Lumineszcens technikák az élelmiszerek mikrobiológiai elemzéséhez

Feladva: 2007. március 7. | Dr. Mansel Griffiths, Kanadai Élelmiszerbiztonsági Kutatóintézet, Kanada | Még nincsenek hozzászólások

Számos természetes biolumineszcens organizmus létezik a természetben, és ezeknek a lényeknek a fénykibocsátásának mechanizmusait teljes mértékben jellemezték1. Ide tartozik a baktériumok, rovarok (szentjánosbogarak és kattintóbogarak) luciferin-luciferáz rendszere és az Aequorea victoria medúza. Lényegében a biolumineszcencia magában foglalja a kémiai energia fényenergiává történő átalakítását egy enzim által, amelyet általában luciferáznak neveznek.

A különböző organizmusokból származó luciferázok különböző reakciókat katalizálnak, de mindegyikhez oxigénre van szükség. Az évek során nagy az érdeklődés a biolumineszcencián alapuló alkalmazások kifejlesztése iránt2,3. A biolumineszcens rendszerek analitikai eszközként való alkalmazásának fő előnye, hogy a kibocsátott fény mérésével rendkívül alacsony szintű enzimaktivitás detektálható. A modern műszerek képesek egyetlen foton detektálására mind időbeli, mind térbeli eloszlás mellett; így pontos információt szolgáltat a fényforrás helyéről és intenzitásáról4. A biolumineszcens rendszerek másik jellemzője, amely kiváló vizsgálati eszközzé teszi őket, a szubsztrátjaikra vonatkozó szinte abszolút specifitás. Például a szentjánosbogár-luciferáz esetében az ATP és a szentjánosbogár-luciferin szerkezetében még kisebb változások is az enzimaktivitás teljes elvesztését eredményezik, ami ennek következtében a fénykibocsátás csökkenését eredményezi. Ez a szubsztrátokra jellemző specifitás lehetővé teszi a luciferáz aktivitás valós idejű mérését in situ nagyon összetett mintákban, előzetes kezelés nélkül.

ATP biolumineszcencia

A biolumineszcens módszerek közül a legismertebb az ATP-vizsgálat, amely a szentjánosbogár-luciferáz aktivitására épül (1. ábra). Ezt a vizsgálatot használták a biomassza meghatározására, és azon az elven alapul, hogy minden élő sejt tartalmaz ATP-t, és az ATP-szintek arányosak a jelenlévő sejtek számával. Tehát a luciferáz/luciferin reakció által kibocsátott fény mennyisége az ATP sejtekből történő kivonása után megadja a sejtpopuláció becslését. Ezt a vizsgálatot alkalmazták a mikrobiális terhelés becslésére különféle élelmiszerekben, ideértve a tej5-10, a baromfi11-14, a hús 15, 16 és a termés17 termékeket. Az eredmények körülbelül 15 percen belül elérhetők, és pontosan jelzik, hogy a számok meghaladták-e az előre meghatározott küszöbértékeket. Az ATP biolumineszcenciát a feldolgozó vizek minőségének ellenőrzésére is használták az élelmiszer-gyártás során 11, 18.

E technológia vitathatatlanul a legszélesebb körben alkalmazott alkalmazása az „ATP Hygiene Monitoring”. Ez magában foglalja a környezeti tamponok ATP-szintjének értékelését, amely közvetlenül kapcsolódik a felület tisztaságához19, 20. Számos kereskedelmi rendszer áll rendelkezésre (2. ábra). Aggodalom merült fel a luciferáz gátlásával kapcsolatban a fertőtlenítőszerek jelenlétében a felületeken a fertőtlenítést követően21-23. A probléma leküzdésének egyik elegáns módja az iparban használt fertőtlenítőszerekkel szemben fokozottan ellenálló mutáns luciferázok alkalmazása24. A higiéniai monitorozás kapcsán azt javasolták, hogy ezek a tesztek felhasználhatók legyenek az élelmiszerrel érintkező felületeken található allergének jelenlétének felmérésére is.

A prokarióta és eukarióta sejtekből származó ATP differenciális extrakciójának módszereivel olyan mikrobiális sejtek vizsgálatait lehet kidolgozni, amelyek percek alatt elvégezhetők. Ezeknek a vizsgálatoknak a kimutatási határa azonban magas (> 106 CFU/ml), és az érzékenységük javítására szolgáló módszerek sok mikrobiológus által foglalkoztatottak az elmúlt két-három évtizedben. Az érzékenység javítása érdekében szűréssel vagy centrifugálással járó technikákat vizsgáltak, amelyek lehetővé tették az élelmiszerekben körülbelül 104 CFU/ml kimutatását. Ezt az érzékenységet tovább lehet javítani az adenilát-kináz, a sejtekben jelenlévő enzim vizsgálataival, amely felesleges ADP hozzáadásával ATP termelésére elősegíthető26. Egy másik módszert az érzékenység növelésére, amely magában foglalja az ATP újrafeldolgozását, a piruvát-orto-foszfát-dikináz enzim és a luciferáz/luciferin kombinálásával, Sakakibara és mtsai. Ezek a szerzők azt állítják, hogy módszerük körülbelül 40-szer érzékenyebb, mint a pusztán a luciferáz/luciferin reakción alapuló módszer.

Fág alapú diagnosztika

Az ATP biolumineszcencia vizsgálatok másik hátránya, hogy nem képesek megkülönböztetni az élelemben vagy az élelmiszerrel érintkező felületeken jelen lévő organizmus típusokat. Ezt többféle módon kezelték. A közelmúltban felmerült az érdeklődés az ATP biolumineszcens vizsgálatok és 28, 29 immunmágneses elválasztás összekapcsolása iránt, de ennek fő hátránya, hogy a mikroorganizmusok nem specifikusan kötődnek a technikában alkalmazott paramágneses gyöngyökhöz. Megjelent egy olyan kereskedelmi rendszer, amely gazda-specifikus bakteriofágot használ a célbaktériumok lizálásához, és a felszabadult adenilát-kináz biolumineszcens módszerrel vizsgálható30. Ez képezi az Alaska Food Diagnostics által szállított fastrAK ™ vizsgálat alapját.

A bakteriofágokat más módon is alkalmazták a kórokozók biolumineszcens platform segítségével történő kimutatására. Számos kutató módosított bakteriofágot használt lumineszcens vagy fluoreszcens riporter gének hordozására31. Amikor a gazdasejtet megfertőzi a fág, a riporter gének expresszálódnak és fény bocsátódik ki. Bebizonyosodott, hogy ez a módszer alkalmazható a baktériumok közvetlen kimutatására az élelmiszerfelületeken32. A biolumineszcencia reakcióban részt vevő enzimeket kódoló strukturális gének mellett a kutatók elkészítették a luxI gént tartalmazó fágot, amely egy olyan jelzővegyületet kódol, amely azután számos más gént indukál, a luxCDABE-t, amelynek aktivációja biolumineszcenciához vezet egy bioszenzoron jelenlévő riporter baktériumban33 . Azt is felvetették, hogy biotinilezett fág kvantum-pont nanokomplexekkel párosítva alkalmazható a baktériumok kimutatására34. Jelenleg a fág immobilizálásának módszereit vizsgáljuk, amelyek lehetővé teszik a baktériumok koncentrálását és detektálását egyetlen lépésben35.

Bioszenzorok és egyéb alkalmazások

A biolumineszcencia érdekes alkalmazása a „CANARY” bioszenzor. Ez egy makrofág sejtet foglal magában, amelynek a felületén patogén-specifikus antitestek mutatkoznak36. Amikor a célsejt az antitesthez kötődik, a sejtben természetes jelátviteli útvonalak indulnak ki, amelyeket az aequorin detektálhat, amelyet a makrofág expresszál (3. ábra). A bioszenzort az Innovative Biosensors, Inc. forgalmazza, és az őrölt marhahúsban lévő E. coli O157: H7 kimutatására alkalmazták.

Biolumineszcens vizsgálatokat fejlesztettek ki toxikus anyagok, antibiotikumok és celluláris metabolitok kimutatására is.

A közelmúltban számos kutatás a baktériumok kórokozóinak in vivo képalkotására összpontosított, amelyeket genetikailag módosítottak a luciferáz gének hordozására. Az étkezési fertőzések megelőzésére szolgáló kezelések hatékonyságát ezzel a technikával lehet meghatározni37.

A jelenlegi alkalmazásokra építve számos új és izgalmas lehetőséget kínál a mikrobiológusok számára a biolumineszcencia.