A többkomponensű gyógyszeres lymphomyosot javítja a kísérleti lymphedema eredményét

Alex P. Keim

1 Orvostudományi Tanszék, Michigani Műszaki Egyetem, Houghton, Michigan.

Justin R. Slis

1 Orvostechnikai Tanszék, Michigani Műszaki Egyetem, Houghton, Michigan.

Uziel Mendez

1 Orvostudományi Tanszék, Michigani Műszaki Egyetem, Houghton, Michigan.

Emily M. Stroup

1 Orvostudományi Tanszék, Michigani Műszaki Egyetem, Houghton, Michigan.

Yvonne Burmeister

3 Biologische Heilmittel Heel GmbH, Baden-Baden, Németország.

Natalie Tsolaki

4 Scheibenhardt, Németország.

Oliver Gailing

2 Erdészeti Tanszék, Michigani Műszaki Egyetem, Houghton, Michigan.

Jeremy Goldman

1 Orvostudományi Tanszék, Michigani Műszaki Egyetem, Houghton, Michigan.

Absztrakt

Háttér

A másodlagos lymphedema egy élethosszig tartó fájdalmas szövetduzzanat, amely gyakran az axilláris nyirokcsomók disszekcióját követi az emlőrák kezelésére. Feltételezzük, hogy a sebgyógyulási folyamat során az obstruktív hegszöveten keresztüli gyenge nyirokregeneráció hajlamosíthatja a szövetet egy későbbi duzzadásra. A lymphedema kezelése továbbra sem optimális, és a legtöbb esetben palliatív. Ennek a vizsgálatnak az volt a célja, hogy értékelje a Lymphomyosot képességét a szövetek duzzadásának kezelésére és a lymphangiogenesis elősegítésére egér lymphedema kísérleti modelljeiben.

Mód

Az egér lymphedema kísérleti modelljeihez különböző mennyiségű Lymphomyosot és sóoldatot injektáltunk kontrollként. Méréseket végeztünk a farok duzzadásával és a seb bezáródásával, és összehasonlítottuk a csoportok között. Három külön egércsoportot elemeztünk a nyirokkapilláris migráció, a nyirokerek regenerációja és a makrofágok toborzása szempontjából.

Eredmények

A Lymphomyosot jelentősen csökkentette a duzzanatot és megnövelte a sebészeti seb bezáródásának sebességét. A lymphomyosot nem növelte a nyirokkapillárisok migrációját egér farok bőrregenerációs modelljében vagy a nyirokerek regenerálódását az egér axilláris nyirokcsomó disszekciót követően.

Következtetések

A lymphomyosot gyulladásos és sebjavító utakon keresztül léphet fel a kísérleti lymphedema csökkentése érdekében. Képessége a gyulladás szabályozására, valamint a szövetek helyreállításában és az extracelluláris képződésben segítséget nyújthat egy hegmentes mátrix híd előállításához, amelyen keresztül a vándorló sejtek és a felhalmozódott intersticiális folyadék szabadon terjedhetnek.

Bevezetés

A szekondary lymphedema egy egész életen át tartó betegség, amely fokozott folyadékretencióval, szövetduzzadással és a csökkent nyirokelvezetés miatt károsodott immunfunkcióval jár. A limfödéma gyakran az axilláris nyirokcsomók disszekciója után fordul elő az emlőrák kezelésére. 1 Ez az emlőrák és kezelésének egyik leggyakoribb hosszú távú mellékhatása, és általában több évvel az eredeti nyirokrendszeri sérülés gyógyulása után alakul ki. Különböző tanulmányok szerint az emlőrákot túlélők 30–60% -a számol be a lymphedema tüneteiről. 2 Annak ellenére, hogy a sebészeti technikák nemrégiben fejlődtek, például az őrszemcsomó biopsziát alkalmazták a stádiumban, szemben a teljes hónaljcsomó disszekcióval, a lymphedema kockázata csökkent, de nem szűnt meg. 1,3 Ezenkívül mind a mastectomia, mind a konzervatív műtét betegeknél hasonló arányban alakul ki lymphedema. 4 A fejlődését szabályozó mechanizmusok nagyrészt ismeretlenek, így továbbra sem világos, miért alakul ki egyes betegeknél lymphedema, másoknál pedig azonos kezelés nélkül. 5.

A limfödéma gyakran az emlődaganatot túlélők számára súlyos korlátokat tapasztal a mindennapi tevékenységekben, ami mérhetően befolyásolja általános életminőségüket. Pontosabban, a lymphedemában szenvedő nők fogyatékosabbak, a felső végtag tüneteiről számolnak be (váll- vagy karfájdalom) és a kar mozgásának nehézségeiről, az operált emlő fájdalmáról és duzzanatáról, visszatérő fertőzésekről és magasabb pszichés distresszről. 5,6 A lymphedema kezelése továbbra sem optimális, és a legtöbb esetben palliatív, célja a betegség progressziójának megakadályozása, nem pedig gyógyítás. 5 Jelenleg nincsenek olyan farmakológiai kezelések, amelyek javíthatnák a nyirok helyreállítását az emlőrák műtétje után. Széles körben alkalmaznak nem gyógyító módszereket a duzzanat kezelésére a megjelenése után, például kompressziós ruhák és kézi nyirokelvezetési terápia. 5,7

Fontos felismerni, hogy az axilláris disszekció nemcsak a hónalji nyirokereket és a hozzájuk kapcsolódó nyirokcsomókat távolítja el, hanem a környező lágy szövetek rengetegét is, ezáltal nagy üreg keletkezik a hónaljban. A műtétet a nyirokrendszeren keresztüli daganatos áttétek megelőzésére, a nyirokrendszerben található daganatos sejtek eltávolítására és a későbbi kezelések daganat stádiumának meghatározására törekszenek. Az ezt követő sebjavítási folyamat a hónaljüreg belsejében azonban gyakran fibrotikus szövetek kialakulásához és hegesedéshez vezet. Megállapították, hogy a fibrotikus szövetek gátolják a nyirokregenerációt és az intersticiális áramlást, ami hajlamosíthatja a szövetet az áramlási irányban a nyálkahártya-ödéma torzító megvastagodására és krónikus fertőzésére. 5,8,9 Ezért a seb helyének természetes gyógyulásának javítását célzó kezelések közvetett módon növelhetik a lymphangiogenesist és az intersticiális folyadékelvezetést, és megakadályozhatják vagy csökkenthetik a másodlagos lymphedema előfordulását. 8–12 Jelenleg nincs olyan vényköteles gyógyszer, amely a fibrotikus hegek megelőzésében vagy kezelésében sikeres lenne. 13,14

A Lymphomyosot többkomponensű/többcélú gyógyszeres kezelés számos megfigyelési tanulmányban kimutatta, hogy gyulladásos utakon hat és csökkenti a trombotikus vagy gyulladásos etiológia szöveti ödémáját. 30–33 Egyéb extrakciós formákban és dózisokban lévő összetevőiről kimutatták, hogy szabályozzák a gyulladást, 34–40, valamint segítik a szövetek helyreállítását és az extracelluláris mátrixképződést a mátrix metalloproteinázok szabályozásán, a fibroblaszt aktiválásán és a kollagén szintézisén keresztül. 41–45 A Lymphomyosot hatásmechanizmusa és hatékonysága a lymphedema kezelésében nem egyértelmű. Itt a lymphedema és a lymphangiogenesis bevált kísérleti modelljeit használtuk annak tisztázására, hogy a Lymphomyosot a funkcionális nyirokregeneráció, a gyulladás vagy a seb helyreállításának támogatásával csökkenti-e a szövetek duzzadását.

Anyagok és metódusok

Kísérleti gyógyszer

A Lymphomyosot N (Biologische Heilmittel Heel GmbH, Baden-Baden, Németország) egy többkomponensű, erősen hígított összetevőket tartalmazó gyógyszer. Egy ampulla (1 ml Lymphomyosot injekcióhoz szükséges folyadékot tartalmaz) 0,55 mg Gentiana lutea D5-t, 0,55 mg Pinus sylvestris D4-et, 0,55 mg Scrophularia nodosa D3-ot, 0,55 mg Equisetum hiemale D4-et, 1,1 mg Ferrum jodatum D12-et, 0,55 mg Calcium phosphoricum D12-t tartalmaz., 0,55 mg Aranea diadematus D6, 0,55 mg Fumaria officinalis D4, 1,1 mg Geranium robertianum D4, 0,55 mg Levothyroxinum D12, 1,1 mg Nasturtium officinale D4, 0,55 mg Natrium sulfuricum D4, 0,55 mg Sarsaparillae radix D6, 0,55 mg Myosotis5 arvensis Teucrium scorodonia D3, 0,55 mg Veronica officinalis D3, nátrium-klorid és víz. Valamennyi komponenst az Európai Gyógyszerkönyvnek megfelelően állítjuk elő. 46 A Lymphomyosot az emberi nyirokbetegségek kezelésére ajánlott 30,33, akut esetekben napi 1 ampulla és egyébként heti 1-3 ampulla alkalmazásával. A kísérletekhez a Lymphomyosot-t és a kontrollokat intraperitoneálisan adtuk be, állatokonként 5, 25 vagy 50 μL-es adagokban.

Kísérleti modellek

Nőstény balb/c egereket (Jackson Labs; 6–8 hét) használtunk. Az egereket 2,5% izofluránnal altattuk oxigéngázzal keverve a sebészeti beavatkozásokhoz, és a kísérleti végpontokban CO2 elfojtással elöltük őket. Az összes protokollt a Michigani Műszaki Egyetem Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá. A kísérletekhez használt összes egeret randomizálták, a sebész vakon kezelte a kezelést.

1. modell. Farok lymphedema: normális sebgyógyulás

A farokbőrödémát balb/c egerekben úgy alakítottuk ki, hogy egy 1 mm-es körkörös dermis sávot (amely a nyirokkapilláris hálózatot tartalmazta) kivágtuk a farok tövétől 2 cm-re, az alatta lévő csont, izom, inak és a fő erek elhagyva. ép, hasonlóan a korábbi vizsgálatokhoz. Az 47–49 egereket négy csoportra osztottuk (csoportonként 10 egér) a farok duzzadásának és a seb bezáródásának mérésére, és 5, 25 vagy 50 μl i.p. Lymphomyosot vagy 50 μl fiziológiás sóoldat injekciói a műtét napján, majd minden második napon a 30. napon történő eutanizálásig. Az egerek külön csoportját három csoportra osztották (csoportonként 10 egér), és 25 vagy 50 μl i.p. Lymphomyosot vagy 50 μl fiziológiás sóoldat injekciói a műtét napján, majd minden második nap a 9. napon történő eutanizálásig, a makrofágok toborzásának elemzése céljából a duzzadt farok bőrében.

Modell 2. Farok lymphedema: fedett sebgyógyulás

A farokbőrödéma hegmentes/fokozott szövetjavító modelljét hozták létre balb/c egerekben a dermisz eltávolításával a fent leírtak szerint, a regeneráló régiót 2 cm-rel a farok alá helyezve. A sérülést követően a seb területét szorosan illeszkedő, gázáteresztő szilikon hüvely borította, hasonlóan a korábbi vizsgálatokhoz. 14,50–55 A hüvely védte a sérülés helyét, lehetővé téve a szövet gyorsabb és viszonylag hegmentes helyreállítását. Egy fedett, kör alakú seb elhelyezése a faroknál 2 cm-rel a 10. napon nem eredményezte a distalis farok bőrének ödémáját. Az egereket két csoportra osztottuk (csoportonként 10 egér), és 25 μl i.p. Lymphomyosot vagy fiziológiás sóoldat injekciói a műtét napján, majd minden második nap a 10. napon történő eutanizálásig a nyirokkapilláris migráció elemzésére.

3. modell. Mellső láb lymphedema

A lymphedema egér mellső modelljét előállítottuk a korábban leírtak szerint. 56 Balb/c egeret oxigéngázzal kevert 2,5% izofluránnal altattunk. A dermiszen keresztül egy 5 mm hosszú műtéti bemetszést helyeztek a jobb oldali axillára, majd azonosították és kivágták az axilláris nyirokcsomókat, valamint a pre- és poszt-nodalis gyűjtőerek látható részeivel együtt egy Olympus SZX7 sztereo mikroszkóp alatt. A dermist 6-0 varratszállal varrtuk (Harvard Apparatus, Holliston, MA), és az egereket hagytuk helyreállni a 10. vagy a 15. napig. Az egereket két csoportra osztottuk (csoportonként 10 egér), és 25 μl i.p. Lymphomyosot vagy fiziológiás sóoldat injekciói a műtét napján, majd minden másnap az eutanizálásig a 10. napon (csoportonként 5 egér) és a 15. napon (csoportonként 5 egér) az IC-Green képalkotáshoz és a nyirokerek regenerációjának elemzéséhez.

Immunfluoreszcencia és immunhisztokémia

A 2. modell farkmintáit 10 vagy 100 μm hosszanti krioszekciókra vágtuk és immunfestést készítettünk. A farok kriosekcióinak immunfestése a nyirokerek endothelialis hyaluronan receptor-1 (LYVE-1) elleni antitestekkel folytatódott a vastag metszetekben a nyirok endothel sejtek (LEC) kimutatása céljából. A nyirokspecifikus hyaluronan receptor LYVE-1 (R&D Systems) elleni poliklonális kecske antitestet és Alexa Fluor 488 szamár kecske szekunder antitestet (Invitrogen) alkalmaztunk. Makrofágokat detektáltunk az egér farok bőrének 10 μm-es kriozekcióiban az F4/80 makrofág-specifikus marker jelölésével. Biotinilezett anti F4/80 antitestet (Serotec) alkalmaztunk Alexa Fluor 555 konjugált sztreptavidinnel (Invitrogen) együtt. A LYVE-1 és F4/80 jelölt metszetek sejtmagjait 4 ', 6-diamino-2-fenilindollal (DAPI; Vector Laboratories, Burlingame, CA) ellenfestettük.

Élettani mérések

Az egér farok képeit a fedetlen regeneráló bőr lymphedema modellből 3 naponta rögzítettük minden egér faroknál egy sztereo mikroszkópra szerelt DP71 színes kamerával. A farok duzzadását a Metamorph szoftverrel (Molecular Devices) határoztuk meg, megmérve a farok átmérőjét a duzzadt farok digitális képeitől a seb helyéhez képest a legduzzadtabb helyen. A sebzáródást a farok hossztengelye mentén mértük, mint a distalis és a proximális regeneráló szövet közötti távolságot a seb helyén. A makrofág százalékos lefedettséget a sebtől távolabb eső duzzadt bőrön határoztuk meg F4/80-jelölt szövetszakaszokban, Metamorph szoftverrel végzett küszöbérték-analízissel.

Funkcionális nyirokerek képalkotása IC-Green fluoreszcencia limfográfiával

Nemrégiben kifejlesztett képalkotó rendszert alkalmaztunk funkcionális nyirokerek és nyirokcsomók kimutatására az egér mellső lábán. 58–60 Öt mikroliter 5 mg/ml-es oldatban a közeli infravörös fluoreszcens Indocyanine Green festéket (ICG; Akorn) injektáltunk az egér mancsába. Az ICG detektálását elektronszorzó töltést kapcsolt eszközzel (CCD) végeztük (Hamamatsu, C9100-13). Az ICG-t 760 nm-es LED-ek tömbjével (Epitex Inc) világítottuk meg, egy 760 nm-es sáváteresztő szűrő (760FS10-50, Andover Corporation) elé helyezve, hogy gerjesztő fényt kapjanak az ICG aktiválásához. Egy 785 nm-es és 763 nm-es egyedi gyártású holografikus bevágási sáv elutasító szűrőt (HNPF-785.0-2.0 és HNPF-763.0-2.0 modell, Kaiser Optical Systems) és egy 830 nm képminőségű sávszűrőt (830FS20-25, Andover Corporation modell) a kamera lencséje elé helyezzük, hogy szelektíven elutasítsuk a gerjesztő fényt, és átadjuk a kibocsátott 830 nm hullámhosszat.

statisztikai módszerek

Legalább öt állatot használtunk az egyes adatpontokhoz. Tíz állatot használtak a legtöbb adatponthoz. Az adatokat standard deviációjú átlagként mutatjuk be. A P értékeket ANOVA vagy Student t-teszt alkalmazásával számítottuk ki, a jelzésnek megfelelően.

Eredmények

Csökkent szövetduzzanat Lymphomyosot adagolással

A lymphomyosot nem befolyásolja a nyirokkapillárisok vagy a nyirokerek regenerálódását

A lymphomyosot nem növeli a nyirokkapillárisok lymphangiogenesisét. Az egér farokbőrében a limfödémát a bőr 1 mm széles műtéti kivágása indukálta, amelyet szilikon mandzsetta védett. A 10 napos műtét utáni farok bőréből származó LYVE-1 jelzett (zöld színű) vastag krio-metszetek képei 25 μl sóoldattal kezelt egereknél láthatók (A) vagy drog (B). Skála a jobb alsó panelen = 0,5 mm. A függőleges fehér szaggatott vonal be A és B jelzi a distalis határt a natív és a regeneráló szövet között. A grafikon a nyirokkapilláris migrációjának távolságát mutatja a regeneráló régióba a sóoldattal és a gyógyszerrel kezelt csoportokban (C). E csoportok között nem volt statisztikai különbség; n = 10. Ennek az ábrának a színes változata elérhető a www.liebertpub.com/lrb internetes cikkben.

A lymphomyosot nem növeli a nyirokerek limfangiogenézisét. Az axilláris nyirokcsomókat eltávolítottuk az egérből, és az elülső láb nyirokereit IC-zöld lymphangiográfiával ábrázoltuk. Egy nem működtetett vezérlő mellső láb látható (A), operált egér mellső lábak, amelyek 25 μl sóoldatot kaptak a 10. napon (B) és a 15. nap (D), és operált egér mellső lábak, amelyek 25 μL gyógyszert kaptak a 10. napon (C) és a 15. nap (E). A sárga nyíl a hónalj fluoreszcencia jelét azonosítja; n = 5 csoportonként. Ennek az ábrának a színes változata elérhető a www.liebertpub.com/lrb internetes cikkben.

A lymphomyosot modulálja a duzzadt szövet makrofág infiltrációját

Sárga szőr elszíneződés. A sóoldattal kezelt egereknek az eutanizálás után azonnal gyűjtött képek (A), 5 μL gyógyszer (B), 25 μL gyógyszer (C), vagy 50 μL gyógyszer (D) szokatlan dózistól függő sárgás elszíneződési mintát ábrázol; n = 10 csoportonként. Ennek az ábrának a színes változata elérhető a www.liebertpub.com/lrb internetes cikkben.

Vita

A felső végtag másodlagos lymphedema gyakran annak a műtéti beavatkozásnak a következménye, amely eltávolítja a nyirokcsomókat, a nyirokgyűjtő ereket és a környező szöveteket az axillából az emlőrák kezelésére és a másodlagos áttétek kockázatának csökkentésére tett erőfeszítéssel. Feltételezik, hogy a lymphedema a műtét helyén kialakuló fibrotikus heg egész gyenge nyirokregenerációja miatt alakul ki. 9–12,50 Ezért a sebjavítást javító és a hegesedést csökkentő terápiák hatékonyak lehetnek a műtét utáni lymphedema kialakulásának csökkentésére.

A sebjavítás egy bonyolult és jól összehangolt biológiai folyamat, amely három egymást követő fázisból áll: gyulladás, proliferáció/granuláció és átalakítás. 15,20 A granulociták és makrofágok beáramlása által termelt növekedési faktorok és mediátorok széles skálájával a gyulladásos fázis az, amely, ha nem oldódik meg és nem áll helyre gyulladás előtti állapotában, felesleges hegesedéshez, fibrózishoz és krónikus gyulladásos betegséghez vezet. 15,21,23 Az akut gyulladás korai szakaszában olyan események fordulnak elő, amelyek aktív és összehangolt szanálási programot folytatnak (pl. Áttérés speciális sejtközi hírvivők helyi termelésére, programozott leukocita halál apoptózissal és a haldokló sejtek ezt követő fagociták általi eltávolítása), vagyis felelős a gyulladás előtti állapot és a homeosztázis helyreállításáért. 17,24,25 A Lymphomyosot többkomponensű gyógyszer ezen utak közül egyet vagy többet célozhatott meg. E vizsgálat eredményei arra utalnak, hogy a Lymphomyosot-ban található anyagok modulálhatják a gyulladásos választ és/vagy elősegíthetik a sebgyógyulást. 34,36,38,42,44

A másodlagos lymphedema kialakulásához hozzájáruló különféle utak megléte rámutat az ilyen multitargetáló gyógyszerek szükségességére. A Lymphomyosot 16 különböző fő összetevője által közvetített variáns (szinergikus és additív) hatások arra utalnak, hogy a műtétek után ezt a gyógyszert támogató kezelésként alkalmazzák. Az olyan folyamatokat, mint a gyulladás, a vízelvezetés és a szövetek átalakítása, egyszerre célozzák és modulálják alacsony dózisokban, kevés mellékhatással. A Lymphomyosot új szisztémás vagy helyi gyógyszert nyújthat a sebterápiára vagy a bőr helyreállítására a gyógyulási arány és a minőség javítása érdekében, és hatása a gyulladás modulálására elősegítheti a krónikus gyulladásos állapotok megelőzését, valamint a hegesedés és a fibrózis megelőzését.

Perspektíva

A másodlagos lymphedema feltételezései szerint az emlődaganat kezelésében a műtét helyén kialakuló fibrotikus heg gyenge nyirokregenerációja miatt alakul ki. Kimutatták, hogy a felnőttkori sebek helyreállításának komplexitását, valamint a másodlagos lymphedemában megjelenő többszörös sejtes és extracelluláris útját közvetlenül befolyásolja a Lymphomyosot multitargetáló gyógyszer. A gyulladás, a vízelvezetés és a szövetek átalakításának alapjául szolgáló folyamatokat egyszerre célozták meg és modulálták alacsony dózisokban, kevés mellékhatással. Ezek az eredmények lehetőséget nyújtanak arra, hogy feltárják azokat a lehetséges terápiás hatásokat, amelyeket a Lymphomyosot új szisztémás vagy helyi gyógyszerként jelenthet a sebterápiában vagy a bőr helyreállításában a gyógyulás sebességének és minőségének javítása érdekében.