A zsírsejtméret és a parakrin növekedési faktorok asszociációja a hiperplasztikus elhízás kialakulásában

1 Élelmiszer- és táplálkozási osztály, Georgia Egyetem, Athén, Georgia 30602

Absztrakt

A sovány és elhízott, 3–15 hetes Zucker patkányok inguinális, epididymális és retroperitoneális zsírszövetét használták az adipocita méreteloszlás, a paracrin növekedési faktorok zsírszövetben való jelenlétének és az adipocyta szám későbbi változásainak összefüggésének meghatározására. Az elhízott patkányokban minden egyes depó és időpont esetében nagyobb volt a nagy zsírsejtek aránya, mint a sovány patkányokban. Pozitív korreláció (P az elhízás kialakulása során bekövetkező zsírszövet-tágulást kezdetben a zsírsejtek hipertrófiája jellemzi (3, 4). Az adipocitáknak azonban nincs korlátlan terjeszkedési képességük, és a zsírsejtek száma megnő (3,4). A hiperplasztikus zsírszövet kialakulása mind a genetikai, mind az étrend okozta elhízásban az elhízás legsúlyosabb formáival jár (14), és a kezelésre a legrosszabb a prognózisa (2,3). A zsírszövet növekedését szabályozó mechanizmusok megértése fokozhatja az erőfeszítéseket a sikeres megelőzési és kezelési stratégiák kidolgozására a testfelesleg felhalmozódásának korlátozása érdekében.

Faust (10) azt javasolta, hogy a kritikus zsírsejtméret elérése kiváltja azokat az eseményeket, amelyek megnövelik a zsírsejtek számát. A zsírsejtek átlagos méretének növekedése a zsírsejtek számának változása előtt következik be, és köztudottan depóttól függő módon fejlődik ki mind a genetikai (16, 17), mind az étrend által kiváltott (11, 24) elhízásban. Azonban a zsírsejtek átlagos méretének növekedése önmagában nem támasztja alá egyértelműen a kritikus zsírsejtméret-hipotézist. A zsírsejt-méret eloszlási profiljának meghatározása pontosabban reprezentálja a szövetben jelen lévő nagy zsírsejtek számát és méretét (18, 29), és segíthet meghatározni, hogy a kritikus méret megelőzi-e az adipocita hiperplázia kialakulását.

Az adipocita hipertrófia és a hiperplázia regionális különbségei arra utalnak, hogy a lokálisan termelt növekedési faktorok szerepet játszhatnak az adipogenezis szabályozásában (12). Az adipocita számlálás és méretezés meghatározhatja a sejtek változását, de más módszerekre van szükség annak megállapításához, hogy a zsírsejtekben akkor vannak-e mitogén faktorok, amelyek szabályozhatják a hiperplázia kialakulását, amikor a zsírsejtek elérik a kritikus méretet. A zsírszövetből származó sztrómás vaszkuláris sejtek elsődleges tenyésztése hatékony in vitro módszer a preadipocyták szaporodását megváltoztató tényezők vizsgálatára (26, 28). A zsírszövetből vagy az érett zsír töredékeiből izolált sejteknek kitett közeg ismert, hogy olyan adipogén faktorokat tartalmaz, amelyek megváltoztatják a preadipocyták növekedését a tenyészetekben (7, 21, 22, 30), de ezeket a hatásokat nem kapcsolták össze az adipocita méretének specifikus változásával terjesztés.

Ezt a projektet a zsírsejt-eloszlási profil jellemzőinek változásai, a zsírszövetből származó helyi mitogén faktor (ok) jelenléte és a zsírsejt-hiperplázia kialakulása közötti lehetséges összefüggés tanulmányozására tervezték. A kísérleti protokollt annak kiválasztásával választották meg, hogy a megnagyobbodott adipociták felelősek-e a zsírsejtek szaporodását szabályozó növekedési faktorok szekréciójáért. A Zucker patkányok olyan genetikai modellt nyújtanak, amely alkalmas a kritikus zsírsejtméretnek az elhízás kialakulásában játszott szerepének vizsgálatára, mivel az adipocita hipertrófia megelőzi a hiperpláziát regionális és fejlődési mintázatban (6, 16, 17). A zsírszövet cellularitási paramétereit az inguinalis, epididymális és retroperitoneális depókban sovány és elhízott patkányokban határozták meg öt életkorban. Elsődleges preadipocita kultúrákat alkalmaztunk biológiai vizsgálati rendszerként a mitogén faktorok jelenlétének kimutatására a fenti depókból előállított zsírszövet-kondicionált táptalajban. Korrelációs együtthatókat számítottunk annak meghatározására, hogy vajon egy adott zsírsejtméret társult-e a kondicionált táptalaj in vitro proliferatív aktivitásával és a hiperplázia in vivo fejlődésével.

Állatok.

Sovány (Fa/?) és elhízott (fa/fa) 3, 6, 9, 12 és 15 hetes hím Zucker patkányokat a Georgia Egyetem kolóniájából nyertünk. A sovány és elhízott, 3 hetes Zucker patkányokat vizuális vizsgálattal nem lehet megkülönböztetni. Ennek a korcsoportnak a fenotípusos azonosítását a szérum inzulinszintek (ICN Pharmaceuticals, Irving, CA), az inguinális párna testtömeg és a zsírszövet cellularitás adatainak összehasonlításával hajtották végre. A korcsoportok fennmaradó részében a fenotípus azonosítását szemrevételezéssel végeztük. Az elválasztás utáni patkányokat függesztett drótketrecekben helyezték el a hőmérséklet (23 ± 3 ° C) és a páratartalom (40-50%) szempontjából szabályozott helyiségben, 12: 12 órás világos-sötét ciklus mellett. A patkányok a vizsgálat ideje alatt szabadon hozzáférhettek a pelletált étrendhez (Ralston Purina, St. Louis, MO). Az ebben a vizsgálatban használt állatok gondozására vonatkozó összes eljárást a Georgia Egyetem Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá.

A mintavétel napján a patkányokat nátrium-pentobarbitál (50 mg/testtömeg-kg) intraperitoneális injekcióval altattuk. Az inguinalis, epididymális és retroperitoneális zsírpárnákat azonnal eltávolítottuk és lemértük. A zsírszövet korlátozott mennyisége miatt két sovány patkány párnáját egyesítettük, hogy megfelelő mennyiséget biztosítsunk. Mindhárom depóból vett alikvot részeket vettünk az adipocita cellularitási vizsgálatokhoz. Zsírszövet-kondicionált táptalajt készítettünk az inguinalis depóból minden korosztály számára, a epididymális párnákból a 6, 9, 12 és 15 hetes patkányok számára, valamint a retroperitoneális depóból a 9-, 12- és 15-hetes öreg patkányok.

A zsírszövet cellularitása.

A zsírsejtek méretét és számát elektronikus kvantifikációval határoztuk meg Hirsch és Gallian (15) Cartwright (5) módosított módszerével. Három párhuzamos zsírszövetmintát (50–70 mg) 0,12 M osmium-tetroxidot tartalmazó oldatban rögzítettünk (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA) 50 mM kollidin (2,4,6-trimetil-piridin) pufferben. A mintákat szobahőmérsékleten legalább 1 hétig fixáltuk, 0,9% NaCl-dal öblítettük, majd néhány napig 8 M karbamidba helyeztük, hogy megkönnyítsük a sejtek elválasztását a szövetektől. A rögzített adipocitákat 0,9% NaCl-val öblítettük át 240 μm-es nejlonszűrőn, majd 20 μm-es nejlonszitán gyűjtöttük össze (Tetko, Briarcliff Manor, NY). A rögzítési folyamat során a minőségi előírásoknak megfelelő sejtmintákat Coulter (ZM modell, Coulter Electronics, Hialeah, FL) elektronikus részecskeszámlálón elemeztük. A méretezést kettős küszöbérték-analízissel végeztük kilenc meghatározott mérettartományban (30–240 μm), mikroszféra-szabványokkal kalibrálva (Coulter Electronics). A számlálást minden mérettartományban három példányban hajtottuk végre, és százalékos megoszlásként számoltuk őket. Az adipociták számát egy párnánként kiszámítottuk úgy, hogy a minta milligrammjára eső átlagos sejteket megszoroztuk a megfelelő raktár teljes tömegével.

Kondicionált tápközeg előkészítése.

A sejttanulmányokhoz nem használt zsírszövetet a látható erek eltávolítására mikro-boncolták, finomra darálták, háromszor öblítették friss, 37 ° C-os Hanks-féle kiegyensúlyozott sóoldatban (HBSS; Sigma Chemical, St. Louis, MO), szárazon foltozták és mérlegelt. A szöveti alikvot részeket 72 mM gentamicin-szulfátot, 120 mM cefazolint és 27 mM amfotericin B-t tartalmazó F-12 Ham DMEM tápanyag-keverékben (DMEM-F-12, Sigma) inkubáltuk 4 órán át 37 ° C-on, nedvesített 5% CO2-ban. légkör. Mivel az adipociták száma a szövet milligrammjában ismert, életkor és fenotípus szerint eltérő, a szövet-tápközeg arányát (1 g szövet 5–10 ml tápközeghez) úgy állítottuk be, hogy közelebbről megközelítsük az azonos zsírsejtek számát milliliter közeg. Inkubálás után a kondicionált táptalajt Whatman minőségi papíron történő szűréssel elválasztottuk a szövetfragmensektől, steril módon aszeptikus fiolákba szűrtük és -20 ° C-on fagyasztva tároltuk.

Biológiai vizsgálati rendszer: primer sejttenyészet.

Stromális-vaszkuláris sejteket, beleértve a preadipocitákat is, specifikus kórokozóktól mentes hím Sprague-Dawley patkányok (80–100 g; Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN) inguinalis zsírszövetéből nyertük korábban leírt módszerekkel (27). Röviden, az állatokat nátrium-pentobarbitál (50 mg/kg) intraperitoneális injekciójával érzéstelenítettük, és az inguinalis zsírszövetet aszeptikusan eltávolítottuk és egyesítettük. Minden egyes gramm aprított zsírszövetet 5 ml 0,1 M HEPES-t és 6,21 × 105 U/l 1-es típusú kollagenázt (Worthington Biomedical, Freehold, NJ) tartalmazó emésztőpufferrel inkubáltunk 90 percig 37 ° C-os rázóvízfürdőben. . Az emésztéseket nylon hálós szitákon szűrtük 240 és 20 μm nyílásokkal, reszuszpendáltuk DMEM-F-12-ben, és 10 percig 600 ° C-on centrifugáltuk. g. Az úszó zsírral töltött sejteket eldobtuk. A sztróma-vaszkuláris pelletben lévő sejteket plating táptalajjal (DMEM-F-12 10% marha magzati szérummal) mossuk, centrifugáljuk, majd reszuszpendáljuk plating táptalajban. A szuszpenzió egy alikvot részét Rappaport festékével összekevertük, és a sejteket hemocitométeren számláltuk. A sejteket hígítottuk táptalajjal, és 12,5 vagy 25 cm2-es szövetkultúra lombikba oltottuk 4,8x103 sejt/cm2 sűrűséggel. A tenyészeteket 37 ° C-on, nedvesített 5% CO2-atmoszférában inkubáltuk.

Biológiai vizsgálati rendszer: proliferációs vizsgálat.

Statisztikai analízis.

Az adatokat SuperAnova (1.11-es verzió, Abacus Concepts, Berkeley, CA) alkalmazásával varianciaanalízisnek vetettük alá, hogy meghatározzuk a fenotípus, az életkor és a depó hatását a zsírszövet cellularitási paramétereire és a kultúrában lévő preadipocyták proliferatív válaszát a zsírszövet jelenlétére. kondicionált közeg. Legalább négyzet kontrasztokat használtunk az átlagok összehasonlításához. Az egyszerű lineáris regressziót és a minta korrelációs együtthatóit kiszámítottuk, hogy meghatározzuk az összefüggést a sejtek százalékos aránya között a meghatározott mérettartományban, a kondicionált tápközeg in vitro proliferatív aktivitása és az in vivo zsírsejtszám változásai között a következő 3 hét alatt. A különbségeket jelentősnek fogadták el a P

1. táblázat: Zsírraktár jellemzői hím Zucker patkányokban

Az értékek a legkisebb négyzet alakúak ± SE; nem. patkányok/csoport zárójelben. Azok az értékek egymás után, amelyek nem osztanak levelet, jelentősen eltérnek egymástól (P F1-f P 50 μm. A két fenotípus közötti zsírsejt-eloszlás általános mintázatának további elmozdulását 6 hét múlva detektáltuk. A sovány patkányokban a zsírsejtek méretének megnövekedését bizonyították a sejtek többsége a három zsírraktárban, amelyeket most a 30–70 μm-es mérettartományokban észleltek. Bár az elhízott patkányok továbbra is jelentősen (P

1. ábra.Sejtméret-eloszlás profilja a különböző korú sovány és elhízott Zucker patkányok inguinalis zsírpárnájából. A bemutatott adatok a legkisebb négyzetes átlag ± SE 5–9 állatra vonatkoznak fenotípusonként, egy adott életkorban. A betűket nem megosztó mérettartományon belül az egyes korcsoportok értékei jelentősen eltérnek (P

2. ábra.Sejtméret-eloszlás profilja a különböző korú sovány és elhízott Zucker patkányok epididymális zsírpárnájáról. A bemutatott adatok a legkisebb négyzetes átlag ± SE 5-10 állat esetében, fenotípusonként, egy adott életkorban. A betűket nem megosztó mérettartományon belül az egyes korcsoportok értékei jelentősen eltérnek (P

3. ábra.Sejtméret-eloszlás profilja különböző korú sovány és elhízott Zucker patkányok retroperitoneális zsírpárnájából. A bemutatott adatok a legkisebb négyzetes átlag ± SE 4–8 állatra vonatkoznak fenotípusonként, egy adott életkorban. A betűket nem megosztó mérettartományon belül az egyes korcsoportok értékei jelentősen eltérnek (P

In vitro preadipocita proliferáció.

Kondicionált táptalajt alkalmaztunk a zsírszövetből kiválasztott parakrin anyagok azon képességének vizsgálatára, hogy befolyásolják-e a preadipocyták proliferációját egy primer sejttenyésztési rendszerben. Ez a biológiai vizsgálati rendszer a normál patkányok inguinális zsírpárnáiból származó tenyésztett sztróma-vaszkuláris sejteket (beleértve a preadipocitákat is) felhasználta a sovány és elhízott Zucker patkányok inguinalis, epididymális és retroperitoneális zsírraktárainak előkészítésére szolgáló kondicionált táptalaj proliferatív hatásának tesztelésére. Az adatokat korrigáltuk, hogy a tápközeg proliferatív aktivitását 100 000 zsírsejtnek kitéve kondicionáljuk, és a DMEM-F-12 bazális kontroll táptalajjal kezelt tenyészetek [3H] timidin felvételének különbségeként fejezzük ki.

Amint az a 4. ábrán láthatóA, a 3-, 6- és 12 hétes elhízott patkányok inguinalis zsírszövetéből előállított kondicionált táptalajnak kitett preadipociták szignifikánsan (P 3 H] timidin) összehasonlítva 15 hetes, sovány patkányokból készített táptalajjal tenyésztett tenyészetekkel, ahol a proliferációs aktivitás kisebb volt, mint az alapkontroll (−7,7 pM [3H] timidin).

4. ábra.[3H] timidin beépülése a patkány primer sejttenyészetek preadipocita frakciójába, amelyeket inguinalis 25% zsírszövet-kondicionált táptalajjal kezeltek (A,n = 4–8), mellékvese (B, n= 4–6) és retroperitoneális (C,n = 4) sovány és elhízott Zucker patkányok raktára. A bemutatott adatok a legkisebb négyzetes középértékek ± SE. Az adatokat korrigáltuk, hogy a kondicionált tápközeg előállításához felhasznált zsírszövetben jelen lévő 100 000 adipocita aktivitását reprezentáljuk, és ezeket a [3H] timidin felvételének különbségeként fejezzük ki a bazális kontroll táptalajjal kezelt tenyészetekhez viszonyítva. Egy adott raktár minden korosztálya esetében a levelet nem megosztó értékek jelentősen eltérnek (P

A 6 és 12 hetes elhízott patkányok epididymális zsírszövetéből előállított kondicionált táptalaj szignifikánsan (P 3 H] timidin) összehasonlítva elhízott patkányokkal (2,6 pM [3H] timidin). A többi korcsoportban (6, 12 és 15 hét) nem volt szignifikáns különbség a fenotípusok között az epididymális zsírszövetből kondicionált táptalajnak kitett stroma-vaszkuláris sejtek replikációs válaszában (az adatokat nem mutatjuk be).

Nem volt szignifikáns különbség a preadipocyták proliferációjában a sejttenyészetekben, amelyeket 9 vagy 15 hét sovány és elhízott patkányok retroperitoneális zsírszövetéből származó kondicionált táptalajjal kezeltek (4. ábraC). 12 hetes elhízott patkányok retroperitoneális zsírszövetéből előállított kondicionált táptalajnak kitéve azonban a preadipocyták szaporodása szignifikánsan (P

2. táblázat: A celluláris paraméterek és a proliferatív aktivitás összefüggése

A kis (30–60 μM), a közepes (60–100 μM) és a nagy (100–240 μM) zsírsejtek aránya, a zsírszövetekkel kondicionált táptalaj azon képessége, hogy elősegítse az in vitro preadipocita proliferációt, és az in vivo közötti összefüggés korrelációs együtthatói a zsírsejtek számának változása egy következő 3 hét alatt (azaz 9 és 12 hét között).

Köszönetet mondunk Todd McDanielnek és a Boyd Graduate Research Animal Facility munkatársainak az állattenyésztésért és gondozásért. Köszönet illeti Amanda Latimert, Krystyna Krast, Mee Yow Loh-t, Lori Lee-t és Letitia Hardeman-t is a mintagyűjtéshez és -feldolgozáshoz nyújtott segítségért.

LÁBJEGYZETEK

Ezt a kutatást részben az Országos Cukorbetegség, Emésztési és Vese Betegségek Intézetének DK-47246 támogatása és az Egyesült Államok Mezőgazdasági Minisztériuma előtti ösztöndíja támogatta B. G. Marques számára.

A cikk megjelenésének költségeit részben az oldaldíjak megfizetése fedezte. A cikket ezért ezennel fel kell tüntetni:hirdetés”Szerint a 18 U.S.C. 1734. § kizárólag ennek a ténynek a feltüntetésére.

HIVATKOZÁSOK

SZERZŐ MEGJEGYZÉSEK

Az újranyomtatási kérelmek címe: D. B. Hausman, Élelmiszerek és Táplálkozás Tanszék, Univ. Georgia, Athén, GA 30602.