Az 1-es típusú 5α-reduktáz hiány vagy gátlás előidézi az inzulinrezisztenciát, a máj steatózist és a májfibrózist rágcsálókban

Absztrakt

Bevezetés

A szteroid hormon szignálozás erőteljesen befolyásolja az üzemanyag-anyagcserét és a testzsír-eloszlást, és a megváltozott jelzés a metabolikus szindróma számos aspektusában szerepet játszik, beleértve a májzsír felhalmozódását alkoholmentes zsírmájbetegségben. A szteroid receptor aktiválódását nemcsak a keringő szteroidkoncentrációk modulálják, hanem a célszöveteken belüli prereceptor metabolizmus is. Például a receptor aktiválását az aromatáz (ösztrogénreceptoroknál) és az 1-es típusú 11β-hidroxi-szteroid-dehidrogenáz (glükokortikoid receptoroknál) erősíti fel. Ezek az enzimek a keringő koncentrációtól függetlenül megváltoztatják az intracelluláris szteroid koncentrációt, ezáltal befolyásolják az anyagcsere-fiziológiát és a betegséget (1–3), és terápiás célpontokat biztosítottak mellrákos, illetve 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő betegeknél.

Az 5a-reduktáz (5αR) izozimjai szintén szabályozzák a sejtek szteroid szintjét (4,5). Az 5αR 2-es típus (5αR2) nagymértékben expresszálódik a prosztatában, ahol a tesztoszteront hatékonyabb androgén-5a-dihidrotesztoszteronná alakítva felerősíti az androgén hatást, és a finaszterid gátolja a prosztata betegség kezelésében. Az 5αR 1-es típus (5αR1) expresszálódik az emberi hím reproduktív traktusban, de nagy mértékben a májban is (5), alacsonyabb szinten pedig a zsírszövetben (6,7) és a vázizomban (8), ahol a különféle terhét metabolizálja. szteroidok, beleértve az androgéneket és a glükokortikoidokat (9); és gátolja az 5aR-ek nem szelektív inhibitora, a dutaszterid (10). Az 5α-redukció jelentősen hozzájárul a glükokortikoidok: a kortikoszteron rágcsálókban és a kortizol clearance-éhez az embereknél. Az 5αR1-hiányos egerek nyolcszor lassabban tisztítják a kortikoszteront (11), és az emberekben az 5a-redukált glükokortikoidok a vizeletből származó kortizol-metabolitok körülbelül egyharmadát és felét tartalmazzák (12).

Az 5α-redukált szteroidok fokozott kiválasztódását figyelték meg elhízás, policisztás petefészek-szindróma és alkoholmentes zsírmájbetegségek (12–17) esetén, míg kritikus betegség esetén csökkent kiválasztódás következett be (18). Úgy gondolják, hogy a kortizol-clearance arányában bekövetkező változások ezekben a körülmények között befolyásolják a hipotalamusz-hipofízis-mellékvese tengelyt. Korábban kimutattuk, hogy az 5αR1-hiányos egerek felhalmozzák a glükokortikoid feleslegét a májban és a zsírban (11), amelynek közvetlen következményei lehetnek a glükokortikoid receptor aktiválódására. Egy nemrégiben készült jelentés (19) azt mutatja, hogy az 5αR1 hiányában szenvedő egerek hajlamosabbak a máj steatosisára, de a testzsír-eloszlásban vagy az inzulinérzékenységben nincsenek nyilvánvaló különbségek, és a hepatocelluláris carcinoma ellen védettek; a mechanizmusok továbbra sem tisztázottak, különösen a glükokortikoidok és az androgének metabolizmusának független szerepe. Fontos azonban tisztázni őket, mivel az a megállapítás, hogy az 5αR1 hiánya hátrányosan befolyásolja az anyagcserét, az emberi egészségre vezet. Nemrégiben bebizonyítottuk, hogy az 5αR1 és az 5αR2 kettős farmakológiai gátlása (de önmagában az 5αR2 nem) hátrányosan befolyásolja az anyagcserét, fokozott adipozitást és inzulinrezisztenciát okozva (20).

Feltételezzük, hogy az 5αR hiánya vagy gátlása a májban a glükokortikoidok helyi felhalmozódásához, fokozott glükokortikoid receptor aktiválódáshoz és ennek következtében inzulinrezisztenciához, máj steatosishoz és az alkoholmentes zsírmáj betegségre való hajlamhoz vezet. Egerekben és patkányokban csak az 5αR1 expresszálódik a májban, ellentétben az emberekkel, akikben az 5αR mindkét izozimje expresszálódik (4). Patkányokban a finaszterid mind az 5αR1, mind az 5αR2 nem szelektív inhibitora (21). Ezért hipotézisünket teszteltük egerek felhasználásával, az 5αR1 célzott deléciójával (22,23), és patkányokban finaszteriddel végzett farmakológiai gátlás után.

Kutatási tervezés és módszerek

A vegyszereket Sigma (Poole, Egyesült Királyság) gyártotta, hacsak másképp nem jelezzük. Az oldószerek üvegdesztillált, nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás minőségűek (Fisher Scientific, Loughborough, Egyesült Királyság). A szteroidok szteroidokból származnak (Newport, RI).

Az embriókat (C57BL6/SvEv/129) az 5αR1 (22,23) célzott megszakításával (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) újravezetettük, és heterozigóta utódokat kereszteztünk, hogy homozigóta hím „vad típusú” (WT) és knockout ”(KO) egerek (5αR1-KO egerek). A hím elhízott Zucker patkányok és sovány kontrolljaik Harlan Olac-tól (Bicester, Egyesült Királyság) származnak. Az állatokat az Egyesült Királyság belügyminisztériuma engedélyével, ivóvízhez és szokásos chow-hoz (7,4% zsír, 4% szacharóz; RM1; Special Diet Services, Witham, Egyesült Királyság) vagy kísérleti étrendhez való hozzáféréssel vizsgálták. Az állatokat lefejezéssel megölték (0800–1100 óra); törzsvért gyűjtöttek; és a szöveteket boncoltuk, nedvesen lemértük, vagy fagyasztva vagy formalinban rögzítve.

Metabolikus funkciók vizsgálata 5αR1-hiányos egerekben

A súlygyarapodást hím WT és 5αR1-KO egereken tartottuk, melyeket chow-n tartottunk. Az intraperitoneális glükóz (2 mg/g) tolerancia teszteket (GTT) 6 órás böjt után végeztük farokvégi vérzéssel (0, 15, 30, 60 és 90 percnél).

Válaszok a magas zsírtartalmú etetésre

A magas zsírtartalmú etetéshez a ~ 5 hónapos hím WT és 5αR1-KO egereket egyedileg helyezték el (n = 7–9/csoport), szabad hozzáféréssel vagy nyugati stílusú, magas zsírtartalmú, magas szacharóz tartalmú étrendhez (58% kcal zsír, 13% kcal szacharóz) vagy kontroll étrend (10,5% kcal zsír, 0% kcal szacharóz; Research Diets Inc., New Brunswick, NJ). A testtömeg és az élelmiszer-fogyasztás hetente került rögzítésre. A GTT-ket 1, 3 és 6 hónapos táplálkozás után végeztük diétával, a fentiek szerint. Az egereket 1 hétig hagyták felépülni, mielőtt leölték őket.

Májkárosodás iránti hajlam

A WT és az 5αR1-KO hím egereket (∼5 m) intraperitoneális injekcióval kezeltük 0,3 μl/g szén-tetrakloriddal (CCl4) olívaolajban (n = 8/csoport) vagy hordozóval (n = 4/csoport) hetente kétszer 6 hét (24). A testtömeget hetente regisztráltuk, és az egereket 48 órával az utolsó CCl4 injekció után leöltük.

Az 5αR farmakológiai gátlásának metabolikus hatásai

A Zucker patkányokat (n = 10–15/csoport, 6 hetes korban) 5αR inhibitor finaszteriddel (0,35 mg/kg/nap) vagy vivőanyaggal (5% etanol; 1 ml/kg/nap) kezeltük napi szoptatással. A finaszterid patkányokban gátolja az 5aR mindkét izozimjét (21,25). 2 hét elteltével az orális GTT eredményeit 0, 30 és 120 perccel értékeltük a glükóz bolus beadása után (26). További hét kezelés után a patkányokat leöltük. A májat pillanatszerűen lefagyasztották és feldolgozták a transzkriptum elemzéséhez. A kísérletet megismételtük elhízott patkányok második csoportjában, akiket kétoldalú gonadectomián vagy álműtéten estek át (6) 4 héttel a finaszterid vagy a vivőanyag kezelés megkezdése előtt.

Laboratóriumi elemzések

Plazma biokémia

A kortikoszteront radioimmunassay-vizsgálattal (27), az inzulint ELISA-val (Crystal Chem, Downers Grove, IL), a glükózt hexokináz módszerrel (Thermo Electron, Melbourne, Victoria, Ausztrália), adipokineket és apolipoproteineket (apos) Lincoplex immunvizsgálatokkal (Dundee, UK), valamint trigliceridek és koleszterin (MICROgenics, Passau, Németország) és nem észterezett zsírsavak (NEFA) (Zen-Bio) spektrofotometriásan. A tesztoszteront és a finaszteridet a korábban leírt módon (1 ml) patkány plazmában (1 ml) számszerűsítettük, de Oasis HLB patronok (60 cm 3; Waters, Elstree, Egyesült Királyság) alkalmazásával nagyobb térfogatra (1 ml) adaptáltuk.

Szövetbiokémia

A trigliceridek méréséhez 50–100 mg májat mechanikusan homogenizáltak propán-2-olban (20 térfogat zsíros étrendben lévő egereknél; 10 térfogat normál zsírtartalmú étrendben lévő egereknél és patkányoknál), majd spektrofotometriásan vizsgálták (28).

Az mRNS-ek mennyiségi meghatározása valós idejű kvantitatív PCR-rel

A teljes RNS-t a Qiagen RNeasy rendszerrel extraháltuk, és 500 ng-t reverz átírással cDNS-be random véletlenszerű primerekkel, a QuantiTect DNase/reverz transzkripciós készlet segítségével. A cDNS-t (1 ng teljes RNS-nek felel meg) három példányban inkubáltuk génspecifikus primerekkel és fluoreszcens próbákkal (1. kiegészítő táblázat) (Universal Probe Library, Roche Diagnostics, Burges Hill, Egyesült Királyság; vagy Applied Biosystems, Warrington, Egyesült Királyság) 1 × Roche LightCycler 480 szondák mastermix. A kvantitatív PCR-t Roche LightCycler 480 alkalmazásával hajtottuk végre. Minden primer próbakészlethez standard görbét állítottunk össze, az összes mintából összegyűjtött cDNS soros hígításával. Az eredményeket korrigáltuk a referenciagének bőségének számtani átlagával (nagy zsírtartalmú kísérletnél: Ppia, Rn18s és Tbp; CCl4 kísérletnél: Actb és Ppia; patkánykísérletnél: Ppia és Rn18S), amelyek nem különböztek csoportonként.

A májfibrózis mennyiségi meghatározása

A rögzített májokat metszettük (5 µm), és hematoxilin-eozinnal vagy picrosirius vörösrel festettük. A metszeteket fénymikroszkóppal (× 10 nagyítás; Axio Scope mikroszkóp; Zeiss) vizsgáltuk és CoolSNAP kamerával (Photometrics) fényképeztük. A Picrosirius vörös foltot úgy számszerűsítettük, hogy az Adobe Photoshop 5.0 verziójú szoftverrel megszámoltuk a vörös pixelek számát minden szakaszból 20 véletlenszerűen kiválasztott látómezőben. Az adatokat a látómezőnkénti vörös pixelek átlagos számaként adjuk meg, amely reprezentálja a festett kollagén mennyiségét.

Az 5αR1 és 5αR2 transzkript profilja a metabolikus szövetekben

Az 5αR1 és 5αR2 mRNS expresszióját a májban értékeltük; szubkután zsírszövet és vázizom WT egerekből és patkányokból; és a patkányok prosztata mint pozitív kontroll az 5αR2-hez. A cDNS-t (10 ng; a fent leírtak szerint készítettük) Qiagen HotStarTaq Plus rendszerrel (Qiagen, Crawley, Egyesült Királyság) PCR-nek vetettük alá, és a termékeket 1,2% -os agarózgélen, 0,5x Tris-borate-EDTA pufferben elektroforézist végeztük. Láncindítók az egér 5αR1 tttgctcttcctttgggcta és ctgccatcaattccttggat, valamint 5αR2 aacacagcgagagtgtgtcg és cgcgcaataaaccaggtaat; és patkány 5αR1 tttgctcttcctttgggcta és ccaaacagggtctccctaca, valamint 5αR2 gttgccttcctttgtggtgt és tgattcccatccccagaata.

Statisztikai analízis

Az 5αR1 és 5αR2 transzkriptumprofilja egerek és patkányok metabolikus szövetében. V: Egerekben az 5αR1-et (240 BP) detektálták a májban, a vázizomban és a zsírszövetben, míg az 5αR2 (299 BP) csak a májban és a zsírszövetben volt kimutatható. B: Patkányban 5αR1-t (181 BP) detektáltak a májban, a vázizomban és a zsírszövetben, míg az 5αR2 (308 BP) csak a prosztata pozitív kontrolljában volt kimutatható. A és B: 1., 5. és 9. sáv, 100 BP létra; 2. sáv, máj 5aR1; 3. sáv, máj 5aR2; 4. sáv, májnegatív kontroll; 6. sáv, izom 5αR1; 7. sáv, izom 5αR2; 8. sáv, izomnegatív kontroll; 10. sáv, 5aR1 zsír; 11. sáv, 5aR2 zsír; 12. sáv, zsírnegatív kontroll. B: 13. sáv, prosztata 5αR2; 14. sáv, prosztata negatív kontroll.

Az 5αR1 hiány növeli az anyagcsere-diszfunkció iránti hajlamot a magas zsírtartalmú etetésnél

A normál chow-t fogyasztó 5αR1-KO egerek súlya nem különbözött egymástól, és csak kis mértékben különböztek metabolikus fenotípusukban a WT egerektől 5 hónapos kor előtt (2. kiegészítő táblázat). A glükóz intoleranciát 3 hónapos korban észlelték, a GTT alatt pedig a hyperinsulinemia tendenciáját 5 hónaposan detektálták, de a testzsírban nem volt különbség.

A magas zsírtartalmú étrend fogyasztása közben azonban az 5αR1-KO egerek fokozottan fogékonyak voltak a súlygyarapodásra (2A. Ábra és 1. kiegészítő ábra), hiperinsulinémiára (koplalás és GTT alatt; 1. táblázat, valamint 2D és E ábra), éhomi hiperglikémiára. (1. táblázat és 2C. Ábra), az inzulin és a glükóz arányának növekedése (2G. Ábra) és a májzsír felhalmozódása (3C. Ábra). A túlsúly növekedést több szerv, köztük a máj és a zsírraktárak között osztották el (1. táblázat). A magas zsírtartalmú táplálás során a plazma lipid- és adipokin-profiljának változásai csak kis mértékben különböztek a WT-egerekétől (1. táblázat). A lipolízis szuppressziója (NEFA-szuppresszióval mérve a GTT első 15 percében) fokozódott az 5αR1-KO egerekben (2H ábra).

Az 5αR1-KO egerek metabolizmusának indexei a WT kontrollokkal szemben

Májfibrózis CCl4 sérülés után 5αR1-KO és WT egerekben. A picrosirius vörösrel festett májszakaszok (5 µm) reprezentatív képei a kollagén lerakódását mutatják. A kollagént nem detektálják a WT egerekben (A) és a KO egerekben (B), amelyek vivőanyag-injekciókat kapnak. Az 5αR1-hiányos egereknél nagyobb a kollagén indukció a CCl4 beadása után, beleértve a hídfibrózis (KO) (D) bizonyítékát, összehasonlítva a WT kontrollokkal (C).

Az 5αR-ek farmakológiai gátlása patkányokban utánozza az egerekben az 5αR1-hiány fenotípusát

Az 5αR kettős gátlásának hatása az elhízott Zucker patkányok metabolikus rendellenességeire. A finaszterid (Fin) a 3 hetes kezelési periódusban tapasztalt súlygyarapodást (A) és a friss szövetben mért májtömeget (B) nem változtatta meg a vivőanyag (Veh) kezeléssel összehasonlítva. A glükóz (C) és az inzulin (E) AUC-értéke az orális GTT 90 perces időtartama alatt megnőtt a finaszterid-kezelés után. A glükóz 30 és 90 percnél (D), az inzulin 30 percnél (F) magasabb volt a glükóz beadása után elhízott, finaszteriddel (szaggatott vonal) kezelt patkányokban, összehasonlítva a hordozóval (folytonos vonal). A plazma triglicerid szinteket (G) nem befolyásolta, és a máj triglicerid szintjét (H) növelte a finaszterid. Az mRNS bősége a májban, kvantitatív valós idejű PCR-rel mérve és korrigálva a referenciagének (Rn18s és Ppia) bőségének átlagával (I). A szürke oszlopok a kontroll elhízott patkányok, a csíkos oszlopok pedig elhízott patkányok, akik finaszterid kezelést kaptak. Az adatok az átlag ± SEM, összehasonlítva a Student t teszttel. * P Tekintse meg ezt a táblázatot:

Soron belüli megtekintése
Felugró ablak megtekintése

Az 5αR-ek farmakológiai gátlásának metabolikus következményei

Vita

Ezek az adatok azt mutatják, hogy az 5αR1 enzim befolyásolja az anyagcsere betegségre való hajlamot, nemcsak a máj steatosisra való hajlamot, hanem a testzsír eloszlását és az inzulinérzékenységet is. Ezenkívül a fokozott érzékenység a steatosisra fokozott érzékenységgel járt a fibrotikus májkárosodás iránt, ami arra utal, hogy az 5αR hiány vagy gátlás összefüggésbe hozható a nem alkoholos zsírmáj betegség gyorsabb előrehaladásával. Hasonló megfigyelések patkányokban az 5αR-ek farmakológiai gátlásával hangsúlyozzák e megfigyelések potenciális fontosságát az 5αR inhibitorokkal kezelt férfiaknál (20).

Fontos, hogy a patkányok steatosisának kialakulását minden finaszteriddel kezelt állatban kimutatták, és úgy tűnt, hogy független az androgénszintézistől, fennmaradt a kasztrált hím patkányokban. Mások nemrégiben arról számoltak be, hogy az 5αR1-KO egerek hajlamosabbak a hepatocelluláris karcinómára az amerikai életmód indukált elhízási szindróma (ALIOS) diétán végzett hosszan tartó táplálás (12 hónap) után (19), és hogy az 5αR1-KO egerek máj transzkriptumának változásai átfedik egymást az androgének helyett a glükokortikoidok beadása által kiváltottakkal (19). Tekintettel arra, hogy kimutattuk a kortikoszteron máj metabolikus clearance-ének károsodását az 5αR1-KO egerekben (11) és a finaszterid hatásának tartós fennmaradását GDX patkányokban, arra a következtetésre jutunk, hogy a helyi glükokortikoid-felesleg a legvalószínűbb mechanizmus, amely alátámasztja a máj steatosisát az 5αR1 hiányában vagy gátlásában; az androgén és/vagy a glükokortikoid jelátvitel kombinált változásai hozzájárulhatnak a káros metabolikus fenotípus egyéb aspektusaihoz.

Egy nemrégiben publikált tanulmány (19) hasonló érzékenységet dokumentált a máj steatosisra az 5αR1-KO egerekben, akiket ALIOS-diétával tápláltak, de nem mutattak változásokat a testzsír-eloszlásban vagy az inzulinérzékenységben, és nem mutattak különbséget a májfibrózisban. Valószínű, hogy kísérleteink nagyobb metabolikus kihívást váltottak ki, magasabb zsírtartalommal az étrendben, és nagyobb mértékű májkárosodást váltottak ki a CCl4. Az előző vizsgálat azonban csak a GTT során végzett glükózmérésekről számolt be, és nem talált különbséget a genotípusok között az éhomi glükózszintben vagy az AUC-ban. Itt szintén normális glükózszintet mutatunk, de azt mutatjuk be, hogy az inzulin válasz a glükóz kihívásra fokozódik, ami összhangban áll az inzulin rezisztenciával. Érdekes módon az előző tanulmány kimutatta, hogy a steatosis ellenére az 5IR1-KO egerek az ALIOS-diétán védettek voltak a hepatocelluláris carcinoma ellen, amely egy további downstream patológia, bár a carcinoma az itt vizsgált csoportok egyikében sem volt nyilvánvaló.

Cikk információk

Köszönetnyilvánítás. A szerzők köszönetet mondanak Dr. Mala Mahendroo-nak (Texas Egyetem Délnyugati Orvosi Központja, Dallas, TX) támogatásáért. A szerzők emellett köszönetet mondanak a Wellcome Trust és a British Heart Foundation pénzügyi támogatásáért; Carolynn Cairns, Scott Denham, Karen French, Jill Harrison, Sanjay Kothiya és Rachel McDonnell (Edinburgh-i Egyetem) a kiváló technikai támogatásért; az Edinburgh-i Egyetem Genetikai Szűrési és Intervenciós Technológiájának munkatársai a rederivációs szolgáltatások terén; az Edinburgh-i Egyetem szövettani megosztott egyetemi kutatóintézete a szövettani szolgáltatásokhoz; és a Wellcome Trust Clinical Research Facility Tömegspektrometriai törzslaboratórium (Edinburgh-i Egyetem) elemzési támogatáshoz.

Finanszírozás. Ezt a kutatást a Wellcome Trust támogatta. //Dx.doi.org/10.13039/100004440 072217/Z/03/Z támogatás és a British Heart Foundation. //Dx.doi.org/10.13039/501100000274 FS/08/063 és FS/08/065.

Érdeklődési kettősség. A cikk szempontjából lényeges összeférhetetlenségről nem számoltak be.