Helicobacter pylori és gyulladáscsökkentő hatások, valamint a módosított Xiaochaihutang krónikus gyomorhurut és gyomorfekély kezelésére szolgáló alkotóelemek elemzése

Xin Chen

1 A hagyományos kínai orvoslás és a hagyományos kínai orvoslás kémiai laboratóriuma, Hubei Kínai Orvostudományi Egyetem, Wuhan 430060, Kína

Lijuan Hu

1 A hagyományos kínai orvoslás és a hagyományos kínai orvoslás kémiai laboratóriuma, Hubei Kínai Orvostudományi Egyetem, Wuhan 430060, Kína

Huanhuan Wu

1 A hagyományos kínai orvoslás és a hagyományos kínai orvoslás kémiai laboratóriuma, Hubei Kínai Orvostudományi Egyetem, Wuhan 430060, Kína

Wei Liu

1 A hagyományos kínai orvoslás és a hagyományos kínai orvoslás kémiai laboratóriuma, Hubei Kínai Orvostudományi Egyetem, Wuhan 430060, Kína

Shuhe Chen

2 a hagyományos kínai orvoslás Hubei tartományi kórháza, Wuhan 430060, Kína

Aijun Zhou

3 Dongguan hagyományos kínai orvoslás kórháza, Dongguan 523000, Kína

Yanwen Liu

1 A hagyományos kínai orvoslás és a hagyományos kínai orvoslás kémiai laboratóriuma, Hubei Kínai Orvostudományi Egyetem, Wuhan 430060, Kína

Absztrakt

1. Bemutatkozás

A krónikus gyomorhurut és a gyomorfekély nagyon elterjedt emésztőrendszeri betegségek a világ minden életkorában, és globális egészségügyi problémának számítanak [1]. Általában egyensúlyhiányt eredményeznek a gyomornyálkahártya védő tényezői és agresszív tényezői között [2]. Ezeket számos tényező kiválthatja, például Helicobacter pylori (H. pylori) fertőzés [3], alkohol, stressz és nem szteroid gyulladáscsökkentők (pl. Aszpirin, ibuprofen és naproxen) [4]. A korai diagnózis és kezelés javíthatja a betegek jólétét és csökkentheti a gyomorrák végső kockázatát; ennélfogva a H. pylori fertőzés korai diagnózisa kritikus fontosságú [5]. Eddig a krónikus gyomorhurut és a gyomorfekély továbbra is rosszul ismert entitás, a krónikus gyomorhurut és a kapcsolódó dyspeptikus tünetek kezelésére jelenleg nincsenek hatékony farmakológiai stratégiák [6]. A krónikus gyulladás fontos szerepet játszik a különféle rákos megbetegedések kialakulásában, különösen az emésztőszervekben, beleértve a H. pylori-hoz társult gyomorrákot is [7].

A H. pylori fertőzés a gyomor krónikus gyulladásának leggyakoribb oka világszerte [8]. A Warren és Marshall által 1982-ben felfedezett baktérium a világ népességének mintegy felét kolonizálja. Minden H. pylori fertőzött egyénnél krónikus gyomorhurut alakulhat ki [7–10]. A H. pylori világszerte magas gyakorisággal rendelkezik, különösen a fejlődő országokban [11]. A H. pylori fertőzés magas előfordulása ellenére a becslések szerint a fertőzöttek 1% -ánál noncardia gyomorrák alakul ki [12]. Noha az antibakteriális szerek, például az amoxicillin, a klaritromicin és a metronidazol orális beadását világszerte a H. pylori fertőzött betegek kezelésére végzik, az antibakteriális szerekkel szembeni rezisztencia évről évre növekszik [13, 14]. Ennek eredményeként nagy szükség merült fel új anti-H felfedezésére és kifejlesztésére. különösen a gyógynövényekből származó pylori gyógymódok, amelyek nemcsak felszámolják és esetleg megakadályozzák a szervezetet, hanem minimális mellékhatásokkal is járnak, könnyen hozzáférhetők és még a szegények számára is megfizethetőek.

Xiaochaihutang (XCHT), a klasszikus kínai gyógynövényes receptet először kétezer évvel ezelőtt rögzítették a „Shanghan Lun” -ban [15, 16]. Hét kínai közös gyógynövényből áll: Chaihu (Radix Bupleuri), Huangqin (Radix Scutellariae), Renshen (Ginseng), Banxia (Pinellia tuber), Radix Glycyrrhizae (Család: Leguminosae; Latin neve: Glycyrrhiza uralensis Fisch.), Gancao ( Glycyrrhizae), Shengjiang (Rhizoma Zingiberis Recens) és Dazao (Fructus Jujubae). A Radix Bupleuri az XCHT fő hatóanyaga, és széles körben alkalmazzák különféle gyulladásos rendellenességek, például krónikus hepatitis [17], bronchitis, közönséges megfázás, tüdőgyulladás, enterogastritis [18] és depressziós rendellenességek kezelésére Kínában [ 19., 20.].

Kutatásunk során ezt a klasszikus receptet több mint tíz éves klinikai tapasztalat javította Kína déli városaiban, nagy hatékonyságú, alacsony kiújulású, alacsony mellékhatású és alacsony költségű karakterekkel. Ebben a módosított receptben Renshen (Ginseng) helyébe Dangshen (Radix Codonopsis) került a költségek csökkentése érdekében; továbbá további négy chinense gyógynövényt, a Huanglian-t (Rhizoma Coptidis), a Ganjiang-ot (Rhizoma Zingiberis), a Fuling-et (Poria) és a Baizhu-t (Rhizoma Atractylodis Macrocephalae) adták a szél-hideg/meleg kettős célú, csípős gyógyszerek funkcióihoz. diszperzió és keserű gyógyszerek a tisztításhoz, tonizáláshoz és tisztításhoz kombinálva, és létrehozták a módosított Xiaochaihutang-ot (MXCHT).

Ezt a receptet a krónikus gyomorhurut és a gyomorfekély kezelésére használták H. pylori fertőzéssel, magas gyógyulási arány mellett, amelyet rendszertelen életmód és gyors ütemű munkakörnyezet okozott. Tudomásunk szerint mind a klasszikus XCHT, mind az MXCHT krónikus gyomorhurut és gyomorfekély kezelésére vonatkozóan nem nyújtottak tudományos bizonyítékot. Ezért elvégeztük ezt a vizsgálatot, hogy megerősítsük az MXCHT hatékonyságát a gyomor krónikus gyulladásában, és feltárjuk annak aktív alkotóelemeit. Vizsgálatunk az első, amely az anti-H hatékony kivonatát vizsgálta. Az MXCHT pylori és gyulladáscsökkentő hatása, majd az aktív kivonat HPLC-TOF-MS/MS módszerrel történő orális beadása után azonosítsa a fő alkotóelemeket. Eredményeink nemcsak az in vitro anti-H-t tisztázzák. az MXCHT pylori és gyulladáscsökkentő hatása, de részben feltárja a vér fő aktív összetevőit is. Javasoljuk, hogy az MXCHT potenciálisan hatékony terápiás megközelítés a krónikus gyomorhurut és a gyomorfekély H. pylori fertőzéssel történő kezelésében.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Anyagok és reagensek

Az MXCHT 15 g Radix Bupleuri (család: Umbelliferae; latin név: Bupleurum chinense DC), 10 g Radix Scutellariae (család: Labiatae; latin neve: Scutellaria baicalensis Georgi), 10 g Rhizoma Pinelliae [család: Araceae; Latin neve: Pinellia ternata (Thunb.) Breit.], 10 g Radix Codonopsis [Család: Campanulaceae; Latin neve: Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf.], 6 g Radix Glycyrrhizae (család: Leguminosae; latin név: Glycyrrhiza uralensis Fisch.), 30 g Fructus Jujubae (család: Rhamnaceae; latin név: Ziziphus jujuba Mill.), 10 g Rhizoma Zingiberis Recens (család: Zingiberaceae; latin név: Zingiber officinale Rosc.), 6 g Rhizoma Zingiberis (család: Zingiberaceae; latin név: Zingiber officinale Rosc.), 3 g Rhizoma Coptidis (család: Ranunculaceae; Latin neve: Coptis chinensis Franch.), 15 g Poria [Család: Polyporaceae; Latin neve: Poria cocos (Schw.) Wolf], és 10 g Rhizoma Atractylodis Macrocephalae (család: Compositae; latin név: Atractylodes macrocephala Koidz). A nyers gyógyszereket a Jiuzhoutong Chinese Pharmaceutical Co. Ltd.-től (Wuhan, Kína) vásárolták, és hitelesítésüket Keli Chen professzor (gyógyszerészeti kar, Hubei Kínai Orvostudományi Egyetem, Kína) végezte. Az utalványmintákat a Hubei Kínai Orvostudományi Egyetem herbáriumában helyezték el.

Baicalin (110715-201318), Liquiritin (111610-201106) és Saikosaponin A (110777-201309) az Országos Élelmiszer- és Gyógyszerellenőrzési Intézetektől származnak. A baicalein (PS1405-1604) és a glicirrizinsav-ammóniumsó (PS0061-0020) a Push Bio-Technology Company-tól (Chengdu, Kína) származik. A pozitív kontrollként használt klaritromicint és aszpirint a Yabang Pharmacy-től (Jiangsu, Kína) és az Original Pharmacy-től (Shenyang, Kína) szereztük be; normál sóoldatot kaptunk a Double-Crane Pharmacy-től (Peking, Kína); λ-karragént a Sigma Company-tól vásárolták; kémiai minőségű reagenseket a China National Pharmaceutical Group Corporation-től vásárolták.

2.2. Különböző kivonat készítése MXCHT-ből

Az MXCHT kivonatait három eljárással készítettük. Az egyik eljárás a gőz desztilláció, amelyet illékony olaj előállításához használtak; a második a vízkivonás, amelyet több szárított gyógynövény-keverék desztillált vízben történő 1 órán át végzett macerálásával, majd háromszor forralással hajtottak végre (először 100 g/1200 ml; másodszor 100 g/1000 ml; 100 g/800) ml harmadik alkalommal) 1,5 órán át; a harmadik szonikus extrakció (metanol: HCl = 100: 1, háromszor, 0,5 óra alatt). Különböző szerves reagensekkel, oldószeres módszerrel, az alkotórészek polaritása vagy szerkezeti tulajdonságai alapján történő elválasztás után öt különböző kivonatot kaptunk, köztük illékony olajat (0,15 tömeg%), vizes kivonatot (13,3 tömeg%). CHCl3-kivonat (0,58%, m/m), EtOAc-kivonat (1,17%, m/m) és n-BuOH-kivonat (3,61%, m/m). A berizin-vegyületek miatt a Rhizoma Coptidis metanol-kivonatát CHCl3-kivonattal összekeverték.

2.3. Fogékonyság tesztelése

Az agar csésze diffúziós technikával határoztuk meg a H. pylori érzékenységét öt kivonattal szemben. A H. pylori törzset (ATCC43504, Beinuo Life Science, Shanghai) Columbia agaron növesztettük 5% steril defibrinált juhvérrel 37 ° C-on 72 órán át mikroaerofil körülmények között (5% O2, 10% CO2 és 85% N2). és 98% páratartalom. Az ATCC43504 szuszpenziót normál sóoldattal hígítottuk. A klaritromicint pozitív kontrollként, míg tesztvegyületek nélküli tiszta oldószert negatív kontrollként használtuk.

A teljes receptet és a vízkivonatot 10 ml desztillált vízzel hígítottuk; a másik négy kivonatot 10 ml 1% (v/v) Tween-80% és desztillált vízben oldva készítettük el. Óvintézkedésként, hogy ne hagyja ki az antimikrobiális szerek nyomának mennyiségét, az előzetes szűréshez az egyes kivonatok viszonylag magas koncentrációját készítettük alacsonyabb koncentrációjú tesztekhez a teljes receptre. A tiszta klaritromicint 15 ml desztillált vízben oldjuk, így 16,67 mg/ml koncentrációt kapunk.

Az antimikrobiális szűrést agar diffúziós módszerrel hajtottuk végre [21]. 15 ml olvadt Columbia agart 50 ° C-on, 5% steril defibrinált juhvérrel kiegészítve 1 ml 1: 100 hígítású friss éjszakai ATCC43504 szuszpenziós tenyészettel (kb. 1 × 105 cfu/ml) oltottuk és alaposan összekevertük. . Az elegyet aszeptikusan Petri-csészékbe öntjük, és hagyjuk megszáradni. HB-négy Oxford Kupát használtunk egyenlő távolságra lévő üregek készítéséhez a magozott agarban. 100 μl feloldott kivonatot helyeztünk a mélyedésekbe. A gyógyszer-pozitív kontrollt és a negatív kontrollt egyformán helyeztük el a megfelelő üregekben. A beoltott lemezeket 37 ° C-on inkubátorban inkubáltuk mikroaerofil körülmények között (5% O2, 10% CO2 és 85% N2) 3 napig, majd megmértük a gátlási zónák átmérőjét (mm). Mindegyik kísérletet háromszor megismételtük a pontosság érdekében, és kiszámítottuk a gátlási zónák átmérőjének átlagát. A kontrollok magukban foglalták az oldószer tesztkivonat nélküli alkalmazását, bár a tesztben alkalmazott oldószerben nem tapasztaltunk antibakteriális hatást.

2.4. Minimális gátló koncentráció (MIC) meghatározása

A MIC-értéket agar-hígítási módszerrel határoztuk meg, a korábban leírtak szerint [21]. Különböző extraktumokat Columbia agar táptalajjal hígítottunk, hogy adott koncentrációjú törzsoldatok sorozatát kapjuk. 1 ml ilyen oldatot és 50 μl friss ATCC43504 szuszpenziót (kb. 1 × 107 cfu/ml) adunk 2 ml-es kémcsőbe. Pozitív kontrollt készítettünk 1 ml táptalajjal és 50 μl friss ATCC43504 szuszpenzióval (kb. 1x107 cfu/ml); negatív kontrollt készítettünk 2 ml táptalajjal. Ezután az összes kémcsövet 37 ° C-on inkubáltuk 72 órán át mikroaerofil körülmények között. A MIC-t az antibiotikumok legalacsonyabb koncentrációjaként határoztuk meg, amelynél az inokulum növekedése teljesen gátolt volt. Az összes vizsgálatot két példányban végeztük.

2.5. Állatok

A Kunming egeret (18–22 g) és a hím Wistar egeret (190–210 g) a Hubei tartományi Kísérleti Állatközpont szállította. Az állatokat standardizált környezeti körülmények között tartottuk (22 ± 2 ° C, 12 órás fény/sötét ciklus), szabad hozzáféréssel az élelemhez és a vízhez, és ketrecenként hatként helyeztük el őket. Valamennyi kísérletet a Kínai Állami Tudományos és Technológiai Bizottság által kiadott Kísérleti Állatok Adminisztrációjának megfelelően hajtották végre.

2.6. Xilén okozta egér fül ödéma modell

A teljes recept és öt kivonat gyulladáscsökkentő hatásának értékeléséhez egy xilol által kiváltott egérfül ödéma modellt indukáltak 20 μL xilol oldószer topikus alkalmazásával, amelyet korábban leírtunk [22, 23]. Röviddel ezután 112 Kunming egeret (18–22 g) osztottak véletlenszerűen 14, nyolc-nyolc csoportba, és mindegyik egeret 6 napig orálisan adtuk be az alábbiak szerint: Az 1. csoport 0,9% -os sóoldatot kapott; A 2. csoport kilogrammonként 50 mg aszpirint kapott pozitív kontrollként; A 3. és 4. csoport a teljes vény klinikai dózisát testtömeg-kilogrammonként kétszer, illetve kétszer kapta; Az 5–14. Csoportok az egyes kivonatok egy, illetve négyszeres klinikai adagját kapták testtömeg-kilogrammonként. Az ödémát úgy indukálták, hogy a jobb fül belső és külső felületére 20 μL xilolt vittek fel. A bal fület tekintettük kontrollnak. Miután xilolt alkalmaztunk 45 percig, az egereket éteres érzéstelenítésben leöltük, mindkét fülüket eltávolítottuk és lemértük.

2.7. Karragén-indukált patkány mancs ödéma modell

A teljes recept és öt kivonat antinociceptív hatásának értékeléséhez egy karrageenan-indukálta egér mancsödéma-modellt indukáltunk a korábban leírt 1% (v/v) karrageenán (100 μL) helyi alkalmazásával [24]. Röviden: 112 hím Wistar patkányt (190–210 g) véletlenszerűen 14, nyolc-nyolc csoportba osztottunk, és mindegyik egeret orálisan adtuk 6 napig az alábbiak szerint: Az 1. csoport 0,9% -os sóoldatot kapott; A 2. csoport kilogrammonként 75 mg aszpirint kapott pozitív kontrollként; A 3. és 4. csoport a teljes vény klinikai dózisát testtömeg-kilogrammonként kétszer, illetve kétszer kapta; Az 5–14. Csoportok a kivonat egy, illetve négyszeres klinikai adagját kapták testtömeg-kilogrammonként. 100 μl normál sóoldatban lévő 1% -os karragén-szuszpenziót injektáltunk mindegyik patkány jobb hátsó mancsának talpi oldalába, miután a vizsgálati mintákat 1 órán át orálisan beadtuk. A mancs térfogatát pletizmométerrel mértük 1, 2, 3, 4 és 5 órával a karrageenán injekció után. A duzzanat mértékét a delta térfogattal (a - b) értékeltük, ahol a és b a jobb hátsó mancs térfogata a karrageenán kezelés után, illetve előtte.

2.8. Etanol okozta fekély

A patkányokat nyolc állat csoportjára osztottuk, mindegyiket előkezeltük vivőanyaggal (Veh: víz plusz 1% tween, 1 ml/kg, po), ranitidinnel (Cbn: 0,04 g/kg, po), MXCHT-vel (16,5 és 33 g/kg)., po) vagy a hatékony kivonatok csoportja (0,75 és 1,5 g/kg, po) 7 nappal azelőtt, hogy 0,2 ml etanolt (PA) (0,5 ml/100 g) kapnának a gyomorfekély kiváltása érdekében. 1 óra etanol beadása után az állatokat eutanizáltuk. Ezután a laposodott gyomrot néztük meg, és annak sérülési csíkjait egy Vernier-féknyereggel mértük, hogy a gyomornyálkahártya elváltozását a következőképpen értékeljük: a csíkhosszt felvettük az elváltozás pontszámaként, és a pontszám megduplázódna, ha a csíkszélesség meghaladja az 1 mm-t [25] . Az egyes csoportok átlagos léziós pontszámát léziós indexként fejeztük ki, és a lézió gátlási sebességét a következő képlettel számítottuk:

2.9. Plazma minta előkészítése

Az extraktumok (1,5 ml/100 g) 0,5 órás végső beadása után 6 hím Wistar egérből vakként és dóziscsoportként vett vérmintákat gyűjtöttünk a szuborbitális vénából heparinizált csövekbe, és 10 percig 3500 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk. A felülúszót megkaptuk és -20 ° C-on tároltuk. Csoportonként három egér összes plazmamintáját egy mintába egyesítettük az egyéni variabilitás kiküszöbölése érdekében. 1 ml plazma mintát fehérje kicsapással extraháltunk 3 ml acetonitrillel. 10 percig 12000 fordulat/perc sebességgel végzett centrifugálás után a felülúszót enyhe nitrogénáram mellett 40 ° C hőmérsékleten szárazra pároljuk. Ezután a maradékot 200 µl metanollal rekonstruáltuk; Elemzés céljából 0,6 μl felülúszót injektáltunk a HPLC-TOF-MS/MS rendszerbe. Ezenkívül az üres vérmintát ugyanígy dolgozták fel.

2.10. Az MXCHT elemzése HPLC-TOF-MS/MS rendszerrel

A klasszikus Xiaochaihutang-ról (XCHT) 44 komponenst, köztük Saikosaponint, ginsenozidot, Baicalint és Liquiritint azonosítottunk a korábbi jelentésekben leírt HPLC-MS/MS módszerrel [26, 27]. Ebben a kutatásban HPLC-TOF-MS/MS-t alkalmaztunk az MXCHT két aktív kivonatának, az EtOAc-kivonatnak és az n-BuOH-kivonatnak a kémiai összetevőinek azonosítására. A HPLC-TOF-MS/MS rendszer egy Agilent 1260 Infinity nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC) rendszerből állt, amely egy Agilent 6530 Q-TOF tömegspektrométerhez volt kapcsolva (Agilent Corporation, USA). Az adatokat az Agilent MassHunter kvalitatív elemzés B.07.00 szoftver segítségével gyűjtöttük és dolgoztuk fel.

A kromatográfiás elválasztást Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 RRHD-n (50 × 2,1 mm, i.d., 1,8 μm) végeztük, az oszlop hőmérsékletét 30 ° C-on tartva, és a detektálási hullámhossz 275 nm volt. A gradiens mozgófázist acetonitril (a) és 0,1% vizes hangyasav (b) alkotja 0,4 ml/perc áramlási sebességgel. A gradiens elúciós programot az 1. táblázat mutatja. Az MS elemzést pozitív és negatív ion üzemmódban egyaránt működő elektromos szóróforrással hajtottuk végre, a tömegviszonyok mellett az alábbiak szerint: a kúpfeszültség 25 V, a kapilláris feszültség 3,0 KV pozitív ion üzemmódban és 3,0 KV negatív ion módban. A deszolváláshoz nitrogént és 8 l/perc áramlási sebességű kúpgázt alkalmaztunk 320 ° C-os hőmérsékleten és a forráshőmérséklet 120 ° C-on. Az ütközési gáz argon. Az MS-adatokat teljes szkennelési módban m/z 100 és 1000 amu között gyűjtöttük.

Asztal 1

Gradiens elúciós program HPLC-TOF-MS/MS módszerrel.