A súlykerékpározás növeli a T-sejt felhalmozódását a zsírszövetben és rontja a szisztémás glükóz toleranciát

Absztrakt

Az elhízás az inzulinrezisztencia (IR), a 2-es típusú cukorbetegség és a szív- és érrendszeri betegségek kialakulásának fokozott kockázatával jár (1). Az elhízás sok metabolikus következménye a zsírszövet (AT) diszfunkciójának eredménye. A legújabb eredmények szerint az immunsejtek felhalmozódása az AT-ben kulcsfontosságú szerepet játszik az elhízással összefüggő gyulladásban. Megalapozott, hogy a veleszületett immunsejtek, beleértve a makrofágokat is, az elhízás során felhalmozódnak az AT-ben, és az AT-eredetű gyulladásos citokinek/kemokinek fő forrásai (2–4).

A veleszületett immunsejtek mellett a legfrissebb bizonyítékok rámutatnak az adaptív immunrendszer részvételére az AT gyulladásának elhízás során történő kiváltásában. A magas zsírtartalmú étrend (HFD) táplálásakor csökken az AT-rezidens gyulladásgátló limfociták aránya, beleértve a CD4 + szabályozó T-sejteket (5) és a T helper (Th) 2 sejteket (6). Az elhízás továbbá elősegíti a gyulladásgátló limfociták, például a B-2 sejtek (7), a természetes gyilkos T-sejtek (8,9), a interferon-y (IFN-y) - CD4 + Th1 kiválasztását (6,10–12), és CD8 + citotoxikus T-sejteket (10, 11, 13, 14) AT-be. A T-sejtek AT-ban való felhalmozódása antigén vezéreltnek tűnik (6,14), és memóriasejtek képződése is jellemzi (10,11). Érdekes módon a proinflammatorikus T-sejtek halmozódásának megakadályozása AT-ben az elhízás során javítja a szisztémás glükóz toleranciát (6, 14), jelezve, hogy a Th1 immunválasz felé történő elmozdulás hozzájárul az AT gyulladás és az IR kialakulásához az elhízás során.

A fogyás az ideális megközelítés az elhízás negatív következményeinek ellensúlyozására. A fogyást elősegítő életmódbeli vagy műtéti beavatkozások csökkentik az AT makrofág (ATM) számát, csökkentik a gyulladást és javítják az inzulinérzékenységet (15–17). Még akkor is, ha fogyás érhető el, a veszteségeket ritkán tartják fenn (18). Ezek a súlygyarapodások súlykerékpározáshoz vezetnek. Bár a súlykerékpározás anyagcsere-egészségre gyakorolt hatásáról szóló szakirodalom továbbra is ellentmondásos (19–22), több tanulmány szerint a súlykerékpározás növeli a 2-es típusú cukorbetegség és a szív- és érrendszeri betegségek kialakulásának kockázatát az embereknél (23–27). Míg a súlykerékpározás potenciálisan káros hatásait felismerik, a súlykeringezés növeli az anyagcsere-diszfunkció mechanizmusait. Ezenkívül nem ismert, hogy a súlyciklus megváltoztatja-e az AT immunsejt-összetételét.

Ebben a tanulmányban az egereket a HFD és az alacsony zsírtartalmú étrend (LFD) között ciklikusan megvizsgálták annak megállapítására, hogy a súlyciklus megváltoztatja-e az anyagcsere és az immunológiai paramétereket, összehasonlítva az egerekkel, amelyek kerékpározás nélkül híznak. Megmutattuk, hogy a súlyciklus rontja a szisztémás glükóz toleranciát és csökkenti az AT inzulin érzékenységét. A súlyciklus nem változtatta meg az ATM szám vagy az M1 polarizáció HFD által kiváltott növekedését. Ugyanakkor mind a CD4 +, mind a CD8 + T-sejtek száma nőtt az AT-ben a súlyciklus során. Ezenkívül a CD8 + effektor memória T-sejt populációi növekedtek az elhízás és a súlyciklus során. Ez az intenzívebb T-sejt-vezérelt gyulladásos válasz hozzájárulhat a súlyciklushoz kapcsolódó metabolikus rendellenességekhez.

KUTATÁSI TERVEZÉS ÉS MÓDSZEREK

Állatok.

A hím C57Bl/6J egereket a The Jackson Laboratory cégtől vásároltuk. 8 hetes korukban az egereket 60% -os HFD-re vagy 10% -os LFD-re helyezték, mindkettőt a Research Diets-től vásárolták (New Brunswick, NJ; HFD: D12492; LFD: D12450B). Az egereket ad libitum etették és szabad hozzáférést kaptak a vízhez. Minden állatkísérletet a Vanderbilt Egyetem Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottságának jóváhagyásával hajtottak végre.

Súly és testösszetétel.

A testtömeget hetente mértük. A teljes zsír- és zsírtömeget magmágneses rezonanciával mértük Bruker Minispec műszerrel (Bruker, Woodlands, TX).

Plazma gyűjtés és mérések.

Az egereket 5 órán át éheztettük, és heparinizált gyűjtőcsövek segítségével elvéreztettük a retro-orbitális vénás plexust. A plazmát centrifugálással választottuk el. Az inzulint patkány/egér inzulin ELISA készlettel (Millipore, Billerica, MA) mértük.

Glükóz tolerancia tesztek.

Öt órán át éheztetett egereket vértettek a farokvénával, és megmérték a vércukorszintet. Ezután az egereknek 2 g/kg sovány tömegű dextrózt injektáltunk (Hospira, Inc., Lake Forest, IL). A vércukorszintet a megjelölt időpontokban értékeltük.

Valós idejű RT-PCR.

Az RNS izolálást és a valós idejű RT-PCR-t a korábban leírtak szerint hajtottuk végre (28). Valamennyi gént Pfaffl-módszerrel (29) elemeztük, gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenázra normalizáltuk, és az LF/LF/LF csoporthoz viszonyítva expresszióként mutattuk be.

Western blot elemzés.

Tizenöt perccel az áldozat előtt 5 órás éhgyomri egereket intraperitoneálisan injektáltunk fiziológiás sóoldattal vagy 0,5 egység emberi inzulinnal/kg teljes testtömegre (Novo Nordisk, Princeton, NJ). A fagyott epididymális AT-, máj- és gastrocnemiusizomot 2% SDS-ben ultrahanggal kezeltük 1 mmol/l nátrium-ortovanadáttal és 0,5 mmol/l fenil-metil-szulfonil-fluoriddal. A fehérjét BCA assay (Thermo Scientific, Rockford, IL) alkalmazásával számszerűsítettük. A membránokat immunblotoltuk AKT vagy foszfo-AKT (Ser473) ellen termelt antitestekkel, mindkettőt a Cell Signaling Technology-tól (Danvers, MA) szereztük be. A sávintenzitást ImageJ szoftver segítségével számszerűsítettük (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

Stromális vaszkuláris frakciók szétválasztása és áramlási citometria.

A stromális vaszkuláris frakció (SVF) sejteket összegyűjtöttük a korábban leírtak szerint (30). Az áramlási citometriához 1 millió sejtet inkubáltunk Fc blokkban 5 percig, majd 30 percig inkubáltuk 4 ° C-on fluoroforral konjugált antitestekkel: F4/80-allofikocianin (APC), CD11c-fikoeritrin (PE) eBioscience-től, San Diego, Kalifornia), CD11b-APC – Cy7, T-sejt receptor-β (TCR-β) –APC, CD4-A700, CD8-PE – Cy7, CD62L-PE és CD44-FITC (mind BD Biosciences, San Jose, Kalifornia). DAPI-t (0,2 mg/ml) adtunk életképességi festésként, mielőtt az áramlási citometriát elvégeztük. A mintákat egy ötlézeres LSRII áramlási citométerrel dolgoztuk fel a Vanderbilt University Flow Cytometry Core-ban. Az adatokat FlowJo szoftverrel elemeztük (Tree Star, Ashland, OR). Az ATM és a T-sejt tartalom elemzésének kapuzási stratégiáját az 1. kiegészítő ábra magyarázza. A kéziratban az áramlási citometriára vonatkozó adatokat a fluorofor-pozitív sejtek százalékos arányában jelenítjük meg az élő sejtek teljes számához viszonyítva. A fluoreszcencia mínusz egy kontrollalany az ATM és AT T-sejt elemzéshez a Kiegészítő ábrákon látható. A 2. és 3. ábra, valamint az ATM és az AT T-sejt markerek izotípus kontrolljait a 4. ábra szemlélteti.

Statisztika.

Az összes statisztikai elemzéshez a Prism 5.0 szoftvert (GraphPad) használtuk. Az adatokat egyirányú ANOVA alkalmazásával elemeztük, amelyet post hoc Student t teszt követett, ha az ANOVA szignifikáns volt. Kétirányú ANOVA-t használtunk a mérések két különböző változóval történő összehasonlítására. A kiugró értékeket kizártuk az egyes paraméterek adataiból a Grubbs-outlier teszt alkalmazásával (31). A ≤0,05 P értéket szignifikánsnak tekintették.

EREDMÉNYEK

Dizájnt tanulni.

Annak megállapítására, hogy a súlyciklus megváltoztatja-e az anyagcsere paramétereit vagy az AT immunsejt populációit, hím C57Bl/6 egereknek táplálékot adtak-e váltakozó elhízott és sovány állapotok kiváltására. A vizsgálat három 9 hetes étrendi periódusból állt, amelyekben az egerek ad libitum hozzáféréssel rendelkeztek akár 10% -os LFD-hez, akár 60% -os HFD-hez. Három egércsoportot alkalmaztunk (1A. Ábra). A sovány kontrollcsoportot (ábrákon LF/LF/LF-nek jelölve) a vizsgálat időtartamára (27 hét) az LFD-re helyeztük. A súlygyarapodási csoportot (ábrákon LF/HF/HF-nek nevezik) 9 hétig LFD-n tartották, majd a vizsgálat hátralévő 18 hetében HFD-re váltottak. A súlyciklusos csoportot (az ábrákon HF/LF/HF-nek jelöljük) 9 hétre HFD-re helyeztük, hogy elhízást és immunsejtek beszivárgását indukáljuk AT-be, 9 hétre átállítottuk LFD-re, hogy elősegítsük a fogyást, és HFD-re helyeztük az elmúlt 9 hetes időszakban a későbbi elhízás kiváltására.

A súlyciklus növeli a T-sejt markerek, valamint a CD4 + Th1 és CD8 + T sejtekből származó citokinek AT gén expresszióját. Az epididymális AT-ból RNS-t izoláltunk, és a génexpressziót valós idejű RT-PCR-rel elemeztük. V: Cd3. B: Cd4. C: Cd8. D: Ifng. E: Il12. F: Il2. G: Il2ra. H: Il2rb. I: Ccl5. Az adatokat átlag ± SEM formában mutatjuk be; n = 8–14/csoport. A nem azonos betűvel összekapcsolt csoportok jelentősen eltérnek egymástól; P + Th1- és CD8 + T-sejtből származó citokinek AT-ban.

Ezután meghatároztuk a T-sejt funkció és a gyulladásos állapot szempontjából releváns gének expresszióját. A Th1-polarizált CD4 + T-sejtek és a citotoxikus CD8 + T-sejtek a gyulladásos citokin IFN-y magas szintjét választják ki (36). A valós idejű RT-PCR elemzés azt mutatja, hogy a súlyciklus tovább növeli az Ifng gén expressziójának HFD által kiváltott növekedését (6D. Ábra) (P + T sejtek (38), kétszeresére nőtt a súlygyarapodási csoporthoz képest (6F ábra). ) (P + effektor memória T-sejt akkumuláció AT-ban.

Az adaptív immunválasz egyik megkülönböztető jellemzője a sejtmemória kialakulása specifikus antigének ellen (39). Annak megállapításához, hogy a súlyciklus összefüggésben van-e az effektor memória T-sejtjeinek növekedésével, a CD4 + és CD8 + T sejteket elemeztük CD62L és CD44 szempontjából. A CD4 + effektor memória T-sejtjeit (CD62L - CD44 +) sem HFD-etetés, sem súlyciklus nem befolyásolta (7A – D. Ábra). A publikált szakirodalommal (10, 11) egyetértésben azonban az elhízás növelte a CD8 + effektor memória T-sejtjeinek számát AT-ban (7E és F ábra) (P + effektor memória T-sejt felhalmozódása súlyciklusú egerek AT-jében ( 7F és G ábra) (P = 0,075 az LF/HF/HF-hez képest). A fenti adatok azt mutatják, hogy az effektor memória T-sejtek felhalmozódnak az AT-ban az elhízás során, és hogy a súlyciklus tovább növelheti ezt az adaptív immunmemória-választ.

Fokozott CD8 +, de nem CD4 +, effektor memória T-sejtek felhalmozódása AT-ben elhízás alatt. Az SVF sejteket izoláltuk az epididimális AT-ből és áramlási citometriával elemeztük. A és E: LF/LF/LF (sovány kontroll) csoport. B és F: LF/HF/HF (súlygyarapodás) csoport. C és G: HF/LF/HF (súlyciklus) csoport. A sejteket az elülső és az oldalsó szórás alapján kaptuk a limfocita populációra (1. ábra), kiválasztottuk a CD4 (A – D) vagy a CD8 (E – H) expressziójára (5. ábra), majd elemeztük a memória T- sejt markerek. A CD62L és CD44 elemzett CD4 + sejtek reprezentatív áramlási citometriás pontdiagramjai (A – C). D: CD4 + effektor memória T-sejtek (CD62L - CD44 +) mennyiségi meghatározása áramlási citometriával. A CD62L és CD44 elemzett CD8 + sejtek reprezentatív áramlási citometriás pontdiagramjai (E – G). H: CD8 + effektor memória T-sejtek (CD62L - CD44 +) mennyiségi meghatározása áramlási citometriával. Az adatokat átlag ± SEM formában mutatjuk be; n = 6–12/csoport. A nem azonos betűvel összekapcsolt csoportok jelentősen eltérnek egymástól; P + T-sejtek, CD4 + T-sejtek és a Th1 sejtből származó citokinek expressziója súlyciklusú egerekben. Ezek az új eredmények azt sugallják, hogy az AT-ben a súlyciklus során amplifikált T-sejt-válasz lép fel.

Korábbi beszámolók kimutatták, hogy a súlyciklus növeli a szisztémás IR-t patkányokban (40,41), és egy nemrégiben végzett tanulmány kimutatta, hogy megnövekedett gyulladásos citokinszintek vannak a súlyciklus alatt egerek AT-jában a sovány kontroll egerekhez képest (42 Több humán tanulmány bizonyítja, hogy a súlykerékpározás növeli a szív- és érrendszeri betegségek és a 2-es típusú cukorbetegség kialakulásának kockázatát (23–27). Az első, ezzel a kérdéssel foglalkozó tanulmányok egyike arról számolt be, hogy a koszorúér-halálozás 25 éves kockázata 10% -kal nőtt azoknál a férfiaknál, akik súlyosan kerékpároztak, azokhoz képest, akik híztak, de testsúlyuk stabil maradt (24). Ezenkívül egy nemrégiben végzett tanulmány kimutatta, hogy a súlykerékpározás a 2-es típusú cukorbetegség megnövekedett előfordulásával jár a Framingham Heart Study résztvevőinél (23).

A fenti eredményekkel ellentétben más tanulmányok nem számoltak be a súlykerékpározás káros hatásairól (19–22). A súlykerékpározás emberre gyakorolt hatásával kapcsolatos vita részben a tanulmány tervezésének változékonyságának tudható be. Fontos, hogy adataink arra utalnak, hogy az AT-ban eltúlzott adaptív immunválasz hozzájárulhat a súlyciklus negatív hatásaihoz. Valójában a CD4 + Th1 és Th2, valamint a CD8 + T sejtekről ismert, hogy szerepet játszanak az emberi elhízás patogenezisében (43). Ezért, ha a súlyciklus mértéke vagy a ciklusok közötti idő (a vizsgálati tervben meghatározottak szerint) nem volt elegendő az AT immunsejt-beszivárgás kiváltásához, előfordulhat, hogy az anyagcserére gyakorolt súlyciklusos hatást nem figyelték meg.

Fontos volt megerősíteni, hogy a fogyás a későbbi súlygyarapodás előtt teljesen megfordította az elhízással járó anyagcsere-diszfunkciókat. A vizsgálat 18. hetében elvégzett metabolikus fenotipizálás azt mutatta, hogy amikor a súlykerékpáros csoportba tartozó egerek LFD-re váltanak, akkor fogynak, és pontosan normalizálódnak az egerek testtömegéhez/összetételéhez és glükóz toleranciájához. a vizsgálat időtartama (5. ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a glükóz-intolerancia nem előzi meg a súly visszaszerzését ebben a súlyciklusos protokollban, és arra utalnak, hogy a súlyciklus önmagában felelős a vizsgálat végén megfigyelt metabolikus diszfunkcióért.

Ebben a tanulmányban bemutatjuk, hogy a súlyciklus növeli a CD4 + és CD8 + T sejtek felhalmozódását az AT-ban. Továbbá a Th1-eredetű citokinek és citokinreceptorok génexpressziója megnövekedett a súlyciklusú egerek AT-jában, összehasonlítva a HFD-n tartott egerekkel (6. ábra). A legújabb tanulmányok kimutatták, hogy az egerek, amelyekből hiányoznak bizonyos T-sejtből származó citokinek vagy proinflammatorikus T-sejt alcsoportok, védettek az elhízással összefüggő számos patológiától. Például a HFD által kiváltott glükóz intolerancia és az AT gyulladás enyhül az IFN-γ – knockout egerekben (44). Ezenkívül a CD8 + T-sejtek törlése javítja a szisztémás glükóz toleranciát és az inzulinérzékenységet (14). Ezenkívül a T-bet kiesése csökkenti az AT-n belüli több limfocita sejtpopulációt, és javítja a HFD által kiváltott glükóz-intoleranciát és AT-gyulladást (45). Ezek a közzétett tanulmányok azt sugallják, hogy az AT fokozott T-sejt-mediált gyulladása hozzájárulhat az AT inzulinérzékenység és a szisztémás glükóz-intolerancia károsodásához, amelyet a súlyciklus során észleltek.

Ezen felül regressziós elemzést végeztünk annak megállapítására, hogy van-e összefüggés az AT T-sejt tartalom és a glükóz tolerancia között a vizsgálatunkban. Ezek az elemzések azt mutatják, hogy a csökkent glükóz tolerancia (a GTT görbéje alatti terület megnövekedett területe) szignifikánsan és pozitívan korrelál az AT CD4 + és CD8 + T sejtjeinek százalékos arányával, valamint a Th1-eredetű Ifng és Il2 citokinek génexpressziójával. (Kiegészítő 9. ábra). Továbbá, amikor ezeket a korrelációkat korrigálták az ATM szám változásaihoz, a csökkent glükóztolerancia és az AT T-sejtek közötti kapcsolat továbbra is szignifikáns maradt (CD4, P = 0,002; CD8, P = 0,01). Ezért ezek a megállapítások megerősítik azt a következtetést, hogy az AT-ben a gyulladásos T-sejt alcsoportok növekedése, a makrofágoké azonban nem, hozzájárul a metabolikus alkalmasság romlásához a súlyciklus során.

Az IR az AT-ban kulcsfontosságú szerepet játszik az elhízás alatti szisztémás glükóz-intoleranciában; azonban más anyagcsere szövetek is jelentős szerepet játszanak a glükóz homeosztázis fenntartásában. Az inzulinszignalizáció szövetspecifikus károsodásainak meghatározására az ideális módszer a hiperinsulinémiás-euglikémiás anyagcsere-szorító. Azonban a jelenlegi vizsgálat végén az egerek magas kora miatt úgy döntöttünk, hogy nem végezzük ezeket a vizsgálatokat. Ehelyett értékeltük a különböző szövetekben a jelátviteli utakat egy inzulin bolus injekciója után. Amint azt a 6. ábra mutatja, a súlyciklus is károsítja a máj, de nem az izom inzulinjelzését. Ezért valószínű, hogy a megváltozott máj inzulinérzékenység az AT immunometabolikus változásain túl hozzájárul a súlyciklus során megfigyelt szisztémás metabolikus diszfunkcióhoz. Míg jelenlegi jelentésünk az AT immunösszetételére és az IR-re összpontosít, a súlykerékpározás májra gyakorolt hatása a jövőbeni vizsgálat fontos területe.

Vizsgálataink együttvéve először mutatják be, hogy a súlyciklus modulálja az AT T-sejtek összetételét, a makrofágok összetételét azonban nem. A proinflammatorikus T-sejtek populációinak ez a növekedése arra utal, hogy az AT-ban eltúlzott adaptív immunválasz hozzájárul a súlyciklus negatív metabolikus következményeihez.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Ezt a projektet a Nemzeti Egészségügyi Intézetek támogatták. HL-089466. A.H.H. támogatta az American Diabetes Association Karrierfejlesztési Díj (1-07-CD-10) és az American Heart Association alapított nyomozói díj (12EIA827) is. E.K.A. támogatta a Cellular, Biochemical and Molecular Sciences képzési program (National Institutes of Health Grant T32-GM-008554) és az American Heart Association előtti doktori ösztöndíj (12PRE11910047). D.A.G. egyedi Nemzeti Kutatási Szolgálati Díj (DK-091128) támogatta, és A.K. finanszírozta az American Diabetes Association Postdoctoral Fellowship (7-10-MI-05). Az áramlási citometriás kísérleteket a Vanderbilt University Medical Center Flow Cytometry Shared Resources Core-ban hajtották végre, a Vanderbilt Emésztőrendszeri Kutatóközpont támogatásával (DK-058404).

A cikk szempontjából lényeges összeférhetetlenségről nem számoltak be.

E.K.A. összegyűjtötte és elemezte az adatokat, és megírta a kéziratot. D.A.G. és A.K. segített az adatgyűjtésben és áttekintette a kéziratot. A.H.H. támogatást biztosított, segített az adatelemzésben és szerkesztette a kéziratot. A.H.H. a garancia ennek a munkának, és mint ilyen, teljes hozzáféréssel rendelkezett a vizsgálat összes adatához, és felelősséget vállal az adatok integritásáért és az adatelemzés pontosságáért.

A szerzők köszönetet mondanak laboratóriumuk tagjainak a kézirat gondos elolvasásáért. A szerzők köszönetet mondanak Dr. Ayumi Shitanti és Aihua Bian (Vanderbilt Egyetem) statisztikai segítségért. Ezeket az ARI 056116, DK-020593-33 NIH pályázatok támogatják.