A szőlő polifenolok megakadályozzák a fruktóz által kiváltott oxidatív stresszt és inzulinrezisztenciát 2-es típusú cukorbetegek első fokú rokonaiban

M.H. és E.B. egyformán járult hozzá ehhez a munkához

Absztrakt

CÉLKITŰZÉS A szőlő-polifenolok (PP) táplálékmennyiségeinek klinikai hatékonyságának értékelése a magas fruktóz-tartalmú étrend, beleértve az oxidatív stresszt és az inzulinrezisztenciát (IR), metabolikus változásainak ellensúlyozásában magas metabolikus kockázatú egészséges önkénteseknél.

KUTATÁSI TERVEZÉS ÉS MÓDSZEREK A 2-es típusú diabéteszes betegek 38 egészséges túlsúlyos/elhízott első fokú rokonát (18 férfit és 20 nőt) randomizálták kettős-vak kontrollos vizsgálatban egy szőlő PP (2 g/nap) és egy placebo (PCB) csoport között. Az alanyokat a kiindulási helyzetben, valamint 8 és 9 hetes kiegészítés után vizsgálták, az utolsó 6 napban mindegyikük 3 g/kg zsírmentes tömeg/nap fruktózt kapott. Az elsődleges végpont a szőlő PP-k védőhatása volt a fruktóz által indukált IR-re.

EREDMÉNYEK A PCB csoportban a fruktóz 1) a máj inzulinérzékenységi indexének 20% -os csökkenését indukálta (P 2 és a derék kerülete> 80 cm a nőknél és> 94 cm a férfiaknál; -1 perc és -1 inzulin infúziót fogyasztott 120 percig. Glükóz Az infúziós sebességet (GIR) a szorító utolsó 30 percében számoltuk ki. Valamennyi alany kétlépéses inzulinbilincsen esett át (0,2 és 1 mUI kg −1 ⋅ perc –1). Ugyanakkor a szabályozási kérdések miatt csak a 19 a lyoni alanyok (10 PP és 9 PCB) kezdeti 4-h [6,6-2 H2] -glükóz (Eurisotop, St. Aubain, Franciaország) infúziót kaptak a bazális endogén glükóztermelés és gátlásának meghatározása céljából a 0,2 mU ⋅ alatt. kg −1 ⋅ perc −1 inzulin infúzió (14). A befogás során 10 percenként vérmintákat vettek a vércukorszint koncentrációjának monitorozására glükózmérővel (ACCU-CHEK Performa). Az éhomi máj inzulinérzékenységi indexet az Matsuda et al. módszertana (15).

Izombiopsziák

A szorító előtt helyi érzéstelenítésben (lidokain 2%) a vastus lateralis perkután biopsziáját nyertük Lyon Weil Blakesley fogóival (14), vagy Montpellier-ben 5 mm-es Bergstrom tűvel (16). Az izommintát folyékony nitrogénben azonnal lefagyasztották, és további elemzés céljából -80 ° C-on tárolták. A montpellier-i 19 alany esetében (10 PP és 9 PCB) 80 mg izomot permeabilizáltunk a mitokondriális légzés tanulmányozása céljából, és 50 mg-ot 15 percig inkubáltunk PBS-ben 30 ° C-on humán inzulin jelenlétében vagy hiányában (1 µmol/l). ) (Umuline RAPIDE; Lilly France) az inzulinjelzés molekuláris mechanizmusainak tanulmányozására.

Analitikai eljárások

A plazma glükózszintet glükóz-oxidáz módszerrel (AU2700 Olympus; Beckman Coulter, O’Callaghan's Mills, Co. Clare, Írország) és nem észterezett zsírsavakat enzimatikus módszerrel (Wako, Neuss, Németország) mértük. A májenzimeket (AST, ALT és γ-glutamil-transzpeptidáz), az összes koleszterint, a HDL-koleszterint és a triglicerideket spektrofotometriás módszerekkel (AU2700 Olympus; Beckman Coulter) határoztuk meg, az LDL-koleszterint pedig Friedewald-képlettel számítottuk; Az LDL méretét elektroforetikus migrációval határoztuk meg poliakrilamid gélen (Spirale, Dijon, Franciaország).

A plazma inzulint radioimmun vizsgálattal (BI-Insulin IRMA kit; Cis Bio, Gif sur Yvette, Franciaország) mértük. A leptin, a ghrelin, az adiponektin és az rezisztin plazmakoncentrációit ELISA-val (R&D System) és citokineket, köztük interleukin (IL) -1α, IL-1β, IL-6, IL-4, tumor nekrózis faktor-α és Az interferon-y-t a Randox Laboratories (Crumlin, Egyesült Királyság) multiplex Biochip technológiájával határoztuk meg. A hs-CRP koncentrációját immun-turbidimetriával (Randox) határoztuk meg.

Western blotok

Az izommintákat 30 mmol/l HEPES-t, 40 mmol/l NaCl-ot, 5 mmol/l EDTA-t, 2 mmol/l EGTA-t és 210 mmol/l szacharózt tartalmazó lízispufferben homogenizáltuk foszfatázzal és proteáz inhibitorokkal, majd 10 percig centrifugáltuk. 10 000 g. Az alkalmazott primer antitestek közé tartoztak a foszfo-Akt (Ser473) (kat. Sz. 4060; Sejtjelzés), az összes Akt (kat. Szám: 9171; Sejtjelzés) és az UCP3 (AB3044; Millipore). α-Tubulint (T6074; Sigma-Aldrich) használtunk terhelés kontrollként.

Fehérjekarbonilezés és a lipidoxidáció meghatározása a plazmában, szövetekben és vizeletben

Az Oxyblot oxidált fehérje detektáló készletet, amelyet a Chemicontól (Hampshire, Egyesült Királyság) vásároltak, használták az izomfehérje karbonilezési szintjének meghatározására, ahogy azt korábban leírták (17). A lipidperoxidációs szinteket tiobarbitursav-reaktív anyagként (TBARS) mértük a plazmában és a szöveti homogenizátumokban, a korábban leírtak szerint (18), valamint vizelet F2-izoprostánként, amelyet gázkromatográfiával – tömegspektrometriával határoztak meg (Thermofinnigan, Courtaboeuf, Franciaország) (19). Az F2-izoprostán-koncentrációkat a vizelet kreatininjéhez viszonyítva jelentették (Beckman Coulter).

Az antioxidáns aktivitás meghatározása a plazmában és a szövetekben

A vér és a szövet teljes glutationját, a szöveti kataláz/glutation-peroxidázt, valamint a plazma és/vagy a szövet teljes és a mangán-szuperoxid-diszmutázokat (SOD, illetve MnSOD) mértük a korábban leírtak szerint (18).

Mitokondriális funkció és légzés

A mitokondriális légzési változókat in situ elemeztük a frissen permeabilizált vázizomrostokon a Montpellier-be toborzott alanyoknál, a korábban leírtak szerint (16). A bazális (V0) és a maximális (Vmax) légzési arányokat piruvát/malát (10 mmol/l) vagy palmitoil-1-karnitin (40 μmol/l) jelenlétében rögzítettük. A légzési arányokat mikromól O2-ben fejeztük ki percenként per gramm izomrostban.

Citrát szintáz aktivitás

Az izomkivonatokat 10 mmol/l Tris HCl-ban (pH 7,4) homogenizáltuk. A citrát-szintáz aktivitást 0,5 mmol/l oxaloacetáttal, 0,3 mmol/l acetil-CoA-val, 0,1 mmol/l 5,5′-ditiobisz-2-nitro-benzoesavval és 100 mmol/l Tris-HCI-oldattal (pH = 8,0) mértük. Az enzimaktivitást az abszorbancia változásának rögzítésével rögzítettük 412 nm-en 2,5 percen keresztül 37 ° C-on, 37 ° C-on, ahogy Srere javasolta (20), a szövet tömegére normalizálva, és mikromol/perc/gramm szövetben fejezzük ki.

A génexpresszió elemzése

Microarray elemzés.

Az izombiopsziák RNS profilozását Human GE 4 × 44K v2 Microarray kit (Agilent Technologies, Massy, Franciaország) segítségével végeztük. Röviden: a fagyasztott izommintákból izolált 200 ng teljes RNS-t az Applied Biosystems Low Input Quick Amp Labeling kit (CY3) alkalmazásával jelöltünk, és a mikrorakatokat hibridizáltuk és beolvasottuk a gyártó utasításait követve. Az adatokat az Agilent FE egyszínű forgatókönyv (GeneSpring GX szoftver) segítségével normalizáltuk. Szűrés után statisztikai elemzést végeztek 26 220 próbán, a Limma csomaggal (21). Az adatkészlet elérhető a GEO adatbázisból (GSE35764).

RT valós idejű PCR.

Az első szálú cDNS-eket szintetizáltuk 500 ng vázizomból. A teljes RNS-t és a valós idejű PCR-vizsgálatokat a korábban leírtak szerint végeztük (22). Az értékeket hipoxantin-guanin-foszforibozil-transzferáz alkalmazásával normalizáltuk. Az RT-PCR primer szekvenciákat a 2. kiegészítő táblázat tartalmazza.

Statisztikai analízis

A statisztikai elemzést JMP 9.0.0 szoftverrel végeztük, az adatokat átlag ± SEM-ben fejeztük ki. A legtöbb paraméter nem normális eloszlásának leküzdése érdekében elemeztük az adatokat egy ismételt mértékű általános lineáris modell alkalmazásával; amikor a jelentőséget elérték (P 2 és a derék kerülete 80–118 cm a nőknél és 94–113 cm a férfiaknál. A kiinduláskor a csoportok nem különböztek egymástól az antropometriai mérések, az élelmiszer-, energia-, tápanyag- és PP-bevitel vagy a plazma lipidek és glükóz vagy vizelet F2-izoprostánok (1. táblázat). A résztvevők saját beszámolói, valamint a fizikális vizsgálat és a laboratóriumi paraméterek eredményei szerint egyik kiegészítő csoportban sem történt semmilyen mellékhatás. Mivel a magas bélfogyasztás miatt csökkent vas bélfelszívódást jelentettek A PP-k esetén a plazma ferritint mind a felvételkor, mind a vizsgálat végén mértük. Ebben a paraméterben nem figyeltünk meg szignifikáns csökkenést, és a vizsgálat elején vagy végén egyetlen alany sem volt a normál küszöbérték alatt.

Az alanyok jellemzői a kiindulási ponton és az egész tanulmányi látogatás során

A 8 hetes szőlő PP kiegészítésének hatásai

Meglepő módon 8 hetes pótlást követően a vizelet F2-izoprostánjainak és az izom TBARS-értékének csökkenését figyeltük meg a PCB-csoportban, amelyet a szőlő PP-csoportban nem találtunk, a többi mért paraméterre nincs hatással (1. táblázat). Az izomfehérje karbonilációja, valamint az antioxidáns kapacitás, azaz a plazma E-vitamin, a vér glutation-GSSG aránya, az eritrocita SOD, valamint a kataláz, a glutation-peroxidáz (GPx), az SOD és az MnSOD izomenzimaktivitása nem változott (Kiegészítő táblázat 3). A szőlő PP-kiegészítés nem talált szignifikáns hatást a plazma citokinekre (IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-4, tumor nekrózis-faktor és interferon-y), a fő adipokinekre (adiponektin, leptin, és rezisztin), vagy a grelinnel (4. kiegészítő táblázat). Fontos, hogy a hiperinzulinémiás bilincsekkel mért inzulinhatás nem változott (1. táblázat).

A HFrD metabolikus következményei

A fruktózterhelés fő hatásait az 1. táblázat ismerteti. 6 napos HFrD után a PCB csoportban jelentős, 300 g testtömeg-növekedést találtak, a testösszetétel változása nélkül. A HFrD növelte az éhomi trigliceridek számát

Mivel az oxidatív stressz részt vesz a vázizom mitokondriális diszfunkciójában, ideértve a megváltozott biogenezist is (27), csábító arra gondolni, hogy a fruktóz által kiváltott mitokondriális változások összefüggenek az oxidatív stresszel. Adataink, amelyek igazolják, hogy a szőlő PP-pótlása megakadályozza mind az oxidatív stresszt fruktóz jelenlétében, mind a mitokondriális funkció bukását azáltal, hogy a mitokondriális gén expresszió normál szinten tartja a vázizomzatát, alátámasztja ezt a hipotézist.

A szőlő PP-k izmok oxidatív stresszére és mitokondriumaira gyakorolt védőhatása az inzulinérzékenység fenntartásával járt a fruktóz túlterhelés esetén. Negatív összefüggést találtunk a vizelet F2-izoprostánjainak és a GIR fruktóz által kiváltott változásainak a szorítás során, ami összefüggést sugall az oxidatív stressz és a fruktóz által indukált IR között. Ehhez hasonlóan erős negatív összefüggés mutatkozott a GIR és a Vmax palmitoyl-l-karnitin variációk csökkenése között a fruktóz túlterhelés során (r = −0.97), amely erősen támogatta a fruktóz által kiváltott csökkent vázizom mitokondriális funkció és az IR közötti közvetlen kapcsolatot. Ezért a mitokondriális biogenezis elősegítésével, az oxidatív stressz csökkentésével és az oxidatív anyagcsere szétválasztásának megkönnyítésével a szőlő PP-k segíthetnek fenntartani a szubsztrát magas szintű oxidációját, miközben korlátozzák a szabad gyökök termelését, magyarázva azok védőhatását a fruktóz által kiváltott IR vonatkozásában.

A főbb adipokinekre és hormonokra nem volt hatással a szőlő PP-pótlása, ami némileg eltér attól, amit a hiperlipidikus étrendet tápláló patkányokban a patkányoknál táplált patkányokban a CRP-t moduláló szőlőmag-procianidin és az adiponektin plazmaszintjét mutató állatmodellek mutatnak (28 Ez arra utalhat, hogy a jelenlegi tanulmányban a szőlő PP-k közvetlenül hatottak az anyagcsere szövetekre (vázizom és máj) anélkül, hogy a szabályozó tényezők szisztémásan változtak volna.

Bármi legyen is a mechanizmus, a szőlő PP-k IR-re és oxidatív stresszre gyakorolt védőhatása nem társult az éhomi plazma trigliceridek csökkenésével, ami azt jelzi, hogy nem befolyásolta a máj de novo lipogenezisében szerepet játszó metabolikus lépéseket. Meglepő módon a HFrD az LDL-koleszterinszint csökkenésével járt csak a PCB-csoportban. Mindazonáltal az ebben a csoportban található LDL részecskék atherogénebbek voltak, amit a kicsi sűrűségű LDL méret csökkenése tanúsított, amelyet a szőlő PP-k ellensúlyoztak (29).

Annak ellenére, hogy a resveratrol a jelen munkában használt szőlő PP-k nagyon kis részét teszi ki, eredményeink hasonlóságot mutatnak a vegyület metabolikus hatásaival. Valójában, ami az utóbbit illeti, a szőlő PP-k képesek voltak megakadályozni az étrend által kiváltott IR-t és a potenciálisan súlygyarapodást - olyan hatásokat, amelyeket közvetíteni lehet a mitokondriális biogenezis és a PGC-1α aktiváció által másodlagos légzés szabályozásával (30,31). Timmers és mtsai klinikai vizsgálatához hasonló eredményeket is kaptunk. (32) resveratrol alkalmazása, beleértve a jobb funkciójú és megnövekedett PGC-1α-szinttel rendelkező mitokondriális gének szabályozását, elősegítve a mitokondriális biogenezist; a hiperinzulinémiás-euglikémiás bilincs segítségével kiegészítjük ezen szerzők eredményeit, amelyek resveratrol után 11% -os javulást mutatnak a homeosztázis modell értékelési indexében (32).

A szőlő önmagában polifenolokból áll, amelyek többnyire antocianinokból és flavonolokból állnak, beleértve a kvercetint (33), amelyek nagy része számos anyagcsere-egészségügyi hatással is jár (6–8). Annak ellenére, hogy a jelenlegi vizsgálatban alkalmazott 2 g/nap polifenol dózis nagy dózisnak tekinthető, mégis kompatibilis marad a vörös szőlőben, egyéb gyümölcsökben és zöldségekben, valamint végül vörös borban gazdag étrend kínálatával.

Természetéből adódóan a polifenol-keverék használata nem teszi lehetővé azt, hogy egyértelműen azonosítsuk a szőlőkivonat mely összetevői okozzák a megfigyelt hatások egyikét.

Szeretnénk továbbá emlékeztetni arra, hogy a szőlő PP-ket az élelmiszeripar már színezékek és tanninok formájában használja, különösen a cukros ételekben (11). Eredményeink alapot képeznek a PP-k fruktóztartalmú élelmiszerekhez történő közvetlen hozzáadásának hatásait tanulmányozó további munkák mérlegeléséhez.

Összegzésképpen elmondható, hogy a 9 hetes szőlő PP-kiegészítés rendíthetetlen anyagcsere-állapotot biztosít a 2-es típusú cukorbetegek egészséges, túlsúlyos/elhízott első fokú rokonai számára, akik 6 napos fruktóz-túlterhelésnek vannak kitéve, megakadályozva a máj és az izom IR-t, miközben nem jár káros hatással. A jövőbeni tanulmányoknak meg kell vizsgálniuk a szőlő PP fruktózban gazdag feldolgozott élelmiszerekkel történő együttes alkalmazásának hatásait és azok lehetséges szerepét a metabolikus szindróma ellensúlyozásában.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a tanulmányt a Francia Nemzeti Kutatási Ügynökség, az Agence Nationale de la Recherche (PolyOxResist-2007-A01375-48) finanszírozta.

A cikk szempontjából lényeges összeférhetetlenségről nem számoltak be.

A szerzők köszönetet mondanak Languedoc-Roussillon térségének két fő lepárlójának, a Société Française de Distilleries és a GRAP’SUD a szőlőkivonatok biztosításáért.

M.H., E.B., H.V., K.L., M.L. és A.A. adatokat kutatott, hozzájárult a megbeszélésekhez, valamint áttekintette, szerkesztette és megírta a kéziratot. E. M. adatokat kutatott. C.F.-C. és C.C. hozzájárult a megbeszéléshez, áttekintette és szerkesztette a kéziratot. S.P., C.L., S.L.-P., V.S., C.F., J.-F.B. és J.R. kutatták az adatokat. C.B., A.S., J.M., J.G., A.-M.D. és J.-P.C. hozzájárult a megbeszéléshez, áttekintette és szerkesztette a kéziratot. A.A a garancia ennek a munkának, és mint ilyen, teljes hozzáféréssel rendelkezett a vizsgálat összes adatához, és felelősséget vállal az adatok integritásáért és az adatelemzés pontosságáért.

A tanulmány egyes részeit absztrakt formában mutatták be az American Diabetes Association 72. tudományos ülésén, Philadelphia, Pennsylvania, 2012. június 8–12.

A szerzők köszönetet mondanak G. Fourret-nek (INRA UMR 866, Unité Dynamique Musculaire et Métabolisme), M.-C. Granat (Montpellieri Egyetemi Kórház) és C. Bezes (Montpelleri Egyetemi Kórház) technikai támogatásért, valamint A. Coma (Montpellieri Egyetemi Kórház) és A. Cadène (Montpellieri Egyetemi Kórház) a végrehajtással kapcsolatos adminisztratív munkákért. a klinikai gyakorlat bevált gyakorlata a vizsgálat során. A szerzők szintén köszönetet mondanak mindkét felvett alanynak, valamint mindkét vizsgálati központ (Táplálkozási-Diabétesz Tanszék, Montpellieri Egyetemi Kórház és Rhône-Alpes Humán Táplálkozási Kutatóközpont, Egyetemi Kórház) klinikai és kutatócsoportjának tagjainak. Lyon).