E-vitamint nélkülöző Arabidopsis mutáns izolálása és az összes tokoferol bioszintézishez elengedhetetlen cikláz azonosítása

Szerkesztette Elisabeth Gantt, Marylandi Egyetem, College Park, MD, és jóváhagyta 2002. július 16-án (beérkezett felülvizsgálatra 2002. június 3-án)

amelyből

Absztrakt

Életciklusa során a magasabb rendű növényeket különféle abiotikus és biotikus stressztényezőknek teszik ki, beleértve a magas hőmérsékletet, az aszályt, a nagy fényt és az öregedést. Ilyen stressz körülmények között a molekuláris oxigénből származó reaktív oxigénfajok (peroxid, hiperoxid, hidroxilgyökök, szingulett oxigén) felhalmozódhatnak a levelekben, ami számos fontos sejtkomponens, köztük fehérjék, klorofill és lipidek oxidációját eredményezi, és végül eredményt adhat sejthalálban (pl. 1–4. hivatkozás). Különböző biokémiai redoxirendszerek vesznek részt a növény reakciójában az oxidatív stresszre - például aszkorbát, glutation, szalicilát és tokoferol (5–8). Ezenkívül a stresszhez kapcsolódó gének transzkripcióját indukálják, ami a reaktív oxigénfajták eltávolításában részt vevő enzimek expresszióját eredményezi (9, 10). A specifikus lipidek stressz okozta felhalmozódásának szerepét csak rosszul értik (11–13). A növényi membránokban bővelkedő galaktolipidekkel és foszfolipidekkel ellentétben a stressz során különböző lipidek (triacil-glicerin, szabad zsírsavak és tokoferol) halmozódnak fel a levelekben.

A tokoferol egy amfifil lipidet jelent, amelyet a növényi membránok oxidatív stressz-válaszának szempontjából kulcsfontosságúnak javasoltak (5 A membránok lipid/víz határfelületéhez közel elhelyezkedő hidrofil kromanolgyűrű egy hidrokinon gyűrűrendszert foglal magában, amely képes reaktív oxigénfajtákkal redoxireakciókon átesni (5, 14). A metilcsoportok száma és elhelyezkedése alapján a hidrokinongyűrűn a tokoferol négy formáját lehet megkülönböztetni (α-, β-, γ-, δ-tokoferol). A tokoferolokon kívül a tokotrienolok kis mennyiségben találhatók a növényi szövetekben. A tokotrienolok telítetlen geranilgeranil oldalláncot hordoznak, amely a telített fitilánc helyett a kromanolgyűrűhöz kapcsolódik. Pontos funkciójuk növényekben nem ismert. In vitro kísérletekben kimutatták, hogy a tokoferol felelős a reaktív oxigénfajták eltávolításáért, megakadályozva ezzel a zsírsavak oxidatív lebomlását a membránokban (15–17). Mivel a tokoferol különösen gazdag a kloroplaszt membránokban (18, 19), azt javasolták, hogy vegyen részt a kloroplaszt lipidek és a klorofill oxidatív károsodás elleni védelmében.

A tokoferol és a tokotrienol nyolc különböző formája (amelyet általában E-vitaminnak neveznek) az emberi étrend alapvető elemét képviselik, az α-tokoferol mutatja a legnagyobb E-vitamin aktivitást (20, 21). Sok erőfeszítést fordítottak az E-vitamin szerepének feltárására az állatok oxidatív stresszében. A növényekhez hasonlóan feltételezzük, hogy az emlősökben az E-vitamin fő funkciója a reaktív oxigénfajták eltávolítása. Patkányok E-vitamin-hiánya meddőséghez és magzati halálhoz vezet (22). A növényi rendszerhez hasonlóan azonban nem nyertek egyértelmű bizonyítékot a tokoferol in vivo szerepére az oxidatív stressz során.

Nagy teljesítményű biokémiai szűrési módszereket sikeresen alkalmaztak a lipid bioszintézisben érintett növényi mutánsok elkülönítésére (pl. 23. és 24. hivatkozás). Az ilyen mutánsok rendelkezésre állása volt az alapja a megfelelő gének kromoszóma-járással történő izolálásának (pl. 25. és 26. hivatkozás). A tokoferol működésének tisztázása az oxidatív stressz reakció útján megkezdtük a tokoferol bioszintézisében mutációkat hordozó Arabidopsis növények szűrővizsgálatát. Biokémiai, TLC-alapú szűrési eljárást alkalmazva képesek voltunk izolálni egy tokoferoltól mentes mutánt.

Anyagok és metódusok

Tokoferolhiányos mutáns izolálása és molekuláris jellemzése.

Arabidopsis thaliana (Col-2 ökotípus) etil-metánszulfonát mutagenezisből származó M2 növényeket standard körülmények között (120 μmol⋅m −2 ⋅s -1, 20 ° C, 60% levegő páratartalom, 16 óra világos/8 óra sötét) termesztettünk talajon. ). A lipidek stresszel kapcsolatos szintézisének előidézése érdekében az egyes növényekről leválasztott leveleket egy éjszakán át inkubáltuk nedves szűrőpapíron 37 ° C-on. A szűréshez a stresszelt levelekből lipideket izoláltunk 1 M KCl/0,2 M H3PO4 és dietil-éter elegyével, szilikagéllemezeken vékonyréteg-kromatográfiával elválasztottuk hexán/dietil-éter/ecetsav (90: 10: 1, térfogat/térfogat) elegyével, és jóddal megfestettük.

A vte1 mutánt négyszer visszakereszteltük a WT Col-2-re a háttérmutációk számának csökkentése érdekében. Genotikus DNS-t izoláltunk a WT Landsberg erecta keresztezéséből származó F2 növényekből, és PCR marker feltérképezéshez használtuk (27, 28). A 4. kromoszómán található At4g32770 gént (BAC F4D11, GenBank csatlakozási szám) a vte1-ből származó PCR-rel amplifikáltuk PD202 (AAA GGA AGG ATT TGT TTT GTT TGC GAC TG) és PD203 (GGA CCG AAC GAA CTA AAA TCA TAC ATA oligonukleotidokkal). ) és szekvenálásra használják.

Északi elemzés, heterológ expresszió Escherichia coliban.

Az északi elemzéshez a teljes RNS-t izoláltuk a WT és a vte1 leveleiből standard protokollok alkalmazásával (29, 30). A blotot hibridizáltuk 32 P-jelölt At4g32770 próbával, amelyet PCR-amplifikációval nyertünk genomi Arabidopsis WT DNS-ből a PD202 és PD203 primerekkel.

A fehérje érett részét a látszólagos szignálpeptid nélkül (31) PCR-rel amplifikáltuk az első szálú cDNS-ből, PD224 (TAA TGG ATC CAC TCC GGA CTC CTC ACA GTG G) és PD225 (GCT CAA GCT TTT ACA) oligonukleotid primerek felhasználásával. GAC CCG GTG GCT TGA A). A PCR-fragmenst a pQE31 BamHI- és HindIII-helyeihez ligáltuk, majd E. coli M15 (pREP4) sejtekbe helyeztük a fehérje expressziója céljából (Qiagen, Hilden, Németország).

Enzimvizsgálat.

A tokoferol-cikláz aktivitást 2,3-dimetil-5-fitil-1,4-hidrokinonnal (DMPQ) vagy 2,3-dimetil-5-geranilgeranil-1,4-hidrokinonnal (DMGQ) mértük (32). Az ilyen szubsztrátokkal végzett tokoferol-cikláz reakció γ-tokoferol és γ-tokotrienol szintézisét eredményezte (32). A reakciótermékeket HPLC-vel (Waters 2690) elválasztottuk RP30 oszlopon (Bischoff Chromatography, Leonberg, Németország; 230 × 4,6 mm, 3,0 μm) izokratikus eluálással 100% metanolban, és fluoreszcenciával detektáltuk (gerjesztés 295 nm-nél; emisszió 332-nél). nm).

Tokoferol-analízis.

A GC/MS elemzéshez az Arabidopsis leveleket folyékony nitrogénben homogenizáltuk, és a lipideket 100 μl 1 M KCl/0,2 M H3PO4-gyel és 400 μl dietil-éterrel extraháltuk. A szerves fázist eltávolítottuk, és az oldószert nitrogéngázáramban lepároltuk. N-metil-N-trimetil-szilil-trifluor-acetamiddal végzett kémiai módosítás után a lipidek trimetil-szilil-származékait GC/MS-sel analizáltuk a leírás szerint (33). A tokoferolt fluoreszcens HPLC-vel határoztuk meg standardokkal (34).

Klorofill és klorofill fluoreszcencia mérése.

A klorofillt a levelekből 80% (térfogat/térfogat) acetonnal extraháltuk, és az abszorbanciák 646 és 663 nm-en történő mérésével számszerűsítettük (35). Az in vivo klorofill fluoreszcenciát impulzus-amplitúdó modulációs fluoriméterrel határoztuk meg (PAM-2000, Heinz Walz, Effeltrich, Németország). A kvantumhozamot (Fm ′ - Ft)/Fm ′ -ből számolták, ahol Ft és Fm ′ egy fényhez igazodó levél fluoreszcencia-kibocsátása mérőfény alatt vagy telítő fényimpulzus alkalmazása után (36).

Eredmények

A tokoferol-szintézisben mutáns hiány elkülönítése.

Genetikai megközelítést választottak a tokoferol szintézis útjának további boncolására. Különböző semleges lipideket (szabad zsírsavak, triacil-glicerinek, tokoferolok) tapasztaltak, hogy az oxidatív stressz során felhalmozódnak a magasabb növények leveleiben (11–13. Hivatkozás; 1. ábra). A tokoferol növekedése különösen szembetűnő volt, mivel a stressznek kitett levelekben ez a mennyiség ötszöröse volt a kontroll körülményekhez képest. Ezen eredmények alapján kidolgozták a tokoferol szintézisben érintett Arabidopsis mutánsok szűrési eljárását. Az egyes Arabidopsis növények leválasztott leveleit egy éjszakán át inkubáltuk 37 ° C-on, ami különböző stressztényezők (azaz hő, sebesülés) kombinációját eredményezte. Miután 2000 egyedi Arabidopsis M2 mutáns növényt vizsgáltunk a lipidösszetétel változásainak TLC-vel, tokoferolhiányos vonalat azonosítottunk. Ezt a vonalat előzetesen vte1-nek nevezték (E-vitamin hiány esetén).

Semleges lipidek felhalmozódása a levelek stressz állapotában. Az Arabidopsis WT növényeket különböző stressz körülményeknek tették ki (hő, 3 nap 37 ° C-on; hideg, 5 nap 4 ° C-on; szárazság, 3 nap öntözés nélkül; só, 0,5 M NaCl-val öntözés 3 napig). A lipideket kivontuk a levelekből, TLC-vel elválasztottuk és jóddal festettük.

A vte1 mutáns hiányzik a tokoferol mind a négy formájában, és a tokoferol-cikláz csökkent aktivitását tartalmazza.

A bioszintetikus blokk feloldásához a vte1 mutánsban lipideket izoláltunk a WT és a mutáns levelekből, és GC/MS-rel elemeztük őket trimetil-szililezés után (2A. Ábra). Ellentétben a WT-vel, amely főleg α-tokoferolt és kis mennyiségben tartalmazta a tokoferol másik három formáját (37), a vte1 mutáns teljesen nélkülözte a tokoferol mind a négy formáját. Azonban a vte1-ben 560,5 Da molekulatömegű vegyület halmozódott fel, amely WT-ben nem volt kimutatható (2A. Ábra). Ennek a vegyületnek a tömegspektruma összhangban van a DMPQ di (trimetil-szilil) -származékának fragmentációs mintázatával (2B. Ábra). Ez a megállapítás arra utal, hogy a vte1 mutáció befolyásolja a DMPQ-cikláz (tokoferol-cikláz) aktivitását, mert ez az enzim katalizálja a 2-metil-6-fitil-1,4-hidrokinon és a DMPQ átalakulását δ- és y-tokoferollá ( 2C. Ábra). Mivel a tokoferol e két formája a β- és α-tokoferol előfutára, a tokoferol-cikláz aktivitás csökkenése várhatóan a tokoferol mind a négy formájának elvesztését eredményezi.

A tokoferol mind a négy formája hiányzik a vte1 levelekből. (A) Arabidopsis WT és vte1 levelekből származó trimetilszililezett lipidek GC/MS kromatogramjai. Minden mintához (WT vagy vte1 mutáns) négy egyionos nyomkövetési nyomot mutatunk be (SIM; m/z = 560,0, 502,5, 488,5 és 474,5), amelyek egy GC/MS kromatogramból származnak. A jeleket ugyanarra a relatív skálára (100%) húzzák. (B) A vte1 levelekben felhalmozódó t = 46,4 perc retenciós idővel rendelkező vegyületet a DMPQ di (trimetil-szilil) -származékaként azonosítottuk annak fragmentációs mintázata alapján. (C) 2-metil-6-fitil-1,4-hidrokinon vagy DMPQ átalakítása tokoferol-ciklázzal δ-, illetve y-tokoferolt eredményez.

A tokoferol-cikláz enzimaktivitását WT és vte1 levélkivonatokban mértük (3. ábra A és B). Mivel a növényi kivonatokban a DMPQ vagy DMGQ alkalmazásával végzett enzimaktivitások nagyon hasonlónak bizonyultak (32. hivatkozás és az adatok nem kerültek bemutatásra), e szubsztrátumok közül csak egyet, a DMGQ-t használtak. Míg WT-ben nagy mennyiségű DMGQ alakult γ-tokotrienollá, a tokoferol-cikláz aktivitás nagyon alacsony volt a vte1-ben (407 ± 20 és 6,6 ± 0,7 ng γ-tokotrienol/mg fehérje/óra a WT és a vte1 esetében) ). A 2-metil-6-fitil-1,4-hidrokinon-metil-transzferáz aktivitása nagyon hasonló volt a vte1-ben (az adatokat nem mutatjuk be). Ezért a vte1 mutáció specifikusan befolyásolja a tokoferol-cikláz aktivitását, és nem okozza a tokoferol-bioszintézis enzimjeinek általános szabályozását.

A vte1 mutáns hiányos a tokoferol-cikláz aktivitásban. (A) A tokoferol-cikláz katalizálja a DMPQ és a 2,3-dimetil-5-geranilgeranil-1,4-hidrokinon (DMGQ) átalakulását y-tokoferollá és y-tokotrienollá. (B) WT és vte1 tokoferol-cikláz vizsgálata. A fehérjekivonatokat DMGQ-val inkubáltuk, és a reakciótermékeket HPLC-vel elválasztottuk és fluoreszcencia-emisszióval detektáltuk. A y-tokotrienol retenciós idejét standarddal igazoltuk. Pontozott vonal, WT; folytonos vonal, vte1.

A VTE1 gén izolálása.

A VTE1 gén izolálása. (A) A vte1 mutáció feltérképezése a 4. kromoszóma alsó karjára. A tetején lévő értékek két szomszédos marker közötti rekombinációk számát jelentik egy 384 kromoszóma leképező populációban. Az alul található számok a 4-es kromoszóma fizikai térképén való elhelyezkedést mutatják 10 6 bp-ban a MIPS adatbázis szerint (http://mips.gsf.de/proj/thal/). (B) Az At4g32770 gén exon/intron szerkezete. A vte1-ben ez a gén egy G-A pontmutációt hordoz a 3. intron 3'-os határán. (C) A WT és a vte1 teljes RNS-jének északi elemzése. (Felső) A hibridizációs jel az At4g32770-gyel. (Alsó) Az etídium-bromiddal festett 25S rRNS sávok.

Annak tesztelésére, hogy az At4g32770 expressziója megváltozott-e a vte1-ben, a Northern-elemzést a levelekből izolált RNS-sel végeztük. Körülbelül 1,6 kb méretű sáv hibridizálódott az At4g32770 szondával WT-ben, de a vte1-ben ebben a helyzetben nem volt kimutatható sáv (4C. Ábra). Ezért az At4g32770 vagy az mRNS stabilitás transzkripciója erősen csökkent a vte1-ben.

A VTE1 egy enzimet kódol tokoferol-cikláz és tokotrienol-cikláz aktivitással.

További bizonyítékként, hogy az Arabidopsis VTE1 fehérje tokoferol-cikláz aktivitású funkcionális enzimet kódol, a megfelelő cDNS-t heterológ módon expresszálták E. coliban, és enzimvizsgálatokhoz használták. A fehérje a kloroplaszt látszólagos N-terminális szignálszekvenciáját tartalmazza (31. hivatkozás; lásd alább). Ezért csak a fehérje érett részét, amelyből hiányzik az N-terminális 74aa, használták az E. coli expressziójához. Amint az az 5. ábrán látható, a VTE1 fehérje magas tokoferol-cikláz aktivitást mutatott a DMPQ és a DMGQ szubsztrátokkal szemben, ami y-tokoferol és y-tokotrienol szintézisét eredményezte. Ezek az eredmények egyértelmű bizonyítékot szolgáltatnak arra vonatkozóan, hogy a VTE1 tokoferol-ciklázt kódol, és hogy ez az enzim részt vesz mind a tokoferolok, mind a tokotrienolok szintézisében.

A VTE1 tokoferol-cikláz aktivitása heterológ expresszió után E. coliban. A VTE1 cDNS érett részét E. coliban expresszáltuk, és DMGQ-val vagy DMPQ-val használt tokoferol-cikláz aktivitási vizsgálatokhoz használtuk. A termékeket, a y-tokotrienolt és a y-tokoferolt, fluoreszcens HPLC-vel számszerűsítettük. Az értékek két független mérés és a standard hiba átlagát jelentik. Kontroll, üres vektorral transzformált E. coli (pQE31); VTE1, E. coli transzformálva VTE1-gyel a pQE31-ben. A kontroll sejtek tokoferol-cikláz aktivitása a két szubsztrát esetében 1 ng/mg fehérje/óra alatt volt.

A vte1 mutáns fenotípus oxidatív stressz alatt.

A vte1 növekedése, klorofilltartalma és fotoszintetikus kvantumhozama optimális körülmények között nagyon hasonló volt a WT1-hez. Hasonlóképpen, a Synechocystis homogenizálódott fitiltranszferáz mutánsának hiánya a tokoferol minden formájában növekedése vagy klorofill tartalma nem csökkent (38). A fotooxidatív stressz során azonban a klorofill tartalom és a kvantumhozam csökkent a vte1-ben a WT-hez képest. Ez az eredmény összhangban van a tokoferol feltételezett szerepével a tilakoidok fotoszintetikus komplexeinek oxidatív stressztől való megvédésében. A vte1 esetében megfigyelt stressz okozta változások azonban meglehetősen kicsiek voltak. Ezért más redoxirendszerek (pl. Aszkorbát, glutation, karotinoidok) részt vehetnek a reaktív oxigénfajták eltávolításában nagy fényviszonyok között.

A geranilgeranil-reduktáz aktivitás csökkenése a dohánynövények antiszensz expressziójával a tokoferol szintézis részleges csökkenését is eredményezte (44, 45). Az Arabidopsis vte1 mutánshoz hasonlóan, csak oxidatív stressz körülményei között, a transzgénikus dohányvonalak fotoszintézisét befolyásolta. Azonban ellentétben a vte1-vel, amelyet kizárólag a tokoferol szintézis befolyásol, a geranilgeranil-reduktáz antiszensz növényekben a klorofill bioszintézis is csökkent. Ezért nem volt világos, hogy a dohány antiszensz vonalakon megfigyelt fenotípusos változások tokoferol- vagy klorofillhiányból származnak-e. A vte1-hez hasonlóan az aszkorbát-szintézisben hiányos Arabidopsis-mutáns (soz1/vtc1) fokozott érzékenységet mutatott a környezeti stressz iránt (46). A két mutáns, a vte1 és a vtc1, megnyitja az utat az E-vitamin és a C-vitamin in vivo szerepének tanulmányozásához az oxidatív stressz során a magasabb növényekben.