a konfluencia után 10% szarvasmarha szérummal, 100 egység penicillinnel/100 μg sztreptomicinnel végzett magas glükózszintű DMEM-ben növesztettük. A táptalajt 48 óránként cseréltük. A sejteket differenciálásra indukáltuk úgy, hogy a tápközeget magas glükózszintű DMEM-re cseréltük, amely standard 10% FBS, 0,5 mm izobutil-metilxantin (IBMX), 1 μm dexametazon, 1,7 μm inzulin (MDI) és 100 egység penicillin/100 μg sztreptomicin. 48 óra elteltével ezt a táptalajt 10% FBS-sel kiegészített magas glükózszintű DMEM-gyel helyettesítettük, és a sejteket ebben a tápközegben tartottuk. A Siah2-t vagy a PPARy-t ektopikusan expresszáló NIH 3T3 fibroblaszt sejtvonalakat (ATCC) rosiglitazon (TZD, 2,5 μm) jelenlétében vagy távollétében standard indukciós keverékkel differenciálásra indukáltuk. A HEK293 sejteket magas glükózszintű DMEM-ben tartottuk 10% FBS-sel, 100 egység penicillinnel/100 μg sztreptomicinnel.

A vad típusú vagy Siah2KO egerekből nyert zsírszövetet felaprítottuk, és 0,1% szarvasmarha szérummal és 0,1% I. típusú kollagenázzal (Worthington) kiegészített PBS-ben szuszpendáltuk, amelyet 37 ° C-ra előmelegítettünk 10 ml/2 g szövetben. A szövetet rázóvízfürdőben 37 ° C-on 1 órán át inkubáltuk, és 450 x g-vel 5 percig szobahőmérsékleten centrifugáltuk. Az inguinalis és epididymális zsírpárnákból származó érett adipocitákat összegyűjtöttük a felülúszóból és feldolgoztuk az RNS izolálásához. Mindkét zsírpárna pelletált SVF-sejtjeit RNS-izolálás céljából is feldolgoztuk. Az inguinalis zsírszövet SVF-sejtjeit sztrómás tápközegben (DMEM/Ham's F-12 táptalaj, 15% FBS, 100 egység penicillin/100 μg sztreptomicin) szuszpendáltuk, lemezeztük és fenntartottuk az előzőekben leírtak szerint (47). Amikor a sejtek 80–90% -ban összefolytak, a sztromális táptalajt kicserélték differenciáló táptalajra (DMEM/Ham's F-12 táptalaj 3% FBS-szel, 0,5 mm IBMX, 33 μm biotin, 17 μm pantotenát, 1 μm inzulin, 1 μm dexametazon, 2,5 μm roziglitazon és 100 egység penicillin/100 μg streptomicin). 3 nap múlva a táptalajt kicseréltük a fenntartó táptalajra, amely megegyezett a differenciáló táptalajjal, azzal a különbséggel, hogy az IBMX-t és a roziglitazont törölték. BMP-4-et (Life Technologies, 40 ng/ml) adtunk a táptalajhoz 5 nappal az indukció előtt.

Stabil sejtvonalak létrehozása

A Siah2-t megcélzó shRNS (SMARTvector lentiviral shRNS) vagy a TurboGFP markert tartalmazó pGIPZ vektorban (Dharmacon) tartalmazó nem-csendes kontroll hajtűszekvencia retrovírus által közvetített stabil expresszióját 3T3-L1 preadipocytákban állítottuk elő a gyártó utasításai szerint. A kívánt shRNS-t tartalmazó preadipocitákat 2 hét alatt puromicin (2,5 μg/ml) alkalmazásával szelektáltuk. A β-katenint kimerítettük a nem csendes pGIPZ és a pGIPZ-shSiah 3T3-L1 preadipocytákban fordított transzfekció útján (48) siRNS-t célzó β-catenin (Dharmacon SMARTpool On-Targetplus siRNS) alkalmazásával. A preadipocitákat 1 nappal azelőtt transzfektáltuk, hogy a sejteket adipogenezisnek indukálták volna. A célgének kimerülését qRT-PCR alkalmazásával igazoltuk. A Siah2 NIH3T3 fibroblasztokban való túlexpresszálásához a Siah2 cDNS-t amplifikáltuk PCR-en keresztül, hogy tartalmazzon egy 5 ′ EcoR1 restrikciós helyet és egy 3 ′ Sal1 restrikciós helyet. A PCR-terméket megtisztítottuk (Qiagen MiniElute PCR-tisztítás), és helyspecifikus mutagenezissel (Stratagene QuikChange) helyeztük a pBabePuro vektorba (Addgene). A szekvenciát dideoxi szekvenálással igazoltuk a pBabePuro-Siah2 NIH3T3 fibroblasztokká történő transzfektálása előtt, a korábban leírtak szerint (49).

A HA-Zfp521 és a FLAG-Siah2 átmeneti transzfekciója

Az egér Zfp521 cDNS-t az OriGene-ből (TrueClone cDNS) nyertük, és a HA epitóp tag-et a kezdő kodon után hely-irányított mutagenezissel (Stratagene QuikChange II) helyeztük be, és a korábban leírt dideoxi szekvenálással igazoltuk (25). A HEK293 sejteket 40–70% -os összefolyásig növesztettük, és átmeneti transzfekciókat végeztünk összesen 2 μg cDNS/lyuk és Polyfect felhasználásával a gyártó (Qiagen) utasításai szerint. A sejteket HA-Zfp521 és pcDNA3.1 vagy HA-Zfp521 és FLAG-Siah2 sejtekkel transzfektáltuk. A transzfekció után 48 órával a sejteket vivőanyag-kontrollal (DMSO) vagy epoxomicinnel (1 μm) kezeltük, és 4 órával később teljes sejtkivonatokat gyűjtöttünk be.

Olajvörös O festés

Olajvörös O festést Green és Kehinde (50) leírása szerint hajtottunk végre.

Mennyiségi PCR

A teljes RNS-t reverz átírással (200 ng RNS) írtuk le Multiscribe reverz transzkriptáz (Applied Biosystems) segítségével véletlenszerű primerekkel 37 ° C-on 2 órán át. A valós idejű PCR-t TaqMan kémiával végeztük a 7900 valós idejű PCR-rendszer és az univerzális ciklus körülményei között (50 ° C 2 percig, 95 ° C 10 percig és 40 ciklus 95 ° C 15 másodpercig és 60 ° C-ig 1 perc, majd 95 ° C 15 másodpercig, 60 ° C 15 másodpercig és 95 ° C 15 másodpercig). Az eredményeket normalizáltuk ciklofilin B vagy ubiquitin B mRNS szintre és elemeztük a 2 -ΔΔCT módszerrel.

Teljes sejtkivonatok készítése és immunblotolás

Teljes sejtkivonatokat készítettünk 50 mm-es Tris/Cl-ben (pH 7,4) 150 mm NaCl, 1 mm EDTA, 1% Igepal CA 630, 0,5% nátrium-deoxikolát, 0,1% SDS, 10 mm N-etil-maleimid, proteáz inhibitorok ( 1 mm PMSF, 10 μg/ml aprotinin, 1 μg/ml pepstatin és 5 μg/ml leupeptin) és foszfatáz inhibitor (2 mm nátrium-ortovanadát). A mintákat 10 percig 14 000 x g-vel centrifugáltuk 4 ° C-on, és a fehérje-koncentrációkat BCA-vizsgálattal (Thermo Fisher Scientific) határoztuk meg.

Gélelektroforézis és immunblotolás

A fehérjéket SDS-t tartalmazó poliakrilamid (National Diagnostics) gélekben szétválasztottuk és nitrocellulózra (Bio-Rad) vittük át. Az átvitelt követően a membránt 4% tejben blokkoltuk 25 m Tris/Cl-ben (pH 8,0), 150 m NaCl-ban, 0,1% Tween 20-ban (TBS-T) 1 órán át szobahőmérsékleten. A membránokat PPARy elleni antitestekkel (Santa Cruz Biotechnology, sc-7273, 1: 200; Abcam, 19481, 1: 500), β-kateninnel (Bethyl Laboratories, A302-012A-M, 1: 1000), Zfp521 ( ProSci, 6859, 1: 1000), HA epitópjelző (BioLegend, 901513, 1: 2000) és FLAG epitópjelző (Sigma, F1804, 1: 500) 1-2 órán át szobahőmérsékleten. Az eredményeket HRP-konjugált szekunder antitestekkel (Jackson ImmunoResearch Laboratories) és fokozott kemilumineszcenciával (Thermo Fisher/Pierce) tettük láthatóvá. Az egyenlő terhelést a nitrocellulóz membrán MemCode (Thermo Fisher Scientific) festésével határoztuk meg.

Statisztikai analízis

A statisztikai szignifikanciát párosítatlan kétfarkú t teszttel határoztuk meg. A statisztikai elemzésekhez a GraphPad Prism 5 szoftvert használtuk. A zsírszövet adatait (4. ábra A) 4 egérből/csoportból nyertük, és az elsődleges SVF sejtekben az adipogenezist három vagy négy egér összegyűjtött mintáiban hajtottuk végre, és legalább kétszer megismételtük. A 3T3-L1 adipocitákban és a HEK293 sejtekben végzett kísérleteket legalább kétszer megismételtük legalább három ismétléshez. Az összes technikai ismétlést három példányban hajtottuk végre. A variabilitást átlag ± S.D-ként fejeztük ki.

Szerző közreműködései

Ábrákon bemutatott kísérleteket G. K. és Z. E. F. tervezték, hajtották végre és elemezték. 1 1 - 4. D. H. B. technikai segítséget nyújtott az 1. ábrán bemutatott kísérletekhez. Z. E. F. koordinálta a tanulmányt és megírta az írást. Minden szerző átnézte az eredményeket és jóváhagyta a kézirat végleges változatát.

Köszönetnyilvánítás

Ebben a munkában a Pennington Biomedical Research Center sejtbiológiai és bioimaging magját, valamint a Genomics Core létesítményeit használták fel, amelyeket részben a COBRE (NIH 8P20-> GM103528) és a NORC (NIH 2P30-> DK072476) támogatásai nyújtanak a National Institute of Egészség.

* Ezt a munkát a NIDDK támogatta, az 1R01DK099625 Nemzeti Egészségügyi Intézet (Z. E. F. részére). A szerzők kijelentik, hogy nincs összeférhetetlenségük a cikk tartalmával. A tartalom kizárólag a szerzők felelőssége, és nem feltétlenül képviseli a Nemzeti Egészségügyi Intézet hivatalos nézeteit.