Molekuláris
Gyógyszer
Jelentések

  • Journal Home
  • Jelenlegi probléma
  • Közelgő kérdés
  • Legolvasottabb
  • Legtöbbször idézett (dimenziók)
    • Az elmúlt két év
    • Teljes
  • Legtöbbször idézett (CrossRef)
    • Az elmúlt év 0
    • Teljes
  • Közösségi média
    • Múlt hónap
    • Múlt év
    • Teljes
  • Archívum
  • Információ
  • Online benyújtás
  • Információ a szerzőknek
  • Nyelv szerkesztése
  • Információ a bírálók számára
  • Szerkesztési irányelvek
  • Szerkesztőbizottság
  • Célok és hatály
  • Kivonatolás és indexelés
  • Bibliográfiai információk
  • Információ a könyvtárosoknak
  • Információ a hirdetők számára
  • Újranyomtatások és engedélyek
  • Lépjen kapcsolatba a szerkesztővel
  • Általános információ
  • A Spandidosról
  • Konferenciák
  • Munkalehetőségek
  • Kapcsolatba lépni
  • Felhasználási feltételek
  • Szerzői:
    • Weigang Xiao
    • Zhenhua Jia
    • Qiuyan Zhang
    • Cong Wei
    • Hongtao Wang
    • Yiling Wu

  • Ezt a cikket a következők említik:

    Absztrakt

    Az adventitialis VV az előrehaladott érelmeszesedéses plakk-angiogenezis egyik fő forrása, amely felelősséggel tartozik

    gyulladás

    Az intim megvastagodás az artériás fal oxigénhiányának egyik oka, és a hipoxia előrehaladott ateroszklerotikus plakk-angiogenezist is okozhat. Megfigyelték azonban, hogy az érelmeszesedés kezdeti szakaszában megjelenik a VV angiogenezise, ​​amelyet hiperlipidémia vált ki (11). Azt, hogy az angiogenezis ebben az időben összefüggésben áll-e a hipoxiával, és hogy a gyulladás vagy az oxidatív stressz szintje részt vesz-e az angiogenezis ezen formájában, azt még tisztázni kell. Korábbi tanulmányok az ateroszklerotikus lepedék angiogenezisére és a gyógyszeres kezelések ezekre az angiogenezisekre gyakorolt ​​hatására összpontosítottak, míg az érelmeszesedés kezdeti szakaszában az angiogén mechanizmust nem vizsgálták teljes mértékben.

    Jelen tanulmány célja annak felmérése volt, hogy a gyulladás, az oxidatív stressz és a hipoxia egyaránt szerepet játszik-e a korai érelmeszesedéses elváltozások angiogenezisében.

    Anyagok és metódusok

    Állatok

    Az összes állat megsemmisítése és kezelése megfelelt a Kínai Népköztársaság Tudományos és Technológiai Minisztériumának állatgazdálkodási szabályainak (398. dokumentáció, 2006.), és a kísérleti protokollt a Hebei Orvostudományi Egyetem (Shijiazhuang) Állatgondozási Bizottsága hagyta jóvá., Kína). Összesen 24 új-zélandi nyulat, egyenlő számú hím és nőstény, 2,2 ± 0,3 kg tömegű nyerettel szereztek be a pekingi Fuhao kísérleti állatközpontból (II. Osztály, SCXK JING2010-0010 tanúsítással; Peking, Kína). Hebei tartomány (Shijiazhuang, Kína) kulcsfontosságú laboratóriumának Állatgondozási Központja. A nyulakat véletlenszerűen két, egyenként 12 állatból álló csoportba osztottuk, adaptív takarmánnyal történő beadás után (Hebei tartományi kísérleti állatközpont, Shijiazhuang, Kína) 2 hétig. A negatív kontrollcsoportba tartozó nyulakat (n = 12) normál táplálékkal etették 4 hétig. A hiperkoleszterinémiás étrendcsoportot (HC; n = 12) 4 hétig magas koleszterinszintű étrendet (normál étrendet 1% koleszterinnel, 7,5% sárgájporral és 5% zsíros olajjal kiegészítve) táplálták. Minden állat ad libitum hozzáférést kapott az ivóvízhez, és 12 órás világos/sötét cirkadián ritmusban volt.

    Mintagyűjtés és feldolgozás

    A kísérlet befejeztével az éjszakai éhgyomri után vérmintákat vettünk a peremfenék vénájából, és az összes állatot feláldoztuk nátrium-pentobarbitál (100 mg/kg) túladagolásával. Ezt követően minden csoportból két nyulat választottak véletlenszerűen az egész aorta olaj-vörös O festésére (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kína). 20 állatból visszamaradt hasi aortákat gyorsan eltávolítottuk, és két részre vágtuk. Az első szegmens, amelyet a proximális végből kapunk

    A membrántól 1 cm-re lefelé 4% paraformaldehidben, 0,01 M foszfátpufferben (pH 7,4) fixáltuk fiziológiás nyomáson az ezt követő hipoxia-indukálható faktor (HIF) -1α és a differenciálódási klaszter (CD) 34 immunhisztokémiai festés céljából. A fennmaradó szegmenst folyékony nitrogénben azonnal átfagyasztották a molekuláris értékeléshez.

    Biokémiai vizsgálat

    A szérumot centrifugálással állítottuk elő 1 930 x g-vel 10 percig. A szérum összes koleszterin (TC), trigliceridek (TG), nagy sűrűségű lipoprotein koleszterin (HDL-C) és LDL-koleszterin (LDL-C) szinteket automatikus biokémiai analizátorral (Hitachi 7080; Hitachi Co., Tokió, Japán) határoztuk meg. ). A szérum nitrogén-oxid (NO) szintjét nitrát-reduktáz módszerrel vizsgáltuk, egy NO detektáló készletet alkalmazva (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kína), amelyet a gyártó utasításainak megfelelően használtunk. Ezzel egyidejűleg a szérum endothelin-1 (ET-1) szintjét meghatároztuk egy érzékeny enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálati készlet segítségével (Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság).

    Hisztomorfológiai és immunhisztokémiai festés
    Szövettani elemzés

    A tárgylemezeket Leica DM6000B mikroszkóppal (Leica, Wetzlar, Németország) szkenneltük. A mikrovérek kézi számlálását egyetlen profi megfigyelő végezte vakon. Mindegyik mikrovér egyetlen lumenként volt definiálva, amelyet egy endothelsejt-réteg vesz körül, amelyet az anti-CD34 antitesttel végzett immunfestés jelez. A vonatkozó szakirodalom (15) alapján minden szakaszon megszámláltuk a vaszkuláris falon átvezető szakasz mikrotérjeit (Q) és a referencia területeket (A) (nagyítás, × 200). A két ábra arányát a mikrovér sűrűségének (Q A) tekintettük, és az érfal keresztmetszeti területének mikrovérként/mm 2 -ben fejeztük ki, a következő egyenlet felhasználásával számítva: Q A = Q/A.

    Western-blotolás a HIF-1α, a nukleáris faktor (NF) -KB, a tumor nekrózis faktor (TNF) -α, az interleukin (IL) -6, a nukleáris faktor (eritroid eredetű 2) -szerű 2 (Nrf2), γ-glutamilcisztein-szintetáz esetében (γ-GCS) és hem-oxigenáz (HO) -1
    Fordított transzkripció-kvantitatív polimeráz láncreakció (RT-qPCR)

    A szövetmintákat folyékony nitrogénnel lefagyasztottuk. A teljes RNS-t TRIzol reagenssel extraháltuk (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). A teljes RNS-t 756 ultraibolya spektrofotométerrel (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) számszerűsítettük, és reverz átírást alkalmaztunk primerekkel az M-MLV reverz transzkriptáz rendszer (Promega Corporation, Madison, WI, USA) segítségével. A HIF-1α, NF-κB, TNF-α, IL-6, Nrf2, γ-GCS és HO-1 mRNS expresszióját az érfalakban RT-qPCR segítségével vizsgáltuk az ABI 7300 Real-Time PCR rendszer segítségével (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA) a gyártó utasításainak megfelelően. A primer szekvenciákat az I. táblázat tartalmazza. A mennyiségi értékeket a küszöbérték ciklusértékéből (Ct) kaptuk. Egy belső kontrollt, a GAPDH-t használtuk az egyes minták célgénjeinek relatív kvantitatív értékeinek kiszámításához.

    I. táblázat

    A reverz transzkripció-kvantitatív polimeráz láncreakcióban alkalmazott primer szekvenciák.

    I. táblázat

    A reverz transzkripció-kvantitatív polimeráz láncreakcióban alkalmazott primer szekvenciák.

    Gén-alapozó szekvencia (5′-3 ′) Termék (bp)
    HIF-1α
    Érzék CCTGCCTCTGAATCTCCAA 147
    Antisense AGAAGGACTTGCTGGCTGA
    NF-κB
    Érzék GGCTTGCGTTCAGATGTTG 73.
    Antisense AACCGTCTTGTTGCTCTTGA
    TNF-a
    Érzék AGTAGCAAACCCGCAAGTG 148
    Antisense GCTGAAGAGAACCTGGGAGTA
    IL-6
    Érzék AACCAGTGGCTGAAGACGA 62
    Antisense TCCAGGAAGTTTGTGAGGC
    Nrf2
    Érzék TTCTTTCGGCAGCATCCT 62
    Antisense TGGCATTTGAGTTCACGC
    γ-GCS
    Érzék ACCTCCTCCAAACTCCGAT 102
    Antisense AGCACCACAAACACCACATAG
    HO-1
    Érzék GCCACCAAGTTCAAGCAG 88
    Antisense TAGCCTCTTCCACCACCCT
    GAPDH
    Érzék AGAGATTGTGCGGGATGTC 92
    Antisense CCAGTGAGGAAGATGCTGCT

    [i] HIF, hipoxia-indukálható faktor; NF, nukleáris tényező; TNF, tumor nekrózis faktor; IL, interleukin; Nrf2, nukleáris faktor (eritroid eredetű 2) -szerű 2; GCS, glutamil-cisztein-szintetáz; HO, hem-oxigenáz.

    Statisztikai analízis

    II. Táblázat

    A szérum lipidek, NO és ET-1 szintjének összehasonlítása a kísérleti csoportokban.

    II. Táblázat

    A szérum lipidek, NO és ET-1 szintjének összehasonlítása a kísérleti csoportokban.

    TC csoport (mmol/l) TG (mmol/l) HDL-C (mmol/l) LDL-C (mmol/l) NO (µmol/l) ET-1 (pg/ml)
    N 3,28 ± 0,93 0,76 ± 0,17 0,68 ± 0,17 1,80 ± 0,59 17,22 ± 2,66 46,99 ± 5,13
    HC 39,96 ± 6,13 a 3,99 ± 0,78 a 3,77 ± 0,96 a 26,76 ± 4,67 a 13,06 ± 1,85 a 59,89 ± 5,51 a

    1.ábra

    A hasi aorta festése. Egész aorta olaj-vörös O festés, amely az aorta endotheliális felületét simává és fehérvé teszi. (A) Normál étrendcsoport és (B) HC-csoport vörösre festett zsíros csíkokkal (sztereoszkópikus mikroszkóp; nagyítás, × 40; skálasávok, 200 µm). Színes mikroszkópos felvételek, amelyek demonstrálják a hasi aorta reprezentatív H&E festését és immunfestését anti-HIF-1α antitesttel (fénymikroszkóp; nagyítás, × 200). (C) Az Intima sima a normál étrendben. (D) Habsejtképződés a HC csoportban. Az anti-HIF-1α antitest expressziója az (F) HC csoportban hasonló volt (E) a normál étrend csoportjához. Egyik csoportban sem figyeltek meg kifejezett barna pozitív expressziót (skálasávok, 100 µm). HC, magas koleszterinszintű étrendcsoport; HIF, hypoxia-indukálható faktor; H&E, hematoxilin és eozin.

    Mikrovessel sűrűség a hasi aorta falán

    2. ábra

    3. ábra

    4. ábra

    A HIF-1α, NF-κB, TNF-α, IL-6, Nrf2, γ-GCS és HO-1 mRNS expressziós szintjei a nyúl hasi aortáiban, reverz transzkripció-kvantitatív polimeráz láncreakcióval jelezve. A HIF-1α mRNS, NF-KB mRNS és Nrf2 mRNS expressziója nem különbözött szignifikánsan az N étrend és a HC étrend csoport között. A TNF-a mRNS és az IL-6 mRNS expressziója magasabb volt, míg a γ-GCS és HO-1 mRNS expressziója alacsonyabb volt a HC csoportban. Minden adatot a GAPDH mRNS-hez viszonyítva standardizáltunk. A célgének RQ értékeit az átlag ± szórás, * P in vivo értékeként fejezzük ki (23,24). Az aktivált NF-κB csökkenti az NO biológiai hozzáférhetőségét és stimulálja az ET-1 expresszióját, amely később hozzájárul az artériás fal mikro-angiogeneziséhez (25). Jelen eredmények azt igazolták, hogy a hiperlipidémia képes növelni az NF-κB, TNF-α és IL-6 nyúl hasi aorta fehérje szintjét, és szabályozni tudja a TNF-α és az IL-6 mRNS expresszióját, ami arra utal, hogy a gyulladásos válasz szerepet játszik az angiogén folyamat az érelmeszesedés kezdeti szakaszában.

    Tudomásul kell venni a jelen tanulmány korlátait a tervezés és a módszerek tekintetében. Például a nyúl artériájának falán a HIF-1α szintet, a gyulladásos faktorokat és az antioxidánsokkal összefüggő faktorokat csak 4 hét magas koleszterinszintű etetés után figyelték meg, ezért ezeket a paramétereket nem figyelték folyamatosan. Az érelmeszesedéses elváltozás további fejlődésével, beleértve az artériás fal megvastagodását és a növekvő oxigénfogyasztást, hipoxiás állapotok jelenhetnek meg. Ezenkívül nem vizsgálták, hogy a vizsgált nyulak koszorúerében, nyaki artériájában vagy más artériáiban, vagy más állatmodellekben ugyanazok a változások voltak-e a gén és a fehérje expressziójában. A különböző jelátviteli utak miatt különbségek lehetnek a fajok vagy az érágyak között, ami viszont különböző angiogén mechanizmusokat vonhat maga után az érelmeszesedés kialakulása és progressziója során. Ezért a jelen vizsgálat eredményeit különféle vaszkuláris ágyakban és alternatív állatmodellekben kell értékelni. Jövőbeni vizsgálataink célja ezeknek a kérdéseknek a kezelése.

    Jelen adatok azt jelezték, hogy a hipoxia nem nyilvánvaló az artériás falban a hiperlipidémia által kiváltott érelmeszesedéses elváltozások kialakulásának kezdeti szakaszában. A gyulladásos markerek szintjének növekedése és az antioxidáns funkció csökkenése valószínűleg ebben a szakaszban az artériás falon belüli angiogenezis fő tényezői. Meg kell vizsgálni az érelmeszesedés alapvető kóros mechanizmusát a szív- és érrendszeri és cerebrovaszkuláris betegségek megelőzése érdekében, és hatékonyabb beavatkozási stratégiákat kell kidolgozni.

    Köszönetnyilvánítás

    Jelen tanulmányt a Kínai Nemzeti Kutatási Alapprogram (973) támogatta (támogatás száma: 2012CB518606).

    Hivatkozások

    Ross R: Atherosclerosis - gyulladásos betegség. N Engl J Med. 340: 115–126. 1999. Cikk megtekintése: Google Scholar: PubMed/NCBI