Az 1-es szuperoxid-diszmutáz fibrillációs prekurzora a fehérje-hajtogatási egyensúly fokozatos beállításával tárult fel

  • Keresse meg ezt a szerzőt a Google Tudósban
  • Keresse meg ezt a szerzőt a PubMed oldalon
  • Keresse meg ezt a szerzőt ezen a webhelyen
  • Levelezés céljából: [email protected]

Szerkesztette: Alan R. Fersht, MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, Egyesült Királyság, és jóváhagyta 2012. május 30-án (áttekintésre 2012. március 1-én érkezett)

prekurzora

Absztrakt

Eredmények és vita

Fehérjék.

A vizsgált apoSOD1 variánsok kristályszerkezetei és fibrillamorfológiái. Az intakt C57 – C146 térhálósított apoSOD1 monomer (apoSOD1 C57 – C146), a TCEP megfelelő fehérje redukált C57 és C146 csoportokkal (apoSOD1 SH SH), valamint a fehérjével eltávolított IV (zöld) és VII hurokkal rendelkező változat mérnöki munka (apoSOD1 ΔIV ΔVII). A PDX 2XJK bejegyzéséből felépített szerkezetek. A megfelelő fehérjefibrillák EM-mikrográfiái, tiszta pH 6,3 pufferben, 37 ° C-on történő keverés útján. A skálasávok 200 nm-esek.

A hajtogatási egyensúly beállítása.

A kérdés tehát az, hogy az SOD1 hordónak mennyire kell felszakadnia - vagy kibontakoznia - ahhoz, hogy fibrillációs kompetenciává váljon. Ennek kiderítésére fokozatosan destabilizáltuk az SOD1 szerkezetét karbamid-titrálással, miközben az aggregációs kinetikán mértük a választ. Az őshonos (N) és a kibontakozott fajok (D) koncentrációját minden karbamidkoncentrációnál standard kétállapot-analízissel határoztuk meg (12, 21, 22, 24, 25).

Összecsukási és fibrillációs adatok. (A) Az apoSOD1 C57 – C146, az apoSOD1 SH SH és az apoSOD1 ΔIV ΔVII Chevron-diagramjai, amelyek log kf és log ku illesztését mutatják [Eq. 8.]. A kibontakozó végtagok görbületei magas [karbamid] esetén az átmeneti állapot eltolódásai vagy a natív állapot kopása miatt következnek be, és kizárták őket a rohamokból. A szaggatott vonal jelzi a karbamid koncentrációt, ahol D eléri a teljes foglaltságot. Az egységek s -1-ben vannak. (B) D koncentrációja a fibrillációs vizsgálatokban az apoSOD1 ΔIV ΔVII chevron adatai alapján számítva. A teljes fehérjekoncentráció 25 μM, és az egységek M.-ban vannak megadva. (C) Az apoSOD1 ΔIV ΔVII és [karbamid] (nyitott körök) fibrillációs késleltetési ideje (τlag), amelyet a fibrillációs időfolyamatokból származtak, az SI Text, Fibrillation Analysis Idő tanfolyamok. A log τlag belső [karbamid] függését a globálisan kibontakozott állapot (D) teljes kihasználtságánál mértük 4 M karbamid felett. Ennek a [karbamid] -függésnek a kivonásával közvetlen kapcsolatot kapunk a log τlag és a log [D] (zárt körök) között. Ilyen körülmények között ∂ log τlag/∂ [karbamid] = mτlag = 0,13 ± 0,06. Az egységek s-ben vannak. (D) Megfelelő adatok és normalizálási eljárás az apoSOD1 ΔIV ΔVII nyúlási sebességi állandóira (νmax). ∂ log νmax/∂ [karbamid] = mν max = -0,17 ± 0,05. Az egységek s -1-ben vannak .

Kinetikai paraméterek és fehérje stabilitás. A sebességállandók s -1 egységekben vannak megadva

Kétállapotú magatartás igazolása heteronukleáris egykvantum-korreláció (HSQC) NMR-rel.

A fibrillációs kinetika karbamid-függőségének elszámolása.

Bizonyíték a töredezettséggel segített fibrillációra.

A fibrillációs késleltetési idő (log τlag) és a megnyúlási sebességi állandó (log νmax) lineáris függőségeket mutat a globálisan kibontakozott apoSOD1 ΔIV ΔVII (log [D]) logaritmizált koncentrációjától. A ∂ log τlag/∂ log [D] = -0,47 ± 0,03 és a ∂ log νmax/∂ log [D] = 0,56 ± 0,03 egyező meredekségek az Eqs szerinti töredezettséggel támogatott mechanizmust sugallják. 3 és 5.. A log τlag kontra log νmax és τlag vs. νmax ábrák (Inset). Karbamid-titrálás (zárt körök) és mutagenezis (nyitott körök) adatai.

Karbamid-függőség és fibrilláció m-értékei.

Az apoSOD1 ΔIV ΔVII fibrillációs folyamat további megvilágítására az νmax és a τlag karbamid-függőségeit használtuk, amelyek tükrözik az alapul szolgáló mikroszkópos reakciólépések oldószerrel elérhető felületének változását. A 2. ábra denaturált alapvonalaiból ∂ log νmax/∂ [karbamid] = mν max = -0,17 ± 0,05 és and log τlag/∂ [karbamid] = mτlag = 0,13 ± 0,06 (2. ábra). Az mνmax és mτlag illeszkedő abszolút értékei további alátámasztást jelentenek a közös κ méretezési tényező létezésére, amint arra az egyenletek. 4 és 5.. Fontos, hogy ez a méretezési tényező lehetővé teszi számunkra, hogy a k + és k- mikroszkopikus sebességállandókat ugyanazon fogalmi keretek között vizsgáljuk, mint a hajtogatási kinetika (4. ábra). Az ilyen vizsgálat eredményeit az SI Text, Fibrillation m-értékek ismertetik, és arra utalnak, hogy a SOD1 ΔIV ΔVII szekvencia (azaz 2–4 β-szál) 30–50% -a a fibril struktúrájában temetkezik, a megnyúlási gát (‡ megnyúlás) m -/+ mentén (4. ábra). Érdekes módon ez a becslés jól egyezik a tömegspektroszkópia korábbi adataival, amelyek 3-5 β-szál fibrilláris szegmenseit mutatják (6). Ebből a célból az mν max és az mτlag viszonylag alacsony értékei azt mutatják, hogy az SOD1 fibrillák tartós növekedése magas [karbamid] mellett nem feltétlenül jelenti a termék kivételes stabilitását, hanem a denaturálószerekre mutatott alacsony érzékenységből is származhat.

Az apoSOD1 ΔIV ΔVII kétágú hajtogatási és fibrillációs szabadenergia-profiljainak sematikus ábrázolása. A reakció koordinátája az oldószerhez hozzáférhető felület, amelyet az 1. táblázat m-értékeivel és az SI Text, Fibrillation m-értékeivel mérünk. A profilok jelzik azt az esetet, amikor a hajtás és a fibrilláció átmeneti állapota (‡ hajtás és ‡ megnyúlás) szimmetrikusan helyezkedik el. Az egyszerűség kedvéért a fibrilláris állapot (A), a kibontott monomer (D) és az összehajtott fehérje (N) stabilitása normalizálódik, és a gátmagasságok nem skálázhatók. I * az a nagy energiájú köztitermék, amelyet az NMR megfigyelt 0 M karbamidnál (16, 23).

Mutációs elemzés e-szkenneléssel.

Az apoSOD1 ΔIV ΔVII fibrillációs kinetika vizsgálata E-szkenneléssel, teljesen denaturáló körülmények között, 5 M karbamid mellett. (A) Nem normalizált gamma-eloszlásokkal illesztett mutáns késleltetési idők (τlag) hisztogramjai (2. táblázat). Ál-vad típusú (fekete) és mutánsok (piros és zöld). (B) Az E mutációk szekvenciapozíciói. (C) Az E mutációk szerkezeti helyzete (narancssárga). A pozitív és negatív töltésű oldalláncok kék, illetve piros színnel vannak feltüntetve.

A fibrillációs késleltetési idők (τlag) és a nettó töltés és a hidrofobicitás paraméterei közötti összefüggés megváltozik. (A) τlag a nettó töltéstől való általános lineáris függőséget mutat, összhangban a fehérje-fehérje kölcsönhatások általános viselkedésével, a séma szerint 2 (34) ApoSOD1 ΔIV ΔVII (-3), E-scan mutánsok (-4 - -6) és apoSOD1 C57 – C146/apoSOD1 SH SH (-8). (B) A τlag diagramja az apoSOD1 ΔIV ΔVII mutánsok számára, normalizált nettó töltéssel -5 a helyi hidrofobicitás változása ellen (2. táblázat). A kiugró érték a V5E/V7E β1 mutáció, amely egyedülálló, mivel nincs hatása a τlagra. A 0,85 R-érték a β1 mérés nélkül van.

A fibrillációs kinetika paraméterei 5 M karbamidnál

Összefoglalás és következtetések.

Anyagok

Mutagenezis, expresszió, tisztítás és kísérleti körülmények.

A mutagenezis, az expresszió és a tisztítás a (22, 23) -ben leírtak szerint történt, és minden kísérletet 37 ° C-on, 10 mM Bis-Tris-ben, pH 6,3 mellett végeztünk, hacsak másképp nem jelezzük.

Elektronmikroszkópia.

Szénnel bevont 200 mesh rézrácsokat vittünk fel 20 μl fibril készítmény csepp tetejére, és 5 percig blottoltuk. A festést 1% (tömeg/térfogat) uranil-acetáttal végeztük. 18 000 × nagyítású képeket rögzítettünk egy Tecnai G 2 Spirit BioTWIN mikroszkóppal, amelynek volfrámszála 80 kV feszültségen működött.

Kinetika összecsukása.

A fehérje végső koncentrációja 4 μM volt, a karbamid-fok ultratiszta volt (MP Biomedicals, Inc.). A kinetikai méréseket PiStar-180 leállított áramlású készülékkel (Applied Photophysics, Leatherhead, Egyesült Királyság) vagy Varian Cary Eclipse spektrométeren (Santa Clara, Kalifornia) végzett manuális keveréssel végeztük, 280 nm-es gerjesztéssel és 305 nm hosszúságú emisszióval. -ass szűrő vagy monokromátorral 360 nm-en. A redukcióhoz 2,0 mM Tris (2-karboxi-etil) -foszfint (TCEP) adtunk az összes pufferhez és egy éjszakán át inkubáltuk. A Chevron-adatot [8] illesztettük, ahol a kobs a megfigyelt sebességi állandó és az Eqs-ben meghatározott paraméterek. 1 és 2. Az adatok elemzése a KaleidaGraph-szal történt (Synergy Software, Reading, PA).

Fibrillációs kinetika.

A fibrillációt 37 ° C-on mértük standard 3,5 ml-es küvettákban Varian Cary Eclipse spektrométerben (Santa Clara, Kalifornia), teflonnal bevont mágneses keverőkkel, 1800 fordulat/perc sebességgel. A minta térfogata 2 ml volt, és 25 μM fehérjét és 20 μM ThT-t tartalmazott 10 mM Bis-Tris-ben, pH 6,3 és változó [karbamid] mellett. A redukció 0,5 mM TCEP-vel történt. A ThT gerjesztés 444 nm-nél, az emisszió 485 nm-nél történt, és az inkubáció minden 300 másodpercében mértük. Az adatok kezelése standard eljárásokkal történt, ahogy azt a SI Text, a fibrillációs időtanfolyamok elemzése leírja.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát a Svéd Kutatási Tanács, a Knut és Alice Wallenberg Alapítvány, a Bertil Hållsten Alapítvány és a Hjärnfonden támogatta. Ezt a munkát a kutatási infrastruktúrához való hozzáférés az EK 7. keretprogramjában (Projektszám: 261863, Bio-NMR) is támogatta a kutatás CERM-en történő elvégzéséhez. Köszönjük Daniel Schaalnak és Ingrid Calone-nak a projekt korai hozzájárulását.

Lábjegyzetek

  • ↵ 1 Kinek kell címezni a levelezést. E-mail: mikael.olivebergdbb.su.se .