A DAS181, egy új szialidáz fúziós fehérje, védi az egereket a halálos madárinfluenza H5N1 vírusfertőzéstől

DÖF. és X.L. egyformán járult hozzá ehhez a munkához.

Jessica A. Belser, Xiuhua Lu, Kristy J. Szretter, Xiaoping Jin, Laura M. Aschenbrenner, Alice Lee, Stephen Hawley, Do Hyong Kim, Michael P. Malakhov, Mang Yu, Fang Fang, Jacqueline M. Katz, DAS181, A Új szialidáz-fúziós fehérje, Védi az egereket a halálos madárinfluenza H5N1 vírusfertőzés ellen, The Journal of Infectious Diseases, 196. évfolyam, 10. szám, 2007. november 15., 1493–1499. Oldal, https://doi.org/10.1086/522609

Absztrakt

A jelenleg rendelkezésre álló influenza vírusellenes szerekkel szembeni növekvő rezisztencia rávilágít arra, hogy alternatív megközelítéseket kell kidolgozni az influenza megelőzésére és/vagy kezelésére. A DAS181 (Fludase), egy új szialidáz fúziós fehérje, amely enzimatikusan eltávolítja a sziálsavakat a légzőszervi hámból, erős antivirális aktivitást mutat az A és B influenza vírusok ellen. Itt egérmodellt használunk a DAS181 kezelés erősen patogén madárinfluenza H5N1 vírus elleni hatékonyságának értékelésére. Ha az egereket az A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) vírussal való fertőzés előtt 1 nappal kezdik, akkor a DAS181 1 mg/kg/nap dózisú kezelés 100% -ban megvédte az egereket a halálos betegségtől, megakadályozza a vírus terjedését az agyba és az egerek 70% -ában hatékonyan blokkolta a fertőzést. A DAS181 1 mg/kg/nap dózisban terápiásán is hatásos volt, a H5N1 vírussal fertőzött egerek fokozott túlélését eredményezte, amikor a kezelést 72 órával a fertőzés után elkezdték. Ez a figyelemre méltó vírusellenes aktivitás aláhúzza a DAS181 potenciális alkalmazhatóságát, mint egy új gyógyszercsoportot, amely hatékony a pandémiás potenciállal rendelkező influenza vírusok ellen.

2003 vége óta a magas patogenitású madárinfluenza (HPAI) H5N1 vírusok pusztították a baromfiállományt Ázsiában, Európában és Afrikában, és> 300 laboratóriumi igazolt emberi fertőzést okoztak, halálozási arányuk ∼ 60% volt [1]. Ezek az események rávilágítanak arra, hogy egy madárfajokból egy pandémiás törzs, például a H5N1 származhat. Ilyen esetben a hatékony vírusellenes gyógyszerek elengedhetetlen kontrollintézkedések lesznek, különösen a világjárvány első szakaszában, amikor még nem állnak rendelkezésre antigénileg jól illeszkedő vakcinák [2]. A jelenleg engedélyezett influenza elleni gyógyszerek az adamantin M2 ioncsatorna blokkolókból és a neuraminidáz inhibitorokból, az oseltamivirből és a zanamivirből állnak [3, 4]. Sajnos a Délkelet-Ázsiában keringő 1. és 2. kládú H5N1 vírusok többsége ellenálló az M2 blokkolókkal szemben [5–8]. A H5N1 vírussal fertőzött betegekből származó oseltamivir-rezisztens variánsokat tartalmazó kvázifajok elkülönítése további aggodalmakat vetett fel azzal kapcsolatban, hogy a H5N1 vírusok meglévő vírusellenes módozatai nem megfelelőek [9, 10], és hangsúlyozzák annak szükségességét, hogy olyan új terápiás szereket dolgozzanak ki, amelyek hatékonyak a madárinfluenza vírusokkal szemben. járványpotenciál [11].

Az influenza vírusok a fertőzést úgy kezdeményezik, hogy a fogékony gazdasejtek felszínén lévő glikokonjugátumokon lévő terminális sziálsav receptorokhoz kötődnek. Ezért egy olyan szialidáz aktivitású gyógyszer, amely képes eltávolítani az emberi légutak hámjában lévő receptorokat, képes megakadályozni vagy csökkenteni az influenza több altípusának fertőzőképességét. A DAS181 (Fludase) egy rekombináns fúziós fehérje, amely az Actinomyces viscosusból származó szialidáz katalitikus doménből áll, fuzionálva egy légzőszervi epitheliummal - horgonyzó domén, amely az emberben az influenza vírusfertőzés helyére sodorja, és hasítja mind az α (2,6) - kapcsolt és (2,3) -kötött sziálsav-receptorok, amelyeket előnyösen felismernek az emberi, illetve a madár/ló influenza vírusok [12]. A DAS181 mind az influenza A, mind a B vírusokkal szemben hatékony vírusellenes aktivitást mutatott in vitro, és csökkentette a H1N1 vírusok replikációját egerekben és görényekben [12]. A gyógyszer in vivo aktivitása azonban nem ismert a járványos potenciállal rendelkező madárinfluenza vírusok ellen. Itt bemutatjuk, hogy a DAS181 hatékonyan képes megvédeni az egereket a halálos betegségektől, jelentősen csökkenti a vírusreplikációt, sőt megakadályozhatja a HPAI H5N1 vírussal való fertőzést.

Anyagok és metódusok

Vírus. A HPAI A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) vírust (a továbbiakban: VN/1203) 10 napos, embrionált tyúkok petéinek allantois üregében növesztettük 37 ° C-on. Az oltófolyadékot beoltás után 26 órával összegyűjtöttük, és aliquotokban tároltuk -70 ° C-on. Az EID50-titert a petékben a vírus soros titrálásával határoztuk meg, és Reed és Muench módszerével számoltuk [13]. A magas patogenitású vírusokkal végzett összes kísérletet a 3. biológiai biztonság szintjén tartották, beleértve az Egyesült Államok Mezőgazdasági Minisztériuma és a Select Agent program által megkövetelt fejlesztéseket [14]. A laboratóriumi dolgozók mindig megfelelő légzőkészüléket viseltek (RACAL egészség és biztonság). Az állatkísérleteket a Betegségmegelőzési és Megelőzési Központok Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá, és a Laboratory Animal Care International - akkreditált állattartó intézet egyesületében zajlott.

Egerek fertőzése és kihívási kísérletek. Hat-nyolc hetes nőstény BALB/c egereket (Charles River Laboratories) enyhén altattunk CO2-vel, és 50 μl PBS-ben hígított fertőző vírust oltottunk intranazálisan (inl). A VN/1203 MLD50-értékét a máshol leírtak szerint határoztuk meg [15]. A gyógyszer hatékonyságának értékeléséhez az egereket 3 MLD50-vel (1 × 10 2,3 EID50) vagy 1,5 MLD50-vel (1 × 10 2,0 EID50) VN/1203-mal fertőztük. Csoportonként 3-5 egeret öltek meg 6 vagy 9 nappal a fertőzés után. A tüdő- és agyszöveteket összegyűjtöttük és titráltuk vírusra a másutt leírtak szerint [15]. Röviden, az egész tüdőt és az agyakat összegyűjtöttük, és 1 ml PBS-ben homogenizáltuk, centrifugálással tisztítottuk és tojásokban sorozatosan titráltuk. A vírustitereket átlag ± SE log10 EID50/ml-ben fejeztük ki. Minden csoportban a fennmaradó 12–20 egeret naponta figyelték meg a testsúlycsökkenés és a túlélés szempontjából 21 napig.

Az egerek kezelése DAS181-gyel. A BALB/c egereket intraperitoneális injekcióval 100 mg/kg ketaminnal altattuk a DAS181-gyel vagy placebóval (steril PBS) végzett kezelés előtt; 10 U (8 μig) vagy 30 U (23 μg) DAS181-et vagy PBS-t juttattunk be a légzőszervi nyálkahártyába 50 μl térfogatban naponta egyszer vagy kétszer, összesen 7 vagy 8 napig. A DAS181 egy egysége 0,77 μg fehérjének felel meg. A DAS181 HPAI H5N1 vírussal szembeni megelőző és terápiás hatékonyságának értékeléséhez az egereket DAS181-vel kezeltük 24 órával a VN/1203 fertőzés előtt, 24, 48 vagy 72 órával a fertőzés után.

Az influenza vírusfertőzés blokkolása egerekben a DAS181 profilaktikus beadása után. Annak értékelésére, hogy a DAS181-gyel kezelt egerek milyen mértékben voltak fertőzöttek a H5N1 vírussal, meghatároztuk a H5-specifikus HI vagy IgG antitest szintjét a túlélő egerekből gyűjtött szérummintákban (1. táblázat és 2. ábra). A H5-specifikus antitestet a túlélők többségében észlelték, akik DAS181-et kaptak 0,3 vagy 0,7 mg/kg/nap dózisban, de csak a túlélők egyharmadában, akik DAS181-et kaptak 1 mg/kg/nap dózisban, jelezve, hogy az ezt kapó egerek többsége dózis nem volt produktívan fertőzött VN/1203-mal. Ez a hatás a VN/1203 bármelyik provokációs dózisánál volt tapasztalható. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a DAS181 napi inl bejuttatása jelentősen csökkentette a H5N1 vírus replikációját és terjedését, és 1 mg/kg/nap dózisban megvédte az egerek 100% -át a haláltól és az egerek többségét egy erősen virulens H5N1 vírussal való fertőzésektől.

Hemagglutinin (HA) - specifikus hemagglutináció-gátlás (HI) és IgG antitest (Ab) titerek szérumban olyan egerekből, amelyek túlélték a virulens H5N1 vírust. Szérummintákat gyűjtöttünk olyan egerekből, amelyeket a jelzés szerint DAS181-gyel kezeltünk, és amelyek túlélték a provokációt 3 vagy 1,5 MLD50 A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) vírussal; a mintákat HI Ab (A és B) és IgG Ab jelenlétére ELISA-val (C és D) teszteltük. Az ELISA-val kapott pozitív eredményt bizonyították egereken a produktív H5N1 fertőzésre. Az IgG Ab-titer kimutatási határa 100. A ~ 40 HI Ab-titer (log2 5,32) négyszeres növekedést tükröz az preinfekciós szérumban mért érték fölött, és pozitívnak tekintik őket. A PBS-sel kezelt tControl egerek a fertőzés után 4 hétig nem éltek túl.

A DAS181 terápiás hatékonysága egerekben egy nagyon virulens H5N1 vírussal szemben. Ezután értékeltük az inl DAS181 terápiás aktivitását 1 mg/kg/nap dózisban, amikor a kezelést 24, 48 vagy 72 órával kezdtük meg 3 MLD50 VN/1203-mal való fertőzés után. Az antivirális hatékonyság kontrolljaként az egerek egy csoportja 1 mg/kg/nap dózist kapott 24 órával a fertőzés előtt; ez a csoport 95% -os túlélési arányt mutatott, hasonlóan az előző kísérlethez. A DAS181 terápiás beadása nem volt képes megvédeni az egereket a VN/1203 fertőzéstől, amit a csoportok közötti jelentős súlycsökkenés bizonyított, amely statisztikailag nem volt szignifikáns a kezelés megkezdésének napjától függetlenül. Amikor a kezelést 24 óráig késleltették a fertőzés után, az egerek jelentős súlycsökkenést mutattak, de szignifikánsan késleltetett átlagos halálozási idő volt az álkezelt csoporthoz képest (P 2. táblázat és 3A ábra).

Túlélés terápiásán beadott DAS181 egerekben letális fertőzés után A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) vírussal (VN/1203).

Túlélés terápiásán beadott DAS181 egerekben A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) vírus (VN/1203) halálos fertőzés után.

Vita

A magas vírusterhelést a H5N1 vírus patogenezisének kritikus jellemzőjeként feltételezik az embereknél [20], ami arra utal, hogy az emberi H5N1 betegség klinikai kezelésének a vírus replikációjának elnyomására kell összpontosítania hatékony vírusellenes szerek alkalmazásával. Jelen tanulmányunkban bebizonyítottuk, hogy az új szialidáz fúziós fehérje, a DAS181 dózisfüggő vírusellenes aktivitással rendelkezik egerekben egy nagyon virulens H5N1 vírussal szemben, amelyet halálos influenza esetekben izoláltak embertől. Az 1 mg/kg/nap dózisban történő beadás előtt a DAS181 nemcsak védte az egereket a halálos betegségtől, hanem az egerek ~ 70% -ában teljesen blokkolta a fertőzést. A DAS181 a fertőzés után is hatásos volt. Ami a legfontosabb, hogy egy 7 napos kezelési rend után a kezelés abbahagyása után nem volt szignifikáns növekedés a vírustiterekben.

Míg a jelenleg elérhető influenza vírusellenes kezelések a vírus géntermékeit célozzák meg, addig a DAS181 a gazdasejt receptorokat célozza meg, ami csökkent lehetőséget kínálhat a rezisztencia megjelenésére. Mindazonáltal fontos lesz alaposan értékelni a receptor-kötő variánsok szelekciós lehetőségét a DAS181 kezelés után. A rendkívül virulens madár H5N1 vírus elleni figyelemre méltó in vivo hatékonyság rávilágít a DAS181 potenciális hatékony vírusellenes szerként mind a szezonális, mind a járványos influenzára. A DAS181 első fázisú klinikai vizsgálata 2007 végén kezdődik.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük Larisa Gubarevának a kézirat kritikai felülvizsgálatát.