A tiazid-érzékeny társ-transzporter elősegíti a nátrium-visszatartás kialakulását étrend okozta elhízással rendelkező egerekben

Prof. David A. Power

nátrium-visszatartás

Nefrológiai Osztály, Austini Kórház, Studley Road, Heidelberg 3084,

Victoria (Ausztrália), tel. (00613) 94965634, Fax (613) 94965123

Kapcsolódó cikkek a következőhöz: "

  • Facebook
  • Twitter
  • LinkedIn
  • Email

Absztrakt

Bevezetés

Az elhízással kapcsolatos hipertóniát (ORH) a keringő térfogat növekedése jellemzi a vese nátrium-visszatartása miatt [1]. Az étrend által kiváltott elhízás (DIO) állatmodelljei kimutatták, hogy a magas zsírtartalmú étrend (HFD) táplálásának megkezdése pozitív nátriumegyensúly állapotához vezet [2]. A nátrium-visszatartás ezen kezdeti periódusát követően új egyensúlyi állapot érhető el, amelyben a vérnyomás megemelkedik, de a nátrium egyensúlya semlegesre tér vissza. A nátriumfelesleg azonban a vérnyomás emelkedése ellenére sem ürül ki a nyomás-natriuresis mechanizmus visszaállítása miatt [1]. Ezért vannak különálló periódusok, amikor a nátrium-túlterhelés először létrejön, majd az ebből eredő magas vérnyomás ellenére fennmarad. Míg mindkét folyamat magában foglalja a nátrium [1,3,4] fokozott tubuláris visszaszívódását, nem ismert, hogy ugyanazok a tubuláris mechanizmusok felelősek-e mindkét fázisért.

A bumetanid-érzékeny kotransporter, az NKCC2 és a tiazid-érzékeny kotransporter, az NCC, a kation-klorid társ-transzporter család tagjai. Az NKCC2 a Henle hurokban, az NCC pedig a disztális tekercselt tubulusban található. Ők felelősek a szűrt nátrium körülbelül 20% -ának, illetve 5-10% -ának visszaszívódásáért bazális körülmények között [5]. Az amilorid-érzékeny ioncsatorna, az ENaC, megtalálható a gyűjtőcsatornában, és a szűrt nátrium körülbelül 3% -ának visszaszívódásáért felelős. Az α, β és γ alegységek heterotrimerként létezik [6].

Nemrégiben bebizonyítottuk, hogy 14 hetes HFD-etetés után a C57Bl/6 egereknek fokozott az NKCC2 aktivitása ennek a kotranszporternek a fokozott foszforilációja miatt [7]. Ebben az időpontban az egereknél magas vérnyomás alakult ki. Feltételeztük, hogy valószínűleg különböző tubuláris mechanizmusok vesznek részt az ORH létrehozásában korábban, a pozitív nátriumegyensúly időszakában. A jelen tanulmányban ezért megvizsgáltuk a legfontosabb disztális nátrium-transzporterek profilját azoknál az egereknél, akik HFD-vel tápláltak a korábbi 3 hetes időpontban, a magas vérnyomás megjelenése előtt. Ezzel azt reméltük, hogy meghatározzuk azokat a nátrium-transzportereket, amelyek felelősek a HFD-re reagálva a nátrium-túlterhelés megállapításában.

Anyagok és metódusok

Antitestek

Nyúlantitesteket (Ab) pNCCT58 és pNKCC2T96/T101 [8] és pNKCC2S126 [9] korábban leírtak. Az NKCC1/2 elleni „T4” egeret a Developmental Studies Hybridoma Bank-tól (University of Iowa, USA) szereztük be. Az α-ENaC, β-ENaC és y-ENaC elleni nyúl Abs-t a StressMarq Biosciences Inc.-től (BC, Kanada) szereztük be. Az NCC elleni nyúl Abs-t és a p (383/325) SPAK/OSR1-et Merck Millipore-tól (Darmstadt, Németország) szereztük be. A béta-tubulin elleni nyúl antitesteket Sigma Aldrich-től (MO, USA) és a pAMPK-t a Cell Signaling-től (MA, USA) szereztük be.

Állatok

A C57BL/6 egereket specifikus kórokozótól mentes körülmények között tartottuk 12 órás fény/12 órás sötét ciklus alatt, és az összes eljárást az Austini Egészségügyi Állatetikai Bizottság által előírt előírásoknak megfelelően hajtottuk végre. Az állatok ingyenes hozzáférést kaptak az élelemhez és a vízhez. Az egér-diétákat a Nyugat-Ausztráliában található Specialty Feeds-től szereztük be. Az egereket 3 hétig kontroll (5% zsírsavval módosított AIN93G) vagy magas zsírtartalmú (23% zsírmódosított AIN93G étrend (43% zsírtartalmú energia), NaCl 15% -os növekedésével) táplálékkal etettük 3 hétig. A magas zsírtartalmú étrend nátrium-klorid-tartalma 15% -kal volt magasabb, mint a kontroll étrendben, hogy megfeleljen a csoportok közötti nátrium-klorid-bevitelnek (korábban megállapítottuk, hogy az egerek körülbelül 15% -kal kevesebb táplálékot fogyasztanak a HFD-ben).

A testtömegeket hetente és a befejezéskor mértük. Az érzéstelenített állatokból a veséket eltávolítottuk és folyékony nitrogénben lefagyasztottuk.

Vérnyomás

A szisztolés vérnyomást nem invazív módon mértük 11 hetes egereknél, akik 3 hétig kontroll (n = 8) vagy magas zsírtartalmú étrenden (n = 8) voltak, a Life Science (Woodlands, CA, USA) farok segítségével. mandzsetta pletizmográfiai berendezések és szoftverek. Az anesztetizált egereket 2 nappal a technikához akklimatizáljuk az elemzéshez használt felvételek előtt. Minden egér után három egymást követő leolvasást végeztünk. A vérnyomás-felvételhez használt egereket nem használták szövetanalízis-kísérletekben.

Western blot elemzés

A veséket gyorsan kivágták és folyékony nitrogénben lefagyasztották. A veséket (n = 8 csoportonként) keresztirányban kettévágtuk. A kéreget felszabadítottuk a felső pólusról a kérgi készítmények előállításához. A vese alsó felét „egész vese” (kéreg és medulla) készítményekhez használták. A lizátumokat üveg-üveg Dounce homogenizátorral készítettük lízispufferben (50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 50 mM nátrium-fluorid, 5 mM nátrium-pirofoszfát, 1 mM nátrium-ortovanadát, 1% (w/v) NP-40, 0,27 M szacharóz, 0,1% (v/v) 2-merkaptoetanol és proteázgátló koktél (1 tabletta/10 ml; Roche Diagnostics, Basil, Svájc). A homogenizátumokat 10 000 g-vel 15 percig 4 ° C-on centrifugáltuk és fehérje koncentráció a felülúszókban Bradford-módszerrel (Bio-Rad protein assay kit) mértük. A homogenizátumokat -80 ° C-on tároltuk, amíg szükséges volt. Az NKCC2 immunprecipitációit T4 antitest és a HFD-ből származó teljes vese-lizátumok azonos fehérjekoncentrációival hajtottuk végre. diétás egerek: Anti-egér IgG-agarózt alkalmaztunk immunkomplexumok immunprecipitálására (Sigma Aldrich, MO, USA).

A mintákat SDS-PAGE-vel elválasztottuk, és elektromosan átvittük egy polivinilidén-difluorid membránra (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) Bio-Rad Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) alkalmazásával. A membránt 10% BSA-ban Tris-pufferolt sóoldatban (TBS) blokkoltuk 1 órán át, majd primer antitestben inkubáltuk. Minden antitestre meghatároztuk az optimális antitestkoncentrációt és az inkubálás időtartamát. TBS-0,05% Tween 20-mal végzett mosás után a membránt 30 percig inkubáltuk FITC-konjugált szekunder antitestben (Dako, Glostrup, Dánia). Antitest komplexeket detektáltunk anti-FITC POD-val (Roche Diagnostics, Basil, Svájc). Az immunreaktív fehérjéket fokozott kemilumineszcenciával detektáltuk a Western Lightning rendszerrel (PerkinElmer, MA, USA). Ha a membránt egy másik primer antitesttel próbáltuk megvizsgálni, a membránhoz kötött meglévő ellenanyagot 15 percig Reblot sztrippelő oldatban (Chemicon, MA USA) inkubáltuk. A Western-blotok mennyiségi meghatározását denzitometriával, az Image J szoftver segítségével végzett elemzéssel (NIH, Bethesda, MD, USA).

Natriuretikai vizsgálatok

Az NCC in vivo aktivitásának mérésére 11 hetes egereknek, akik HFD-n (n = 7) vagy kontroll étrenden (n = 5) voltak, 50 mg/kg hidroklorotiazid intraperitoneális injekcióit adták (Sigma Aldrich, MO, USA) 20 ml/kg sóoldatban. Az egereket metabolikus ketrecekbe helyeztük, és a vizeletet 3 órán át gyűjtöttük. 3 nappal azelőtt vizeletet gyűjtöttünk azonos térfogatú hordozó (sóoldat) IP-injekciói után. A nátrium-, kálium- és kreatinin-koncentrációt Roche Hitachi Cobas c-sorozatú autoanalízissel mértük. A hidroklorotiazid utáni nátrium/kreatinin arányt összehasonlítottuk az alapszinttel, hogy az NCC relatív in vivo aktivitásának markerét kapjuk.

Valós idejű kvantitatív RT-PCR

A teljes RNS-t teljes egér vesemintákból tisztítottuk (n = 8 csoportonként) TRIzol reagens (Invitrogen) alkalmazásával, a gyártó utasításainak megfelelően. Az RNS minőségét és mennyiségét spektrofotometriával határoztuk meg, és reverz átírást végeztünk nagy kapacitású cDNS reverz transzkripciós készlet alkalmazásával (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia). A valós idejű PCR a következő primereket használta: NCC: 5ʹ-CGAGAGTAATCCAGCAGTA-3ʹ és 5ʹ-ATGAAGAGATTAACAAGAACAGAA-3ʹ és 18S (háztartási gén): 5ʹ-AGTCCCTGCCCTTTGTACACA-3ʹ és 5ʹ-GATCCACTAGGG. Valós idejű PCR-t hajtottunk végre egy Stratagene MX-3000-en Solis Biodyne Evagreen master keverékkel (Tartu, Észtország) a gyártó utasításainak megfelelően. Az alapozó hatékonyságát standard hígítással mértük, és a relatív expresszió kiszámításához a Pfaffl módszert [10] alkalmaztuk. Az eredményeket a kontroll étrendet kapó vad típusú egerekhez viszonyítva ötszörös expresszióként fejezzük ki.

Statisztika

A statisztikákat az Instat 3.05 verzióval (GraphPadSoftware, San Diego, Kalifornia) használtuk. Az adatokat átlag ± SD-ként adjuk meg. Az RT-PCR-t az átlag standard hibájaként mutatjuk be. Két csoport átlagainak összehasonlítását párosítatlan t-teszttel végeztük. P értéke