A vazopresszin V2 receptor antagonista hatása a policisztás vese betegség kialakulására patkánymodellben

Palladio Biosciences Inc.

12 Penns nyomvonal A

Newtown, PA 18940 (USA)

Kapcsolódó cikkek a következőhöz: "

Facebook
Twitter
LinkedIn
Email

Absztrakt

Háttér: A vazopresszin V2 receptor gátlás klinikailag validált hatásmechanizmus az autoszomális domináns policisztás vesebetegség (ADPKD) kezelésében. Ebben a vizsgálatban a lixivaptan, egy erős, szelektív vazopresszin V2 antagonista hatását értékelték PCK patkányokban, a PKD validált állatmodelljében. Mód: Négy hetes PCK patkányokat rágcsáló chow-val etettek 0,5% lixivaptan (alacsony dózis) vagy 1% lixivaptan (nagy dózis) vagy csak chow (kontroll) etetéssel 8 hétig. A vizeletmennyiséget a 7. és 10. héten mértük. Az állatokat 12 hetes korukban ölték meg; a veséket és a májat összegyűjtöttük, súlyoztuk, és elemeztük a ciklikus adenozin-3 ', 5'-monofoszfát (cAMP) szintjét, valamint a cisztás terhelést és a fibrózist; a szérum kreatinint és a nátriumot mértük. Eredmények: A policisztás vese fenotípusának kialakulásával összhangban a kontroll PCK patkányok megnagyobbodott vesét, kiterjedt ciszta képződést és a szérum kreatininszint emelkedésének korai jeleit mutatták 12 hetes korukban. A kontrollokhoz képest az alacsony dózisú lixivaptánnal kezelt PCK patkányok 26% -kal csökkenték a vese tömeg/testtömeg% -át (o

Bevezetés

Az autoszomális domináns policisztás vesebetegség (ADPKD) egy örökletes genetikai betegség, amelyet a folyadékkal töltött ciszták képződése és megnagyobbodása jellemez a vesékben, a májban és más szervekben, ami a vesefunkció fokozatos elvesztését eredményezi [1]. Az ADPKD a policystin (PKD) 1 vagy 2 gének funkcióvesztési mutációiból származik, amelyek megzavarják a vese tubuláris hám normális differenciált fenotípusát, ami az intracelluláris ciklikus adenozin 3 ′, 5′-monofoszfát (cAMP) növekedéséhez vezet, és fokozott sejtszaporodást és ciszta képződést eredményez [2]. A ciszta növekedése kiszorítja és károsítja a normális veseszövetet, ami a nephron funkció csökkenéséhez vezet.

Az ADPKD az egyik leggyakoribb genetikai betegség, amelynek becsült előfordulási gyakorisága eléri az 1-t 500–1000-nél [1]. Becslések szerint világszerte 12,5 millió embert érint. Az ADPKD a végstádiumú vesebetegségek 5–10% -át teszi ki, az ADPKD-s betegek kb. 50% -ánál 60 éves korig végső stádiumú vesebetegség alakul ki. Ez teszi az ADPKD-t a veseelégtelenség negyedik okává.

A PCK patkány modell a humán PKD ortológikus modellje, amelyet a Pkhd1 gén, és a PKD kutatás területén jól bevált és széles körben alkalmazott modell [9, 10]. Progresszív cystogenezis, a vese cAMP megemelkedett szintje és a vesefunkció károsodása jellemzi, amelyek fenotípusosan hasonlóak a humán ADPKD-hez. Fontos, hogy a vazopresszin receptor antagonista tolvaptánt a PCK patkánymodellben hatékonynak találták [11], ami igazolja a modellt az emberben a hatékonyság lehetséges előrejelzőjeként.

Jelen tanulmány célja a lixivaptan hatásainak meghatározása volt a PCK patkánymodellben, különös hangsúlyt fektetve a betegség megnyilvánulási végpontjaira (a vese súlya a teljes testtömeg százalékában, a ciszta terhelése, a vese cAMP szintje és a szérum kreatinin értéke), valamint a farmakodinamikai szempontból végpontok (vizeletmennyiség és szérum elektrolitkoncentráció). A vese megnyilvánulásai mellett az ADPKD-s betegek többségében májciszták és fibrózis is kialakul; ezért azt is megvizsgáltuk, hogy a lixivaptan javíthatja-e a máj patológiáját PCK patkányokban.

Anyagok és metódusok

Állatok

Az intézményi állatgondozási és hasznosítási bizottság jóváhagyta az itt leírt összes kísérleti protokollt. Az ebben a vizsgálatban használt PCK patkányokat (Sprague-Dawley törzs) a Mayo Klinika (Rochester, MN, USA) Állatorvos-tanszékének állattartó intézményeiben tartják fenn. Az állatokat 2 hím vagy 3 nőstény tartotta ketrecben, és őrölt patkánytojást etettek libitumon (Purina Mills, Richmond, IN, USA).

Tanulmányterv és eljárások

Négy hetes korukban a PCK patkányokat 3 csoportra osztották: egy kontrollcsoportra és 2 kezelési csoportra, egyenként 20 állatból (10 nőstény és 10 hím). Az állatok 0,5% lixivaptant (alacsony dózisú csoport), 1% lixivaptánt (nagy dózisú csoport) vagy őrölt rágcsáló chow-t kaptak 8 héten át lixivaptan nélkül (kontroll csoport). Farmakokinetikai kísérletek kimutatták, hogy a lixivaptan ezen orális dózisai kitettséget eredményeztek, amely megközelítőleg 30–100 mg/kg lixivaptan szájon át történő adagolásával történt (publikálatlan adatok). A diétákat úgy készítettük, hogy a lixivaptánt 0,5 g/ml koncentrációjú DMSO-ban oldottuk, és a kapott lixivaptán oldatot összekevertük a szilárd étrenddel (2016CM Harlan Teklad Global Rodent Diet®, Harlan Teklad, Inc., Indianapolis, IN, USA) 1 órán át. nagy kapacitású konyhai robotgép segítségével. A kontrollcsoport étrendje tartalmazott DMSO-t, de nem tartalmazott gyógyszert. Minden élelmiszer-készítményt hetente frissen készítettek a termékbiztonsági laboratóriumban Monroe-ban (New Jersey, USA), és sötétben tárolták, amíg felhasználásra készen állt. Az élelmet 100 g állat testtömegére számított 5 g takarmány alapján szolgáltattuk. A táplálékfelvételt és az állatok súlyát hetente ellenőriztük.

Az állatokat metabolikus ketrecekbe helyeztük 7 és 10 hetes korukban, hogy megmérjük a 24 órás vizeletmennyiséget. 12 hetes korban az állatokat intraperitoneális ketaminnal (90 mg/kg) és xilazinnal (10 mg/kg) végzett érzéstelenítéssel lemértük és megöltük. A vért szívpunkcióval vettük fel a plazma elektrolit-, kreatinin- és karbamidszint meghatározásához. A jobb vesét és a máj egy részét előre lemért, 10% formaldehidet tartalmazó foszfátpufferben (pH = 7,4) tartalmazó fiolákba helyeztük. A szöveteket paraffinba ágyazták a szövettani vizsgálatokhoz. A bal vesét gyors fagyasztva folyékony nitrogénben végeztük a cAMP meghatározásához.

Vese és máj hisztomorfometrikus elemzés és immunhisztológia

A vese öt mikronos keresztirányú szöveti szakaszait (beleértve a kéreget, a medullát és a papillát) és a májat festették hematoxilin-eozinnal, Masson trichromjával és picrosirius vörösével. A ciszta térfogatának mérésére hematoxilin-eozin festéssel ellátott egész transzverzális szövetmetszeteket alkalmaztunk. A fibrózis elemzéséhez a kollagén rostok Picrosirius vörös festését, a máj fibrózisához pedig egész metszeteket használtunk. Az összes szövetmetszetet picrosirius vörös színnel festettük meg egyetlen adagban, hogy elkerüljék a festés változékonyságát tételenként. A vesefibrózis esetében szekvenciális képeket gyűjtöttünk a 10x objektív segítségével, az egyes szakaszok középvonala mentén haladva a rendelkezésre álló kéreg egyik végétől a másikig, átfedés nélkül, az elfogulatlan mintavétel érdekében. A vese velőt nem mértük. A májfibrózis szempontjából az egész metszetet elemeztük.

A fénymikroszkópos képek elemzését a NIS-Elements AR szoftverrendszer (Nikon, Elgin, IL, USA) segítségével végeztük, amely színes digitális fényképezőgéppel ellátott fénymikroszkópot (Nikon DS-Ri1) és Pentium IBM kompatibilis számítógépet (HP) tartalmaz. Z420). A foltos részeket Nikon mikroszkóp alatt tettük láthatóvá, és nagyfelbontású Nikon digitális fényképezőgép segítségével digitális képeket készítettünk. A megfigyelő interaktív módon alkalmazhat fejlesztési technikákat az érdekelt struktúrák jobb meghatározása érdekében, vagy kizárhatja az elemzéshez túl sérült mezőket. Vizuálisan a vénákat és az epevezetékeket kizárták. A vese- vagy májciszta vagy a fibrózis térfogatának kiszámításához színes küszöböt alkalmaztunk olyan szinten, amely elválasztotta az objektumokat a hátterétől. A vese/máj ciszta és a fibrózis pontszámokat ezután a cisztát vagy fibrózist elért terület százalékában fejezzük ki az összes elemzett területen.

cAMP teljes vesék tartalma

A fagyasztott veséket lemértük és finom porig őröltük folyékony nitrogén alatt, rozsdamentes acél habarcs alkalmazásával, és 10 térfogat 0,1 M HCl-ban szobahőmérsékleten homogenizáltuk. Az összes fehérjekoncentrációt a BCA Protein Assay Kit (Pierce, IL, USA) segítségével mértük. 10 percig szobahőmérsékleten 600 × g sebességgel végzett centrifugálás után a felülúszót tovább hígítottuk 0,1 M HCl-ban, és közvetlenül a cAMP-vizsgálatban futtattuk, vagy fagyasztva tároltuk későbbi elemzés céljából. A cAMP-tartalmat Direct cAMP ELISA készlettel értékeltük a gyártó utasításai szerint (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY, USA). A mintákat három példányban dolgoztuk fel. Az eredményeket pmol/mg fehérjében fejeztük ki.

Egyéb elemzések

A 12. héten összegyűjtött vért használtuk a plazma kreatinin, karbamid, nátrium és kálium mérésére. A plazma kreatinint és a karbamidot Quantichrome kreatinin és karbamid vizsgálati készletekkel mértük (Bioassay Systems, Hayward, CA, USA). A plazma nátrium- és káliumszint-mérését pHOx Ultra Comprehensive Critical Care Analyzer segítségével végeztük (Nova Biomedical, Waltham, MA, USA).

Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± SD-ként fejeztük ki. A csoportok közötti összehasonlításokat 1 vagy 2 irányú varianciaanalízissel elemeztük, az átlagok vagy a Student legkevésbé szignifikáns különbség-összehasonlítással. t teszt, adott esetben. Valamennyi elemzést a PRISM szoftverrel végeztük (La Jolla, Kalifornia, USA). o 0,05), a ciszta pontszám 25% -os javulása (o 0,05; 1. ábra). A nagy dózisú lixivaptán-csoport és a kontrollcsoport közötti statisztikai elkülönülést negatívan befolyásolta a nagy dózisú csoportban lévő 3 kiugró érték jelenléte, amelyek a vese, a szív, a máj és/vagy a lép súlyának és a testtömegének egyidejű emelkedett arányát mutatták. . Ennek a megállapításnak a jelentősége nem ismert. Ennek a 3 kiugró értéknek a nagy dózisú csoportból való eltávolítása, és egy hasonló kiugrás a kontroll csoportból jelentős eltérést eredményezett a nagy dózisú és a kontroll csoport között a vese tömeg/testtömeg% -ában (1,3, illetve 1,6%; o 0,05; Asztal 1).

Az emelkedett intracelluláris cAMP kulcsfontosságú szerepet játszik azokban a sejtes folyamatokban, amelyek PKD fenotípus kialakulásához vezetnek [13]. Ennek megfelelően a vese cAMP szintje megemelkedik a PCK patkányokban a vad típusú állatokhoz képest, és pozitív korreláció áll fenn a cAMP szöveti szintje és a PKD súlyossága között [3]. A PCK patkányok alacsony dózisú lixivaptánnal történő kezelése a kontroll állatokhoz képest a cAMP szintjének 23% -os csökkenéséhez vezetett (o 0,05) és a fibrózis pontszám (20,6% -os csökkenés; o> 0,05). Ezzel szemben a nagy dózisú lixivaptan csoport nem különült el a májparaméterek kontrolljától (az adatokat nem közöljük).

2. ábra.

A lixivaptan hatása a máj morfológiájára. a Alacsony lixivaptán dózissal kezelt PCK patkányok transzverzális májmetszeteinek reprezentatív szövettani képei a kontrollokhoz képest. b A lixivaptan hatása a máj/testtömeg% -ra, a máj ciszta pontszámára és a májfibrózis pontszámára. Az adatok átlag ± SD. *** o