A triazavirin hatása a halálos influenza fertőzés és a szekunder bakteriális tüdőgyulladás kimenetelére egerekben

doi: 10.18527/2500-2236-2017-4-1-52-57

kapott: 2017-12-01 elfogadott: 2018-02-09 közzétett: 2018-02-22

Irina A. Leneva 1 #, Irina N. Falynskova 1, Nailya R. Makhmudova 1, Ekaterina A. Glubokova 1, Nadezhda P. Kartashova 1, Eugenia I. Leonova 1, Natalya A. Mikhailova 1, Irina V. Shestakova 2

1 Mechnikov Vakcinakutató Intézet és Sera, Moszkva, Orosz Föderáció
2 Jevdokimov Állami Orvostudományi és Fogorvosi Egyetem, Moszkva, Oroszország
# Levelező szerző: Irina Leneva, e-mail: [email protected]

Absztrakt

Bevezetés

Az új eredeti gyógyszer, amely a vegyületek azoloazin-osztályába tartozik, a triazavirin (a purin nukleotid guanin analógja), Oroszországban engedélyezett [15]. Ezt a gyógyszert az Urali Állami Műszaki Egyetem (Jekatyerinburg, Oroszország), a Postovsky Organic Synthesis Institute (Jekatyerinburg, Oroszország) és az Influenza Kutatóintézet (Szentpétervár, Oroszország) közösen fejlesztette ki. A Тriazavirine széles antivirális aktivitási spektrummal rendelkezik, és számos akut légúti vírusfertőzés, köztük az A és B influenza ellen is hatásos. A projekt célja a triazavirin hatékonyságának vizsgálata egerek influenzáját követő másodlagos bakteriális tüdőgyulladással szemben.

Anyagok és metódusok

Vegyületek

A triazavirint (2-metiltio-6-nitro-1,2,4-triazolo [5,1-c] -1,2,4-triazin-7 (4I´) -on) a Medsynthesis (Oroszország) biztosította (ábra 1A) [15].

Az oseltamivir-foszfát (etil- (3R, 4R, 5S) -4-acetamido-5-amino-3- (pentán-3-il-oxi) -ciklohex-1-én-1-karboxilát-foszfát) (1B. Ábra) a Chemical ajándéka volt. Diversity, Inc. (San-Diego, USA). Umifenovir (etil-6-bróm-4 - [(dimetilamino) metil] -5-hidroxi-1-metil-2 - [(feniltio) metil)] - 1 H-indol-3-karboxilát) (1C. Ábra) szolgáltatta Pharmstandard (Oroszország). Az oseltamivir-foszfátot és a triazavirint steril desztillált vízben oldjuk. Az egereknek történő orális beadáshoz az umifenovirt 1% keményítőoldatban szuszpendáltuk. Minden kísérlethez a frissen készített gyógyszeres oldatokat használtuk.

Sejtek és influenza vírusok

A Madin Darby kutya vesesejteket (MDCK) 37 ° C-on 5% CO2 nedvesített atmoszférában növesztettük minimális esszenciális táptalajban (MEM), kiegészítve 10% marha magzati szérummal (FBS), 5 mM L-glutaminnal, 25 mM HEPES-sel, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml sztreptomicin-szulfát és 100 μg/ml kanamicin-szulfát. Az A/Kalifornia/04/2009 (H1N1) pdm09 (A/CA/04/09) influenza vírust a WHO együttműködő központja - Influenza Kutatóintézet (Szentpétervár, Oroszország) biztosította. A vírust embrionált csirke tojásokban (CE) szaporították. A vírus fertőző titerét CE-ben történő titrálással határoztuk meg, és az embrionált fertőző dózisok decimális logaritmusaként fejeztük ki (log10EID50/ml). Az S. aureus 1986 törzset a Mechnikov Vaccines Institute and Sera (Moszkva, Oroszország) gyűjteményéből nyertük. A baktériumokat triptikus szója agaron szaporítottuk.

A gyógyszer hatékonyságának értékelése egérmodellekben

Az Orosz Tudományos Akadémia (Andreevka, Moszkva régió, Oroszország) körülbelül 12–14 g tömegű BALB/c nőstény egereit karanténba helyeztük és 3 napig akklimatizáltuk a felhasználás előtt. Az egereket ketrecekben helyezték el, és 13 állatból álló csoportokban kezelték őket. Valamennyi tanulmányt a Mechnikov Vakcinakutató Intézet és a Sera Állatkísérleti Etikai Bizottság hagyta jóvá, és szigorúan az alkalmazandó törvényeknek és irányelveknek megfelelően hajtották végre.

Állati fertőzéshez egérrel adaptált A/CA/04/09 vírust kaptunk 3 egymást követő passzálással az egér tüdejében. Az influenza fertőzés elleni gyógyszerek hatékonyságának tanulmányozása érdekében az egereket intranazálisan (azaz egyénileg) fertőztük egér letális dózisával (MLD80/0,1 ml), amely egyenlő 4,0 log10EID50/0,1 ml) A/CA/04/09 vírussal. Az influenzát követő másodlagos bakteriális tüdőgyulladással foglalkozó kísérletekben az állatokat i.n. 0,5 MLD50/0,1 ml egérrel adaptált A/CA/04/09 vírussal. Az S. aureus törzseket egy éjszakán át triptikus szójalevesben 37 ° C-on növesztettük, és felhasználás előtt steril PBS-sel hígítottuk 2x1010 telepképző egységre (CFU/0,1 ml). A S. aureus fertőzést i.n. a vírusfertőzés utáni 4. napon. A fertőző ágensek intranazális bejuttatása előtt az állatokat éterrel enyhén érzéstelenítettük.

Tüdővizsgálat

Minden csoportból 3 egeret eutanizáltak a vírus utáni 4. vagy 7. napon a csak vírussal, illetve a vírussal és a baktériumokkal fertőzött csoportokból. Meghatároztuk a vírustitereket és a baktériumok számát a tüdőben. A tüdőhomogenátumokat elkészítettük, 10 g-nál 5 percig centrifugáltuk, és a felülúszókat használtuk a vírustiterek és/vagy baktériumszám meghatározásához. A S. aureus telepek mennyiségi meghatározását a tüdő felülúszójának tízszeres hígításával végeztük triptikus szója agarlemezekre, kiegészítve 3% juh eritrocitákkal (térfogat/térfogat). A telepek azonosítását szemrevételezéssel végeztük. A vírustitereket tüdőhomogenátumok titrálásával határoztuk meg MDCK sejtrétegeken, és a szövetkultúra fertőző dózisainak decimális logaritmusaként fejeztük ki (log10TCID50/ml).

Eredmények

A triazavirin hatékonysága influenza vírussal fertőzött egerekben

Kezelés

MSD

A vírustiter a tüdőben a 4. napon p.i.,
log10TCID50/ml a

Baktériumsűrűség a tüdőben,
CFU/ml a

1. A/CA/04/09 + S. aureus + triazavirin 25 mg/kg/nap

2. A/CA/04/09 + S. aureus + triazavirin 50 mg/kg/nap

3. A/CA/04/09 + S. aureus + triazavirin 100 mg/kg/nap

4. A/CA/04/09 + S. aureus + oseltamivir 10 mg/kg/nap

5. A/CA/04/09 + S. aureus + umifenovir 60 mg/kg/nap

6. A/CA/04/09 + S. aureus

a Az adatokat M ± SD-ben adjuk meg.
(†) A különbség szignifikáns, ha csak az A/CA/04/09 vírussal fertőzött csoporthoz hasonlítjuk, Student's t-teszt, p

A tüdőgyulladás gyakran szövődményként fordul elő az influenza fertőzés után, és a szezonális és járványos influenza kitörésekkel járó morbiditás és halálozás nagy részét teszi ki [5, 7]. Önmagában az antibiotikum-terápia nem biztos, hogy ez a kettős fertőzés a leghatékonyabb kezelés. Az antivirális terápiát azonban gyakran figyelmen kívül hagyták, mivel a vírusfertőzések általában a bakteriális tüdőgyulladás mire megszűnnek. Korábban kimutatták, hogy az oseltamivirrel és az umifenovirral végzett antivirális kezelés javítja a szekunder bakteriális tüdőgyulladás kimenetelét in uenza után egérmodellben [12-14]. A klinikai vizsgálatok is megerősítették ezt a hatást, és kimutatták, hogy az influenza antivirális kezelése csökkenti az influenza utáni szövődmények kockázatát [16].

Jelen tanulmányban a vírusellenes vegyületet, a triazavirint, influenza utáni szekunder bakteriális tüdőgyulladás egérmodelljében tesztelték, összehasonlítva az influenza tüdőgyulladás egér modelljével. A triazavirinnal végzett kezelés az egér letális influenza modelljében nem volt túl hatékony, és csak a legalacsonyabb 25 mg/kg/nap dózis mellett vezetett az állatok túlélési arányának statisztikailag szignifikáns javulásához és az átlagos túlélési idő meghosszabbításához. A triazavirin ebben a dózisban történő beadása megakadályozta a fertőzött állatok súlyvesztését is. A triazavirin-kezelés hatékonysága a gyógyszer dózisának növekedésével csökkent, és 100 mg/kg/nap adagolással - a vizsgált dózisok közül a legmagasabb - a triazavirin ebben a modellben egyáltalán nem volt hatékony.

A triazavirinnel két modellben megfigyelt különbség a gyógyszer hatásmechanizmusával is magyarázható. Amint azt korábban bemutattuk [15], a triazavirin, mint guanin analóg, szelektív inhibitora az ﬂ uenza RNS polimeráz komplexeknek. Ezen kívül van néhány adat pleiotróp hatásmechanizmusáról. Kimutatták, hogy a triazavirin befolyásolja a modellpeptid (SI) amiloid-szerű ﬁ briljeinek képződését, amely meghatározza a konformációs betegségek patogenezisét [17]. Ezenkívül az amiloidszerű oligomerek jelátalakítóként is működhetnek egészséges és fertőzött organizmusokban [18].

Az influenza-bakteriális együttfertőzés egy multifaktoriális folyamat, amely a vírusok és baktériumok különböző patogén tényezőit, valamint a gazdaszervezet válaszait veszi részt. Mindezeket a tényezőket figyelembe kell venni ezen együttfertőzések előfordulásának és patogenitásának mérlegelésekor. Az állatmodellekkel végzett kísérletek javították annak megértését, hogy az influenza vírusok miként lépnek kölcsönhatásba bakteriális ko-kórokozóikkal, és a kísérő gazda immunválaszával kapcsolatban. E kísérletek eredményei azt mutatták, hogy az aberrált immunválasz súlyos gyulladáshoz vezet, amely az influenza után a baktériumok megszerzésének és a fertőzés súlyosságának egyik fő hajtóereje [5, 11].

Ezért az olyan vírusellenes szerek, mint a triazavirin, amelyek elnyomják a vírus replikációját és jelentősen növelik a kombinált vírussal rendelkező állatok túlélését - a bakteriális fertőzés csökkentheti a gazdaszervezet másodlagos bakteriális fertőzésének súlyosságát, és új módszer lehet a megelőzés megelőzésére. és kezelni az influenzával társult bakteriális társfertőzéseket. További vizsgálatok szükségesek ennek a hatásnak az emberekben történő megerősítéséhez.

Összeférhetetlenség

A szerzők nem jelentenek be kereskedelmi vagy pénzügyi összeférhetetlenséget.