A Valeriana dageletiana Nakai ex F. Maek kivonat földfeletti részének elhízásellenes hatása magas zsírtartalmú étrend okozta elhízott C57BL/6N egerekben

Zhiqiang Wang

1 Prevenciós Orvostudományi és Egészségügyi Menedzsment Tanszék, Hebei Egyetem, Baoding 071002, Kína; moc.liamg@43210qzgnaw

2 Élelmiszertudományi és táplálkozási tanszék, Hallym Egyetem, Chuncheon 24252, Korea; moc.liamg@hshosi

Seung Hwan Hwang

2 Élelmiszertudományi és táplálkozási tanszék, Hallym Egyetem, Chuncheon 24252, Korea; moc.liamg@hshosi

Ju Hee Kim

3 Természetes Orvostudományi Intézet, Hallym Egyetem, Chuncheon 24252, Korea; ten.liamnah@kjhhjk6023

Hamarosan Sung Lim

2 Élelmiszertudományi és táplálkozási tanszék, Hallym Egyetem, Chuncheon 24252, Korea; moc.liamg@hshosi

3 Természetes Orvostudományi Intézet, Hallym Egyetem, Chuncheon 24252, Korea; ten.liamnah@kjhhjk6023

4 Koreai Táplálkozástudományi Intézet, Hallym Egyetem, Chuncheon 24252, Korea

Absztrakt

1. Bemutatkozás

Annak megállapításához, hogy az egerek elhízását javíthatjuk-e a VD-vel végzett étrend-kiegészítéssel, ebben a tanulmányban először a növény felső részéből (szár és levél) és a VD gyökéréből származó kivonatok anti-adipogén hatásait vizsgálták és hasonlították össze a 3T3- L1 adipociták; továbbá megvizsgáltuk a növény étkezési részeként ismert VD felső részéből származó kivonat elhízás elleni hatását a magas zsírtartalmú étrend okozta elhízott egerekben.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Növényi anyag és a kivonat elkészítése

A VD teljes növényét 2015 májusában Ulleung-szigetről szüretelték. A szárított föld feletti (szár és levél) és föld alatti (gyökér) VD-részeket (1,5 kg) mindegyiket porítottuk, majd 70% -os etanollal ( 15 liter) szobahőmérsékleten 48 órán át. A föld feletti (VDAE) és a föld alatti (VDBE) VD kivonatokat szűrőpapírral (Hyundai Micro No. 20, Bucheon, Korea) szűrjük, és csökkentett nyomású párologtatóval (N-1000, Tokyo Rikakikai, Tokió) bepároljuk. Japánban), majd végül fagyasztva szárítjuk PVTFD10R (Ilshinbiobase Co., Ltd., Yangju, Korea) alkalmazásával, hogy kivonatport kapjunk.

2.2. 3T3-L1 sejttenyészet és kezelés

A 3T3-L1 egér előadipocitákat az American Type Culture Collection-től (Manassas, VA, USA) szereztük be, és 37 ° C-on összefolyásig tenyésztettük nedvesített 5% CO2-atmoszférában Dulbecco módosított Eagle táptalajában (DMEM, Gibco, Waltham, MA, USA), beleértve a 10% szarvasmarha borjúszérumot (GenDEPOT, Katy, TX, USA) és 100 E/ml penicillin-sztreptomicint (Gibco). Két nappal azután, hogy a sejtek elérték az összefolyást (0. nap), a 3T3-L1 pre-adipocitáit tenyésztettük 10% magzati marhaszérumot (FBS, Gibco), 10 μg/ml inzulint (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 0,5 mM 3-izobutil-1-metil-xantin (IBMX, Sigma-Aldrich) és 1 μM dexametazon (Sigma-Aldrich). Két nappal a differenciálódás induktorral (MDI, beleértve 0,5 mM IBMX, 1 μM dexametazon és 10 μg/ml inzulin) történő stimulálás után (2. nap) a táptalajt 10% FBS/DMEM tápközeggé alakítottuk, amely 10 μg/ml inzulint tartalmaz. Két nap elteltével (4. nap) a táptalajt 10% FBS/DMEM tápközegre cseréltük, és kétnaponta 10% FBS/DMEM tápközegben tenyésztettük. A teljes differenciálódást a 8. napra sikerült elérni. A differenciálódás során a VD-extraktumokat úgy kezeltük, hogy gátolják az adipociták differenciálódását 3T3-L1 tenyészeten 10 és 50 μg/ml koncentrációban a 0. és 4. nap között.

2.3. Olajvörös O festés és a lipidtartalom meghatározása

Az adipogén potenciál és a lipidfelhalmozódás vizsgálatához a sejteket Oil Red O oldattal (Sigma-Aldrich) festettük. A 8. napon a tenyésztett 3T3-L1 sejteket hideg foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) mostuk, majd szobahőmérsékleten 10% -os formaldehiddel rögzítettük. A sejteket szűrt 0,5 μg/ml Oil Red O oldattal (0,5 g Oil Red O 500 ml izopropil-alkoholban) festettük és kétszer mostuk. A lipidcseppeket izopropanolban oldjuk, és az abszorbanciát 540 nm-en mértük mikrotányér-leolvasóval (Sensident Scan, Labsystems, Helsinki, Finnország).

2.4. A sejtek életképességének vizsgálata

A VD-kivonatok sejtéletképességét 3T3-L1 sejtekben 3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) -5- (3-karboxi-metoxi-fenil) -2- (4-szulfofenil) -2H-tetrazolium, belső só (MTS) vizsgálati készlet (Promega, Madison, WI, USA) a gyártó utasításainak megfelelően. A 3T3-L1 sejteket (5x103/üreg) 96 lyukú lemezeken tenyésztettük, és VD-kivonatokkal (10 és 50 μg/ml) kezeltük. Az optikai sűrűséget 490 nm-en háromszor mértük mikrotányér-leolvasóval (Sensident Scan).

2.5. Az állatok és étrendjük tanulmányozása

Asztal 1

Kísérleti étrendek összetétele (g/kg).

1. csoport NFDHFDGRDVDD

Kazein	210	265	265	265
L-cisztin	3	4	4	4
Kukoricakeményítő	280	-	-	-
Maltodextrin	50	160	150	150
Szacharóz	325	90	90	90
Disznózsír	20	310	310	310
Szójabab olaj	20	30	30	30
Cellulóz	37.15	65.5	65.5	65.5
Ásványi keverék 2	35	48	48	48
3. vitaminkeverék	15	21	21	21
Kalcium-foszfát, kétbázisú	2	3.4	3.4	3.4
Kolin-bitartarát	2.75	3	3	3
Sárga ételszín	0.1	-	-	-
Kék élelmiszer szín	-	0.1	0.1	0.1
Garcinia cambogia 60% -os (-) - hidroxi-citromsav-kivonat	-	-	10.	-
Valeriana dageletiana Nakai ex F. Maek kivonat a föld feletti részből	-	-	-	10.
Összesen (g)	1000	1000	1000	1000

1 NFD; normális zsírtartalmú étrend kontroll, HFD; magas zsírtartalmú étrend kontroll, GRD; HFD + 1% Garcinia cambogia kivonat, VDD; HFD + 1% Valeriana dageletiana Nakai ex F. Maek kivonat a föld feletti részből. 2 Az ásványi keverék az AIN-93G-MX (94046) szerint készül. 3 Vitamin keverék az AIN-93-VX (94047) szerint.

2.6. Szérum- és szövetminták gyűjtése

10 hét elteltével az összes egeret 12 órás éhgyomorra feláldoztuk, és szöveteket gyűjtöttünk elemzés céljából. A vért az alsó vena cava-ból gyűjtöttük, és azonnal elválasztottuk 3000 fordulat/perc sebességgel, 4 ° C-on 15 percig végzett centrifugálással a szérum izolálása céljából. Az epididymális zsírszövetet és a májat eltávolítottuk, lemértük és 80 ° C-on tároltuk az elemzésig.

2.7. Biokémiai elemzés

Triacil-glicerin (TG), nagy sűrűségű lipoprotein (HDL) koleszterin, alacsony sűrűségű lipoprotein (LDL) koleszterin, szérum alanin-aminotranszferáz (ALT), aszpartát-aminotranszferáz (AST), vér-karbamid-nitrogén (BUN) és kreatinin (CREA) szintje a szérumban kereskedelmi készletekkel (981786, 981823, 981656, 981769, 981771, 981820 és 981811, Thermo Electron Corporation, Vantaa, Finnország) és egy Thermo Fisher Konelab 20XTi analizátorral (Thermo Electron Corporation, SeoKwang LABOTECH, Seoul, Korea).

2.8. Szövettani elemzés

Az epididymális zsírszöveteket 4% formaldehiddel rögzítettük és paraffinba ágyazottuk. A metszeteket (5 μm vastag) levágtuk, és mindegyik részt hematoxilinnal és eozinnal (H és E) festettük. Az összes metszetet optikai mikroszkóppal (Leica RM2235, Wetzlar, Németország) fényképeztük le, és 200 × -os nagyítással kinyomtattuk. A képeket mikroszkóppal (Axiomager, Zeiss, Németország) figyeltük meg, és az egyes adipociták átmérőjét AxioVisionRel alkalmazásával elemeztük. 4.8 szoftver (Carl Zeiss, Oberkochen, Németország).

2.9. RNS extrakció, cDNS szintézis és valós idejű PCR

A teljes RNS-t az epididymális zsírszövetből extraháltuk Easy-Blue kit (Intron Biotechnology Inc., Szöul, Korea) segítségével a gyártó által megadott protokoll szerint. Ezután a teljes RNS-t NanoDrop-2000-vel (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA) számszerűsítettük. A cDNS-t szintetizáltuk (0,03 μg teljes RNS) a Moloney egér leukémia vírus transzkriptáz és Oligo (dT) 15 primerekkel (Promega, Medison, WI, USA) Life Touch termikus ciklus segítségével (Life Eco, Bioer Technology, Hangzhou, Kína). . A programot 1 órán át 42 ° C-on kezdjük, majd 10 percig 95 ° C-on és 10 percig 4 ° C-on inkubáljuk. Az RT-PCR-t a QuantiTect SYBR Green PCR készlet (Qiagen) felhasználásával, a gyártó utasításainak megfelelően végeztük. A cDNS-t (20 μL) 40 denaturálási cikluson át (95 ° C 30 másodpercig), izzításon (57 ° C 40 másodpercig) és hosszabbításon (72 ° C 40 másodpercig) amplifikáltuk RotorGene RG3000 valós idejű PCR-rel. gép (Corbett Research, Sydney, Ausztrália). A PCR-termékek tisztaságát olvadási görbe analízissel határoztuk meg. Az egyes gének expressziójának relatív kvantifikációját az összehasonlító küszöbciklus (Ct) módszerrel számítottuk (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Az mRNS szinteket β-aktinná normalizáltuk. Az alapozó szekvenciákat a 2. táblázat mutatja .

2. táblázat

A valós idejű PCR-ben alkalmazott primerek szekvenciája.

GenePrimer szekvencia (5 ’→ 3’)Forward PrimerReverse Primer

β-aktin	GTCGTACCACTGGCATTGTG	GCCATCTCCTGCTCAAAGTC
C/EBP-a	AGACATCAAGCGCCTACATCG	TGTAGGTGCATGGTGGTCTG
PPAR-y	CCCTGGCAAACGATTTGTAT	AATCCTTGGCCCTCTGAGAT
SREBP-1c	GCGCTACCGGTCTTCTATCA	TGCTGCCAAAAGACAAGGG
CD36	TCCTCTGACATTTGCAGGTCTATC	GTGAATCCAGTTATGGGTTCCAC
SCD-1	CGAGGGTTGGTTGTTGATCTGT	ATAGCACTGTTGGCCCTGGA
FAS	GATCCTGGAACGAGAACAC	AGACTGTGGAACACGGTGGT
aP2	AACACCGAGATTTCCTTCAA	TCACGCCTTTCATAACACAT

2.10. NMR-alapú májmetabolomika

Az NMR-alapú máj metabolomikát, beleértve a májszövet előkészítését, a pulzus megszerzését és a metabolitok azonosítását, valamint az adatfeldolgozást a korábbi jelentések szerint, kisebb módosításokkal végeztük [20,21]. Az 1 HNMR spektroszkópiához a máj lipid alkotóelemeit tartalmazó lipofil kivonatokat használtuk. A májszövetet (0,1 g) először 1 ml kloroform/metanol (CHCl3/MeOH, 3: 1, v/v) elegyben homogenizáltuk. Ezután 10 000 fordulat/perc sebességgel 10 percig, 4 ° C-on végzett centrifugálás után a felülúszót összegyűjtjük és nitrogénáram alatt szárítjuk. A lipofil extraktumokat 665 μl deuterált kloroform/metanol (CDCI3/CD3OD, 3: 1, v/v) tartalommal állítottuk elő, beleértve a tetrametil-szilánt (TMS) belső standardként az NMR-analízis során. Az izolált tiszta vegyületek 1H-NMR-spektrumait Bruker AV 400 készülékkel rögzítettük.

2.11. Statisztikai analízis

Az egyes kísérletek adatait átlag ± ± SE értékben fejezzük ki, és az adatok összehasonlítását a Student párosítatlan t-teszt vagy egyirányú ANOVA segítségével végeztük. p Az 1. A ábra: a VDAE nem volt szignifikáns hatással az életképességre 24 órás kezelés után; azonban a VDBE körülbelül 10% -kal csökkenti a sejtek életképességét, jelezve, hogy a VDBE citotoxikus lenne a 3T3-L1 sejtekre.