A szívizom védelme az iszkémia/reperfúziós sérülésektől exogén galaninfragmens által

Mutatók: PDF 762 megtekintés | HTML 1204 megtekintés | ?

Andrej Timotin, Oleg Pisarenko, Maria Sidorova, Irina Studneva, Valentin Shulzhenko, Marina Palkeeva, Larisa Serebryakova, Aleksander Molokoedov, Oksana Veselova, Mathieu Cinato, Helene Tronchere, Frederic Boal és Oksana Kunduzova _

Absztrakt

Andrej Timotin 1, 2, Oleg Pisarenko 3, Maria Sidorova 3, Irina Studneva 3, Valentin Shulzhenko 3, Marina Palkeeva 3, Larisa Serebryakova 3, Aleksander Molokoedov 3, Oksana Veselova 3, Mathieu Cinato 1, 2, Helene Tronchere 1, 2, Frederic Boal 1, 2, *, Oksana Kunduzova 1, 2, *

1 Országos Egészségügyi és Orvosi Kutatóintézet (INSERM), Toulouse, Franciaország

2 Toulouse-i Egyetem, UPS, Metabolikus és Kardiovaszkuláris Betegségek Intézete, Toulouse, Franciaország

3 Orosz kardiológiai kutató-termelő komplexum, Moszkva, Orosz Föderáció, Oroszország

* Ezek a szerzők egyformán járultak hozzá ehhez a munkához

Kulcsszavak: galanin (2-11), szív, ischaemia és reperfúzió, energia anyagcsere, ROS termelés

Beérkezett: 2016. november 02. Elfogadva: 2017. január 09. Megjelenés: 2017. február 03

Háttér és cél: A galanin egy multifunkcionális neuropeptid, pleiotróp szerepekkel. Jelen tanulmány célja a galanin (2-11) (G1) potenciális hatásainak értékelése a funkcionális és metabolikus rendellenességekre a szívizom ischaemia-reperfúziós (I/R) sérülésére adott válaszként.

Kísérleti megközelítés: A G1 peptidet 9-fluorenil-metoxi-karbonil (Fmoc) alapú szilárd fázisú módszerrel szintetizáltuk. A kémiai szerkezetet 1H-NMR spektroszkópiával és tömegspektrometriával azonosítottuk. A kísérleteket in vivo I/R sérülés patkánymodelljével, ex vivo izolált perfundált patkányszívekkel és in vitro tenyésztett patkány kardiomioblast H9C2 sejtekkel végeztük. Mértük a szívműködést, az infarktus méretét, a szívizom energia-anyagcseréjét, a hemodinamikai paramétereket, a kreatin-kináz-MB (CK-MB) és a laktát-dehidrogenáz (LDH) plazmaszintjeit, hogy értékeljük a G1 hatását a szívizom I/R sérüléseire.

Főbb eredmények: A G1-kezelés dózisfüggő módon növelte a sejtek életképességét, gátolta a sejtek apoptózisát és a túlzott mitokondriális reaktív oxigénfajták (ROS) termelését a H9C2 sejtek oxidatív stresszére adott válaszként. A G1 pre- vagy posztiszchémiás infúziója fokozta a funkcionális és metabolikus helyreállítást az ischaemiás izolált patkányszív reperfúziója alatt. A G1 beadása a reperfúzió kezdetén jelentősen csökkentette az infarktus méretét, valamint a CK-MB és az LDH plazma szintjét szívizom I/R sérülésnek kitett patkányokban.

Következtetések és következmények: Ezek az adatok szolgáltatják az első bizonyítékot a galanin G1 szívizomvédő aktivitására a szívizom I/R sérülései ellen. Ezért a G1 peptid ígéretes kezelési stratégiát jelenthet az ischaemiás szívbetegségben.

BEVEZETÉS

Jelen vizsgálatunkban különböző kísérleti modellekben értékeltük a G1 hatását a szívizom I/R sérüléseire, beleértve a kardiomioblasztokat, a perfundált izolált szívet és a szívet. in situ.

EREDMÉNYEK

A G1 hatása a H9C2 sejtek túlélésére a stressz hatására

Annak eldöntésére, hogy a G1 befolyásolja-e a sejtek túlélését az oxidatív stressz hatására, megvizsgáltuk a peptid dózisfüggő hatásait az ATP-koncentrációval mérve a kardiomioblaszt életképességének H2O2-indukálta veszteségére. Amint az 1. ábrán látható, a sejtek 4 órán át 400 μM H2O2-nek való kitettsége a sejtek életképességének jelentős csökkenéséhez vezetett a kontrollhoz képest. Dózis-válasz vizsgálatok azt mutatták, hogy az 50 és 250 nM dózisú G1 képes volt megakadályozni a sejtek túlélésének H2O2-indukálta csökkenését. Ezután terminális dezoxinukleotidiltranszferáz dUTP nick end jelöléssel (TUNEL) vizsgáltuk, hogy a G1 befolyásolja-e az apoptotikus sejtpusztulást a hipoxiás stressz hatására. Mivel 50 nM G1 körülbelül 20% -kal növelte a kardiomioblaszt életképességét, ezt a koncentrációt használtuk a későbbi kísérletek során. Amint a 2. ábrán látható, a H9C2 sejtek hipoxiának való kitettsége a TUNEL-pozitív sejtek számának szignifikáns növekedését okozta a normoxiához képest. A sejtek 50 nM G1-gyel történő kezelése azonban jelentősen csökkentette a hipoxia által kiváltott apoptózist (2A-2B. Ábra).

1. ábra: A G1 dózisfüggő hatása a sejtek túlélésére az oxidatív stressz hatására. A kardiomioblasztok G1-sel történő kezelése dózisfüggő módon megakadályozza a sejtek életképességének H2O2-indukálta csökkenését. A H9C2-t 20 percig előkezeltük G1-gyel (10, 50, 250 nM), majd 4 órán át 400 μM H2O2-nak tettük ki. Az értékek három kísérlet átlagai ± SEM. *** P §§ P 2. ábra: A G1 hatása a hipoxia okozta sejt apoptózisra. A. A H9C2 sejtek reprezentatív fluoreszcens képei 20 n percig 50 nM G1-gyel előkezeltek, majd normoxiának vagy hipoxiának (1% O2) voltak kitéve, majd újra oxigénnel reagáltatták őket. Az apoptózist TUNEL vizsgálattal mértük H9C2 sejtekben 16 órás hipoxia, majd 4 óra reoxigenálás után. B. A TUNEL-pozitív sejtek kvantitatív elemzése H9C2 sejtekben. Az értékek három kísérlet átlagai ± SEM. *** P §§§ P - ) előállítása a MitoSOX Red fluoreszcens szondával. Amint a 3A-3B. Ábra mutatja, a sejtek hipoxiás stressznek való kitettsége az O2-termelés jelentős növekedését okozta a normoxiához képest. Fontos, hogy a H9C2 sejtek 50 nM G1-gyel történő kezelése jelentősen megakadályozta a hipoxia okozta O2-képződést (3A-3B. Ábra).

3. ábra: A G1 hatása a hipoxia által kiváltott mitokondriális O2-termelésre. A. G1 peptiddel előkezelt H9C2 sejtek reprezentatív fluoreszcencia képei. A mitokondriális O2 képződést MitoSOX Red-mel értékeltük H9C2 sejtekben, amelyeket 16 órás hipoxiának, majd 4 óra reoxigenizációnak tettek ki. B. A mitokondriális O2 termelésének kvantitatív elemzése - normoxiának vagy hipoxia-reoxigenizációnak kitett H9C2 sejtekben. Az értékek három kísérlet átlagai ± SEM. *** P §§§ P 4. ábra: A G1 infúzió dózisfüggő hatása az izolált patkány szív funkcionális helyreállítására a reperfúzió végén. A. A tanulmány megtervezése három csoportból áll: 1 - Kontroll; 2 - G1 infúzió iszkémia előtt; 3 - G1 infúzió iszkémia után; L - 5 perces Langendorff-perfúzió 4 ml/perc áramlási sebességgel az iszkémia előtt vagy után; N, működő perfúzió a Neely módszerének megfelelően. B. A G1 peptid hatása a szívteljesítmény (CO) helyreállítására a reperfúzió végén. C. A G1 peptid hatása a kontraktilis funkció intenzitási indexére (bal kamrai fejlett nyomás (LVDP) × pulzus (HR)) helyreállítására a reperfúzió végén. Az értékeket átlag ± SEM értékként fejezzük ki 8 kísérletből.

A szívfunkciós indexeket összehasonlítottuk a reperfúzió végén az optimális G1 koncentráció (240 μM) preischémiás (G1-I) és posztiszchémiás (G1-R) infúzióval az 1. táblázatban. A CO visszanyerése mellett az aorta kimenetének helyreállítása és a stroke térfogata szintén szignifikánsan magasabb volt a G1-R csoportban, mint a G1-I csoportban. Az LVDPxHR termék fokozott helyreállítása mindkét G1 csoportban a HR és LVDP jobb helyreállításának volt köszönhető, összehasonlítva a kontrollal. Az LVDP jelentős növekedését az LV diasztolés nyomás jelentős csökkenése okozta a reperfúzió során. Mindkét G1 csoport a koszorúér áramlásának növekedését mutatta, a koszorúér rezisztencia egyidejű csökkenésével a kontrollhoz képest. Az 1. táblázat adatai azt mutatják, hogy a szívműködés helyreállítása hatékonyabb volt a G1 beadása után a reperfúzió kezdetén.

1. táblázat: 240 μM G1 infúzió hatása a globális ischaemia (G1-R) előtt és után (G1-R) az izolált patkányhő visszanyerésére a reperfúzió végén