A zsírszármazékokból származó VEGF – mTOR jelzés elősegíti az endometrium hiperpláziáját és a rákot: következmények elhízott nők számára

Keresse meg ezt a szerzőt a Google Tudósban
Keresse meg ezt a szerzőt a PubMed oldalon
Keresse meg ezt a szerzőt ezen a webhelyen
Levelezés céljából: [email protected]

Absztrakt

Bevezetés

Az elhízás számos krónikus betegség vezető oka, és globális egészségügyi problémává vált (1). Az epidemiológiai vizsgálatok pozitív összefüggést mutattak a testtömeg-index (BMI) és a különféle ráktípusok előfordulása között, beleértve az emlőt, a petefészket, a vastagbélt és az endometriumot (2). Ezen ráktípusok közül a méhnyálkahártya-rák mutat legerősebb kapcsolatot az elhízással. Az endometrium rák a leggyakoribb nőgyógyászati rák, és az esetek körülbelül 57% -a az elhízással függ össze az Egyesült Államokban (3, 4). Különböző altípusok közül az endometrioid endometrium rák (I. típus) a szövettani altípus, amely túlnyomórészt az elhízáshoz kapcsolódik, relatív kockázata 1,59 (5). Annak ellenére, hogy az elhízott nőknél az elmúlt néhány évtizedben jelentősen megnőtt az endometrium rák előfordulása, nagyon korlátozott laboratóriumi és klinikai vizsgálatokat végeztek a zsigeri adipozitás (zsírraktárak az omentumban és a bélrendszerben) szerepének kezelésére az endometrium rák progressziójában. Tehát annak a molekuláris mechanizmusnak a tisztázása, amellyel az adipociták megváltoztatják a méh normál működését és fiziológiáját, fontos a betegség patológiájának megértéséhez.

Anyagok és metódusok

Sejtvonalak, antitestek és reagensek

Ishikawa (Sigma # 99040201) humán endometrium rákos sejtvonalat 5% hő-inaktivált FBS-sel (Bovogen Biologicals) kiegészített MEM-ben (HyClone) tenyésztettünk, és az egér embrionális fibroblast adipóz-szerű sejtjeit (3T3-L1) DMEM magas glükózszintben tenyésztettük (HyClone) 10% FBS-sel kiegészítve. Mindkét sejtvonalat 2 mmol/l l-glutamint (HyClone) és antibiotikumokat (50 E/ml penicillin, 50 mg/l sztreptomicin; Gibco) tartalmazó táptalajban tartottuk 37 ° C-on és 5% CO2-nál. A sejtvonal-hitelesítést rövid tandem ismétlés (STR) DNS-profilozási módszerrel értékeltük, és a Mycoplasma-szennyeződést 3 havonta teszteltük.

Az ebben a vizsgálatban alkalmazott antitestek a következők voltak: VEGF (Santa Cruz Biotechnology # sc-7269) Western blot esetében, VEGF (R&D Systems # MAB293R) immunhisztokémia számára, VEGFR2 (CST # 9698), pVEGFR2 Tyr1175 (CST # 3770), CD31 ( Santa Cruz Biotechnology # sc-1506), Ki-67 (Abcam # ab15580), Foxa2 (DSHB # 4c7), Akt (CST # 4691), pAkt (CST # 4060), S6 (CST # 2317), pS6 (CST #) 4858), ERα (Santa Cruz Biotechnology # sc-542), PR (Santa Cruz Biotechnoloby # sc-539), Stathmin (CST # D1Y5A), β-aktin (DSHB # JLA20) és GAPDH (CST # 5174).

A vizsgálatban alkalmazott reagensek a következők voltak: indometacin (Sigma # 7378), dexametazon (Sigma # D1756), 3-izobutil-1-metilxantin (Sigma # 58879), 3,3 ', 5-trijido-L-tironin (Sigma) # T2877), 1. típusú kollagenáz (Sigma # C5894), Olajvörös O (Sigma # O0625), Kristálylila (Sigma # C3886), Tamoxifen (Sapphire Bioscience # 13258), DBL Karboplatin (Hospira # 611685A00) és ANZATAX Paclitaxel (Hospira) # 616841AAU).

Emberi zsírszövet minták

A Newcastle-i Egyetem Humánkutatási Etikai Bizottsága jóváhagyta az emberi zsírszövet gyűjtésének protokollját. A szubkután és a zsigeri zsírszöveteket DMEM/F-12 táptalajban gyűjtötték humán nőbetegektől (BMI> 30 kg/m 2), akiknél súlycsökkentés céljából bariatrikus műtétet végeztek. A betegek beleegyezését a jóváhagyott irányelvek szerint kaptuk.

Az érett zsírsejtek izolálása az emberi zsírszövetből

Az elsődleges zsírsejteket az emberi (szubkután és zsigeri) zsírszövetből izoláltuk, az előzőkben leírtak szerint (15), kisebb módosításokkal. Röviden: a zsírszövetet (kb. 50–100 mg) ledaráltuk, DPBS-sel mostuk, és 1%/ml 0,5% BSA-t tartalmazó kollagenáz (1. típusú) oldatban emésztettük 1 órán át 37 ° C-on, enyhe rázással. Az emésztőelegyet 45 μm-es sejtszűrőn (BD Biosciences) átengedtük, és 800 fordulat/perc sebességgel 5 percig centrifugáltuk. Az érett adipocitákat tartalmazó felső úszó réteget összegyűjtöttük, mostuk és DMEM/F-12-ben tenyésztettük. 48 óra elteltével az elsődleges adipocitákat tartalmazó táptalajt (500 μl) fecskendőszűrőn (0,22 μm, Millipore) átengedtük a szubkután és a zsigeri adipociták kondicionált táptalajának (SAT CM és VAT CM) összegyűjtésére. Sejtproliferációs kísérletben bazális DMEM/F-12 táptalajt szérummentes tápközegként (SFM) és 20% (v/v) SAT CM vagy VAT CM DMEM/F-12 táptalajban alkalmaztunk.

Humán méhnyálkahártya-rákminták elemzése

Formalin-fixált paraffinba ágyazott (FFPE) nonobese emberi endometrium szövet (n = 5) és nonobese (n = 7) és elhízott (n = 13) nők endometrium rákszövetét a Hunter Cancer Biobankból szerezték be, jóváhagyott intézményi humán kutatási etikával. Bizottsági jegyzőkönyvek. A szövetrészeket kivágtuk és festettük VEGF, VEGFR2, CD31 és pS6 szempontjából.

Tumor xenograft kísérletek

A Newcastle-i Egyetem Állatgondozási és Etikai Bizottsága jóváhagyta az egerek kísérletezésének valamennyi eljárását. Hat-8 hetes, nőstény NOD scid gamma egereket (The Jackson Laboratory) alkalmaztunk in vivo tumorigenicitási vizsgálatokhoz. Az Ishikawa-sejteket önmagában (1,5 × 106) vagy darált emberi szubkután és zsigeri zsírszövetekkel együtt (150 μl csomagolt sejttérfogat, PCV) injektáltuk szubkután növekedési faktorral csökkent Matrigelt (50 μL) az egerek szárába, az alábbiak szerint korábban (11). A daganatmennyiségeket hetente mértük digitális féknyergek segítségével (hosszúság × szélesség 2)/2 képlet alkalmazásával. A daganat tömegét a kísérlet végén határoztuk meg, és 10% -os pufferolt formalinban rögzítettük, paraffinba ágyazva és antitestekkel festett metszetekben a tumor patológiájának elemzésére. A daganatok metszetei szintén gyorsfagyasztottak és -80 ° C-on tárolódnak a fehérjeizoláció és a Western blot elemzés céljából.

Tamoxifen kezelések

A Newcastle-i Egyetem Állatgondozási és Etikai Bizottsága jóváhagyta az állatkísérleteket. Alms1 bbb/bbb és Alms1 bbb/+ Blobby egereket intraperitoneálisan injektáltunk hordozóval (szezámolaj, 100 μl) vagy tamoxifennel (100 μl 20 mg/ml törzskoncentráció; 20 mg tamoxifen oldva 1 ml szezámolajban, éjszakán át 37 ° C-on rázva). ° C-on és fényzáró edényben tároljuk; n = 4/genotípus kezelésenként). A kezeléseket háromszor megismételtük 48 óránként az egyes injekciók között. Az egereket az első injekció beadása után 14 nappal eutanizáltuk. A boncolás idején a méhszöveteket 10% -os pufferelt formalinban rögzítettük, paraffinba ágyazva, és szövettani elemzésekhez megfestett metszeteket.

A 3T3L1 fibroblasztok differenciálódása adipocitákká

A 3T3L1 fibroblasztokat az előzőekben leírtak szerint differenciáltuk adipocitákká (13). A differenciálatlan 3T3-L1 sejteket (pre-adipociták) kb. 95% -os konfluens stádiumig növesztettük (3. nap), és 48% -ig 10% FBS-t, 1 mmol/l inzulint és 30 μmol/l T3-ot tartalmazó DMEM-magas glükózszintű táptalajban indukáltuk őket. órák. Az indukciót követően a sejteket 125 nmol/l indometacinnal, 2 μg/ml dexametazonnal és 250 nmol/l metilizobutilxantinnal különböztettük meg, a tápközeg további 48 óránként történő cseréjével további 7 napig. A 12. napon a differenciált 3T3-L1 sejteket (Adipocytes) látható lipidcseppekkel figyeltük meg. A kondicionált táptalaj (CM) összegyűjtése preadipocitákból és differenciált adipocitákból a sejteket DPBS-sel öblítettük, majd a bazális táptalajnak tettük ki. 24 óra múlva a táptalajt összegyűjtöttük, és Amicon Ultra centrifugális szűrőegységekkel, 4000 fordulat/perc sebességgel, 30 percig 4 ° C-on centrifugáltuk. A felülúszót összegyűjtöttük és -80 ° C-on tároltuk a sejtproliferáció, a migráció és a kemoterápiás gyógyszerekre adott válaszok céljából. Különböző oldható fehérjéket, citokineket, kemokineket és növekedési faktorokat azonosítottunk a preadipocita és az adipocita kultúrák CM-jében Mouse XL Cytokine Array Kit (R&D Systems) segítségével a gyártó utasításait követve.

Proliferációs vizsgálat

Ötezer sejtet hármasban, 100 µl teljes táptalajba helyeztünk lyukanként, 96 üregű, lapos fenekű lemezeken (Corning Costar), és 24 órán át inkubáltuk 37 ° C-on, 5% CO2-tal a sejtek tapadásához. A sejteket ezután karboplatin, paklitaxel és adipocitákból vagy zsírszövetből származó kondicionált táptalajjal kezeltük, majd további 72 órán át inkubáltuk. Minden inkubációs periódus végén a sejtproliferációt és a túlélést CellTiter-Glo lumineszcens sejtek életképességi vizsgálatával (Promega) vizsgáltuk a gyártó protokollja szerint.

Klonogén vizsgálat

A sejtek túlélését úgy értékeltük, hogy 2000 Ishikawa sejtet/lyukon beoltottunk egy 6 üregű lemezre, és 3 naponta egyszer 20% PACM-mal és ACM-mel kezeltük. A 10. napon a sejteket 70% alkohollal rögzítettük és 0,5% kristálylilával festettük. 50 sejtet meghaladó vagy azzal egyenlő csoportot kolóniának tekintettek, és az ImageJ szoftver segítségével megszámolták.

Transwell migrációs vizsgálat

A szubkonfluens Ishikawa sejteket egy éjszakán át tenyésztettük szérummentes táptalajban (SFM). A migrációs vizsgálathoz 1 × 105 sejtet SFM-ben helyeztünk a Transwell-vizsgálati betétek felső kamrájába (6,5 mm átmérőjű, 8 μm pórusok, Sigma # CLS3422), míg önmagában vagy 20% PACM-ot és ACM-et tartalmazó MEM SFM-et adtunk hozzá. az alsó kamra. 24 órás 37 ° C-on történő inkubálás után a migrált sejteket 70% alkohollal rögzítettük, és 10 percig kristálylilával (0,5%) festettük. A belső kamrában lévő sejteket mechanikusan megtörölték pamut törlőkendővel. A membránhoz kapcsolt sejteket ImageJ szoftver segítségével képmásoltuk és számszerűsítettük.

Immunblot elemzés

Az emberi zsírszövetben és az egér xenograft tumorokban érdekes fehérjéket Western-blot analízissel határoztuk meg, az előző tanulmányunkban leírtak szerint (16). Röviden, a zsírszövetet és az Ishikawa tumorokat PBS-sel mostuk, és jéghideg RIPA (radioimmunoprecipitation assay) pufferben homogenizáltuk, amely proteázt és foszfatáz inhibitorokat (Sigma) tartalmazott. Az azonos fehérjetömeget tartalmazó szövethomogenát alikvotjait 1X Laemmli mintapufferben melegítettük 5 percig 95 ° C-on. A mintákat (30 μg fehérje) SDS-PAGE-nak vetettük alá (10% -os rezolváló gél), nitrocellulóz-blotmembránra (GE Healthcare Life Sciences) vittük át és próbáztuk VEGF primer antitesttel (1/500), pS6 (1/2000), S6 (1/2000), pAkt (1/1 500), Akt (1/1 500), VEGFR2 (1/1 000), pVEGFR2 Tyr1175 (1/1 000) egy éjszakán át tartó inkubáláshoz 4 ° C-on. A membránokat mostuk és torma-peroxidázzal (Jackson ImmunoResearch Laboratories) konjugált másodlagos antitestekkel inkubáltuk 1 órán át szobahőmérsékleten. Az érdeklődő fehérjét a fokozott kemilumineszcenciával tettük láthatóvá LAS-4000 (FUJIFILM) lumineszcens képelemzővel, és az ImageJ (NIH, USA) denzitometriával számszerűsítettük.

Immunhisztokémia és immunfluoreszcencia

Statisztikai analízis

Az adipocita eredetű VEGF-mTOR jelátvitel elősegíti az endometrium rák növekedését

Emberi betegek in vitro differenciált adipocitáinak eredményeink validálásához a magas BMI (> 30 kg/m 2) nőstény betegek SAT-jából és VAT-jából származó primer adipocitákat izoláltunk és tenyésztettünk, akiknél súlycsökkenés miatt bariatrikus műtéten estek át (2A. Ábra). A humán ACM hozzáadása 20% (v/v) koncentrációban jelentősen elősegítette az endometrium sejtproliferációját szérum éhezési körülmények között (2B. Ábra). Érdekes, hogy az VAT CM-nek nagyobb volt a tendenciája az Ishikawa sejtproliferáció modulálására, mint a SAT CM-ről. Figyelembe véve ezeket a megállapításokat, megvizsgáltuk, hogy az adipociták befolyásolják-e az endometrium sejtjeinek növekedését egy háromdimenziós környezetben (ami intim módon utánozza az endometrium mirigyek in vivo szerveződését; 2C. Ábra). Ahogy az várható volt, a kontroll tenyészet Ishikawa sejtjei általában kerek és gömb alakú klasztereket képeztek, amelyek központi lumenűek voltak (2Ca, b, b 'ábra). Összehasonlításképpen: az VAT CM-vel tenyésztett Ishikawa sejtek tendenciát mutattak a pleomorfizmusra, és morfológiailag ezeknek az endometrium organoidoknak nagyobb a sejtcsoportja, meghatározott lumen nélkül (2Cc, d, d 'és D ábra).

Mivel a VAT a VEGF fehérje magasabb expresszióját mutatta és elősegítette a tumor növekedését, megvizsgáltuk, hogy a VEGF által közvetített angiogenezis fenntartja-e a tumor növekedését. Az endoteliális sejtek jól megalapozott markerének, a CD31-nek a tumorokon végzett immunolokalizációja a CD31-pozitív erek nagyobb százalékát mutatta ki Ishikawa-VAT daganatokban, mint a kontroll és SAT daganatokban (2. ábra Jd-f és L). Jelentős pozitív korrelációt észleltünk a Ki-67– és a CD31 pozitív erek expressziója között Ishikawa-VAT daganatokban is (2M ábra; r = 0,892, P = 0,0421). Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy a VAT jelentős mértékben hozzájárul az endometrium rák növekedésének elősegítéséhez a VEGF révén.

A hiperfágikus elhízott (Blobby) egerek fokozatosan fejlesztik az endometrium hiperpláziáját hiperaktív VEGF-mTOR jelzéssel

Annak bizonyítására, hogy az inkrementális súlygyarapodás az endometrium kóros elváltozásainak kialakulásához vezet, az Alstrom-szindróma (egy ritka humán genetikai betegség, amely súlyos elhízáshoz vezető hiperfágia, egérmodell) egérmodelléből vizsgáltuk a méheket; Az emberekhez hasonlóan az Alms1 gén homozigóta pontmutációjú egerei (Alms1: c.6507T> A) túlevés és elhízás alakul ki pubertás után standard chow-étrenden. Ezeket az egereket „Blobby” törzsnek nevezik (Alms1 bbb/bbb; Australian Phenomics Facility). Nőstény homozigóta Blobby (Alms1 bbb/bbb) egereink a heterozigóta (Alms1 bbb/+) alomtársakhoz viszonyítva fokozatosan híztak 7 hetes kortól, és a súlygyarapodás az életkor előrehaladtával fokozatosan nőtt (3A. Ábra). 20 hetes korukban a Blobby egerek súlya átlagosan 38 ± 2,3 g volt, vagy csaknem kétszeres testtömegük volt a heterozigóta alomtársakkal összehasonlítva, 22 ± 0,6 g (3A és B ábra). Ez a megnövekedett testtömeg a hasi AT tömegének 11,4–1,4-szeres növekedésével járt, amely a hasüreg belsejében lokalizálódott és a méhhez kapcsolódott (3C. És D ábra). Összhangban az endometrium rák xenograft modellben (2J ábra) tett megfigyeléseinkkel, a Blobby egereknek (Alms1 bbb/bbb) szintén szignifikánsan több volt az AT és a méh összekötő erének heterozigótákhoz (Alms1 bbb/+; 48,7 ± 3,8 vs. 14,7 ± 0,9; 3D és E ábra).

A túlzott hasi zsírlerakódás méhre gyakorolt hatásainak tanulmányozásához homozigóta és heterozigóta Blobby egerekből gyűjtöttük a méheket. Három hónapos korban, amikor a homozigóta és heterozigóta Blobby egerek testtömege nem volt szignifikánsan különbözõ, az Alms1 bbb/bbb és az Alms1 bbb/+ egerek méhszelvényeinél nem voltak nyilvánvaló szövettani különbségek (3F ábra). Azonban 6 hónapos korban, amikor a homozigóta Blobby egerek jelentősen túlsúlyosak voltak a kontrollokhoz képest, a szövettani és immunhisztokémiai (Foxa2: mirigyjelző) elemzés az endometrium mirigyek számának jelentős növekedését mutatta a stromában, ami az endometrium hiperpláziájára utal ( EH; 28. hivatkozás; 3F. És G. Ábra; S3. Kiegészítő ábra; méhnyálkahártya-mirigyek: Alamizsna1 bbb/bbb, 101,33 ± 2,6 vs. Alms1 bbb/+, 54,67 ± 4,1).

A petefészek hormonok a méh működésének és betegségeinek fő szabályozói (30). Annak megállapításához, hogy a szteroid hormonok (ösztrogén és progeszteron) befolyásolják-e az Alms1 bbb/bbb egerek hiperplasztikus méhét, megvizsgáltuk az ösztrogén és a progeszteron receptor (ERα és PR) expresszióját, és nem találtunk különbséget e két hormon expressziós mintázatában receptorok elhízott és nem elhízott Blobby egerek között (3M ábra). Összefoglalva, ezek az eredmények azt mutatják, hogy a fokozódó súlygyarapodás a fokozott hasi zsírlerakódással az EH patogeneziséhez vezet blobb egerekben, ami az endometrium rák prekurzor állapota.