A VGF hipotalamusi túlzott expressziója a szibériai hörcsögben növeli az energiafelhasználást és csökkenti a testtömeg-növekedést

Nottinghami Egyetem, Biológiai Tudományok Iskola, Sutton Bonington Campus, Loughborough, Egyesült Királyság, Élettudományi Kar, Nottinghami Egyetem Orvostudományi Kar, Queen's Medical Center, Nottingham, Egyesült Királyság

Nottinghami Egyetem biológiai tudományok iskolája, Sutton Bonington Campus, Loughborough, Egyesült Királyság

Cagliari Egyetem, Orvosbiológiai Tudományok Tanszéke, 09042 Monserrato, Cagliari, Olaszország

Rowett Táplálkozási és Egészségügyi Intézet, Aberdeen Egyetem, Aberdeen, Egyesült Királyság

Nottingham Egyetem Orvostudományi Kar, Queen's Medical Center, Nottingham, Egyesült Királyság

Nottinghami Egyetem biológiai tudományok iskolája, Sutton Bonington Campus, Loughborough, Egyesült Királyság

Jo E. Lewis,
John M. Brameld,
Phil Hill,
Cristina Cocco,
Barbara Noli,
Gian-Luca Ferri,
Perry Barrett,
Francis J. P. Ebling,
Preeti H. Jethwa

Javítás

2017. július 28.: Lewis JE, Brameld JM, Hill P, Cocco C, Noli B és mtsai. (2017) Korrekció: A VGF hipotalamusi túlzott expressziója a szibériai hörcsögben növeli az energiafelhasználást és csökkenti a testtömeg-növekedést. PLOS ONE 12 (7): e0182594. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0182594 Javítás megtekintése

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Lewis JE, Brameld JM, Hill P, Cocco C, Noli B, Ferri G-L és mtsai. (2017) A VGF hipotalamusi túlzott expressziója a szibériai hörcsögben növeli az energiafelhasználást és csökkenti a testtömeg-növekedést. PLoS ONE 12 (2): e0172724. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0172724

Szerkesztő: Alessandro Bartolomucci, a Minnesotai Testvérvárosok Egyeteme, EGYESÜLT ÁLLAMOK

Fogadott: 2016. december 8 .; Elfogadott: 2017. február 8 .; Közzétett: 2017. február 24

Adatok elérhetősége: Minden releváns adat megtalálható a dokumentumban és a kiegészítő információkat tartalmazó fájlokban.

Finanszírozás: A munkát a Nottinghami Egyetem Tudásátadás-díja és a BBSRC Stratégiai Készségek Díja támogatta. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

A VGF egy neurotrofin által indukált gén, amelyet széles körben expresszálnak a neuronális és a neuroendokrin sejtekben. A VGF gén egy 68 kDa polipeptidet kódol, amelyet a prohormon konvertázok (PC) több kisebb peptiddé hasítanak és depolarizáló ingerekre felszabadulnak [1–4]. Míg a VGF mRNS az idegrendszer számos régiójában expresszálódik, a VGF immunreaktivitás legnagyobb koncentrációja a ventromedialis hipotalamuszban található, különösen az íves magban (Arc) és a paraventricularis magban (PVN) [5–7].

A VGF-et először az egerek étrendi manipulációjával végzett kísérletek révén emelték ki, hogy szerepet kapjon az energia homeosztázisában. A koplalás megnövelte a VGF mRNS-jét az ívben, majd az újratáplálás után a szintek csökkentek [8]. A VGF ezen anabolikus szerepét egy VGF null (VGF -/-) egérrel végzett megfigyelések támasztották alá [8]. A VGF -/- egerek kicsiek, soványak, hipermetabolikusak és hiperaktívak. Több ételt fogyasztanak testtömeg-grammonként, mint a vad típusú alomtársak kontrolljai, és megnövekedett oxigénfogyasztást és mozgásszervi aktivitást mutatnak [8]. Érdekes módon a VGF gén ablációja blokkolta az elhízás kialakulását az étrend- és arany-tioglikóz egerekben és az (A y/a) (agouti) egérrel keresztezett VGF -/- egerekben, míg a súlygyarapodás az ob/ob-ben gyengült. egér [9, 10].

A tanulmány célja tehát a VGF szerepének jobb megértése az energia homeosztázis szabályozásában rekombináns adeno-asszociált vírusvektor (AAV) felhasználásával a VGF túlzott expressziójára felnőtt hím szibériai hörcsögök hipotalamuszában, elkerülve ezzel a fejlődési folyamatokat. hatások vagy a kapcsolódó funkcionális kompenzáció. Korábban bemutattuk a 2A vírusszekvencia AAV-val kombinált alkalmazásának megvalósíthatóságát a VGF és fluoreszcens riporter (eGFP) gének hosszú távú túlzott expressziójára a szibériai hörcsög hipotalamuszában [16].

Mód

Állatok

A 3 hónapos hím szibériai hörcsögöket (Phodopus sungorus) a Nottinghami Egyetem által fenntartott telepből vették (Ebling, 1994). A hörcsögöket egyedi ketrecekben, szabályozott hőmérsékleten (21 ± 1 ° C) és 16 órás világos/8 órás sötét (11:00 órakor kialszik) fordított fotoperiódussal helyezték el, ad-libitum hozzáféréssel az élelemhez és a vízhez, hacsak másképp nem szerepel. Az étrend standard laboratóriumi chow volt, amely 19% extrudált fehérjét és 9% zsírt tartalmazott (Teklad 2019, Harlan, Egyesült Királyság). Minden állatkísérletet a University of Nottingham Állatvédelmi és Etikai Felülvizsgálati Testület hagyott jóvá, és az Egyesült Királyság Állatainak (Tudományos Eljárások) 1986. évi törvényének (PPL 40⁄3604 projektengedély) összhangban hajtották végre.

Konstrukciós és vírusrészecskék szintézise

A konstrukciók és a vírusrészecskék szintézisét, beleértve az in vitro és az in vivo validálást, korábban leírták [16]. Röviden, a pAAV-CBA-VGF-2A-eGFP-t (később pAAV-VGF-GFP-nek hívták) úgy állítottuk elő, hogy az AgRP-IRES-eGFP-t eltávolítottuk a pAAV-CBA-AgRP-IRES-eGFP-WPRE plazmidból (kedves ajándék Dr. Miguel Sena-Esteves (Massachusettsi Egyetem, Worcester, USA; [17]) és a VGF-2A-eGFP inszertálása. A plazmidot ezután szekvenáltuk, hogy megerősítsük az AgRP-IRES-eGFP eltávolítását és a VGF-2A-eGFP inszertációját. In vitro validációt követően az SH-SY5Y neuroblasztóma sejtvonalban a pAAV-VGF-GFP plazmidot Vector BioLabs (PA, USA) AAV-2-be csomagolta, a csomagolt AAV-GFP kontrollt pedig a Vector Biolabs cégtől ( PA, USA).

Vírusszerkezetek infúziója

Metabolikus gázok és táplálkozási viselkedés

A VGF túlzott expressziójának hatása a szibériai hörcsögök hipotalamuszában

Peptid mennyiségi meghatározása

A VGF peptidek, köztük a TLQP, AQEE és NERP-2 mennyiségi meghatározását ELISA-val végeztük teljes hipotalamusz mintákon. Az egyes vizsgálatokban alkalmazott antitesteket a következő peptidek ellen termelték: a TLQP-21 N-terminális dekapeptidje (patkány VGF556-565), AQEE-30 (patkány VGF586-595) és a NERP-2 C-terminális nonapeptidje ( patkány VGF342-350), amely amidcsoportot tartalmaz a C-terminális részén, szarvasmarha-tiroglobulinnal vagy kulcslyuk-limpet hemocianinnal konjugálva egy további ciszteinnel a C-terminálison (TLQP, AQEE) vagy N-terminálison (NERP-2). Mindegyik antitestnek nagy affinitása van a megfelelő VGF peptid iránt, de más hasított peptideket is fel lehet ismerni, amelyek magukban foglalják a szekvenciát, amint azt korábban a TLQP-21-hez kötődő TLQP antiszérummal, de a TLQP-62-hez is tapasztaltuk [15]. Az ELISA-t a korábban leírt módon hajtottuk végre [15]. Röviden, a specifikus szintetikus VGF peptidekkel bevont több üreges lemezeket inkubáltuk a VGF antiszérummal párhuzamosan a szövetmintákkal és standardokkal (ugyanazok a szintetikus peptidek, amelyeket az immunizáláshoz használtak), majd a vonatkozó biotinilezett szekunder antitestek (Jackson, West Grove, PA, USA). USA) és a sztreptavidin-peroxidáz konjugátum (Biospa, Milánó, Olaszország). Mindegyik VGF vizsgálatot különféle szintetikus peptidek alkalmazásával jellemeztük (lásd 1. táblázat).